Name: robust generation of hepatocyte-like cells from human embryonic stem cell populations
Uploaded: 2011-10-26T12:00:00
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熹博士是由一个英国研究理事会奖学金的支持，西医生是外科部的支持，博士Medine的BHF核心基金的拨款支持，巴尔塔萨Lucendo - Villarin先生是由MRC博士Studenship的支持。周医生是由中国政府奖学金的支持。

1。所有化工股的前期准备工作和文化的塑料制品的涂层在一个组织文化罩在无菌条件下进行的所有步骤。 <ol><li>制备碱性成纤维细胞生长因子（hbFGF） <ol><li>准备10％BSA在PBS和过滤解决方案，通过一个0.22微米的过滤器。 </li><li>准备从10％BSA溶液0.2％的BSA溶液。 </li><li>加入10毫升0.2％BSA solution/100微克hbFGF。 </li><li> 5 mL 10％的BSA溶液通过过滤器过滤，预湿用0.22微米的过滤器。丢?...

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	<li>Asgari, S., Pournasr, B., Salekdeh, G. H., Ghodsizadeh, A., Ott, M., Baharvand, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells:+a+new+era+for+hepatology.">Induced pluripotent stem cells: a new era for hepatology.</a> J. Hepatol. 53, 738-751 (2010).</li><li>Hay, D. C., Pernagallo, S., Diaz-Mochon, J. J., Medine, C. N., Greenhough, S., Hannoun, Z., Schrader, J., Black, J. R., Fletcher, J., Dalgetty, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbiased+Screening+of+Polymer+Libraries+to+Define+Novel+Substrates+for+Functional+Hepatocytes+with+Inducible+Drug+Metabolism.">Unbiased Screening of Polymer Libraries to Define Novel Substrates for Functional Hepatocytes with Inducible Drug Metabolism.</a> Stem Cell Research. 6, 92-101 (2011).</li><li>Payne, C. M., Samuel, K., Pryde, A., King, J., Brownstein, D., Schrader, J., Medine, C. N., Forbes, S. J., Iredale, J. P., Newsome, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistence+of+Functional+Hepatocyte+Like+Cells+in+Immune+Compromised+Mice.">Persistence of Functional Hepatocyte Like Cells in Immune Compromised Mice.</a> Liver International. 31, 254-262 (2011).</li><li>Greenhough, S., Medine, C., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+Stem+Cell+Derived+Hepatocyte+Like+Cells+and+their+Potential+in+Toxicity+Screening.">Pluripotent Stem Cell Derived Hepatocyte Like Cells and their Potential in Toxicity Screening.</a> Toxicology. 278, 250-255 (2010).</li><li>Medine, C. N., Greenhough, S., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Stem+Cell+Derived+Hepatic+Endoderm+in+Human+Drug+Discovery.">The Role of Stem Cell Derived Hepatic Endoderm in Human Drug Discovery.</a> Biochemical Society Transactions. 38, 1033-1036 (2010).</li><li>Hannoun, Z., Fletcher, J., Greenhough, S., Medine, C. N., Samuel, K., Sharma, R., Pryde, A., Black, J. R., Ross, J. A., Wilmut, I., Iredale, J. P., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Comparison+between+Conditioned+Media+and+Serum+Free+Media+in+Human+Embryonic+Stem+Cell+Culture+and+Differentiation.">The Comparison between Conditioned Media and Serum Free Media in Human Embryonic Stem Cell Culture and Differentiation.</a> Cellular Reprogramming. 12, 133-140 (2010).</li><li>Dalgetty, D. M., Medine, C., Iredale, J. P., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+and+Future+Challenges+in+Stem+Cell-Derived+Liver+Technologies.">Progress and Future Challenges in Stem Cell-Derived Liver Technologies.</a> American Journal of Physiology - Gastrointestinal and Liver Physiology. 297, 241-248 (2009).</li><li>Hay, D. C., Fletcher, J., Payne, C., Terrace, J. D., Gallagher, R. C. J., Snoeys, J., Black, J., Wojtacha, D., Samuel, K., Hannoun, Z., Pryde, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Efficient+Differentiation+of+hESCs+to+Functional+Hepatic+Endoderm+Requires+ActivinA+and+Wnt3a+Signalling.">Highly Efficient Differentiation of hESCs to Functional Hepatic Endoderm Requires ActivinA and Wnt3a Signalling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 12301-12306 (2008).</li><li>Fletcher, J., Cui, W., Samuels, K., Black, J. R., Currie, I. S., Terrace, J. D., Payne, C., Filippi, C., Newsome, P., Forbes, S. J., Ross, J. A., Iredale, J. P., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Inhibitory+Role+of+Stromal+Cell+Mesenchyme+on+Human+Embryonic+Stem+Cell+Hepatocyte+Differentiation+is+Overcome+by+Wnt3a+Treatment.">The Inhibitory Role of Stromal Cell Mesenchyme on Human Embryonic Stem Cell Hepatocyte Differentiation is Overcome by Wnt3a Treatment.</a> Cloning and Stem Cells. 10, 331-340 (2008).</li></ol>

我们已经开发出一种简单，同质化和高度在体外重现的模型生成可扩展人类HLCs水平。我们的模式已经被验证由外部的合作实验室。我们经常干细胞HLCs使用我们在内部发展的标志和具体肝功能试验（其中大部分是市售）工具盒的特点。在我们的进程的关键阶段是：维持干细胞多能性;直接明确的内胚层干细胞分化能力;肝胚层的同质文化的规范，并能够推导出成熟的肝胚层参展在体外的...

基质胶涂层板和烧瓶<ol><li>基质胶（10毫升，BD公司，英国）;储存在-20 ° C </li><li> KO - DMEM（500毫升，GIBCO，Invitrogen公司，英国）;储存于4 ° C。 </li><li>组织培养板（6孔，12孔，康宁，英国） </li><li>组织培养瓶（25 cm2的通风，康宁，英国） </li></ol>人类胚胎干细胞维护<ol><li>小鼠胚胎成纤维细胞条件培养基（MEF - CM）（100毫升，R＆D系统，美国）;保存在-20 ° C。 </li><li> BSA溶液（50毫升，西格玛Aldrich公司，英国）;储存于4 ° C。 </li><li>人碱性成纤维细胞生长因子（100微克，Peprotech，美国）;储存在-20 ° C。 </li></ol>与胶原酶传代的胚胎干细胞<ol><li>聚合以及烧瓶中的人类胚胎干细胞。 </li><li>基质胶涂井或烧瓶适当。 </li><li> Phospate缓冲液（2氯化镁，氯化钙2）（500毫升，GIBCO，Invitrogen公司，英国）;储存在室温下。 </li><li>胶原酶（1克，GIBCO，Invitrogen，英国）;储存在4 ° C </li><li>小鼠胚胎成纤维细胞条件培养基（MEF - CM），美国（100毫升，R＆D系统）。 </li><li>人碱性成纤维细胞生长因子（100微克，Peprotech，美国）。 </li></ol>人类胚胎干细胞分化为肝胚层<ol><li> RPMI 1640培养液（500毫升，GIBCO，Invitrogen公司，英国）;储存在4 ° C </li><li> B27的补充（10毫升，GIBCO，Invitrogen公司，英国）;保存在-20 ° C。 </li><li>激活素A（2微克，Peprotech，美国）;于-20℃储存° C。 </li><li>重组小鼠Wnt3a（2微克，R＆D系统，美国）;存储在-20 ° C。 </li><li> KO - DMEM（500毫升，GIBCO，Invitrogen公司，英国）;储存于4 ° C。 </li><li> KO - SR（500毫升，GIBCO，Invitrogen公司，英国）;储存在-20 ° C </li><li>非必需氨基酸（100毫升，GIBCO，Invitrogen公司，英国）;储存于4 ° C。 </li><li> β-巯基乙醇（10毫升，GIBCO，Invitrogen公司，英国）;储存在4 ° C </li><li> DMSO（Sigma公司Aldrich公司，英国）;储存在室温下</li><li>莱博维茨的L - 15培养液（500毫升，SIGM一个Aldrich公司，英国）;储存于4 ° C。 </li><li> Tryptose磷酸盐肉汤（100毫升），西格玛Aldrich公司，英国，储存于4 ° C。 </li><li>胎儿牛血清，热灭活（500毫升，GIBCO，Invitrogen公司，英国）;储存在-20 ° C </li><li>氢化可的松21 -琥珀酸单酯（100毫克，西格玛Aldrich公司，英国）;储存在-20 ° C。 </li><li>胰岛素（牛胰）（100毫克，西格玛Aldrich公司，英国），保存在-20 ° C。 </li><li> L -谷氨酰胺（100毫升，GIBCO，Invitrogen公司，英国）;储存在-20 ° C </li><li>抗坏血酸（25克，适马Aldrich公司，英国），保存在-20 ° C。 </li><li>人类肝细胞生长因子（10微克，Peprotech，美国）;储存在-20 ° C。 </li><li>重组人抑瘤素M（OSM）（50微克，R＆D系统，美国）;于-20℃储存° C。 </li><li>注射器驱动过滤装置0.22微米（Millipore公司，英国） </li></ol>表征的人类胚胎干细胞源性肝胚层免疫染色<ol><li>磷酸缓冲液（- 2氯化镁，氯化钙2）（500毫升，GIBCO，Invitrogen公司，英国）; STO再在室温下。 </li><li> PBST，PBS 0.1％吐温20（Sigma - Aldrich公司，英国）。 </li><li>多聚甲醛（PFA）（Sigma - Aldrich公司，英国）是由PBS中，存储-20 ° C。 </li><li>甘油（Sigma - Aldrich公司，英国），在室温下储存。 </li><li> Tris碱（Sigma - Aldrich公司，英国），在室温下储存。 </li><li>乙醇</li><li>血清（ABD Serotech，英国），储存在-20 ° C </li><li>二抗，Alexa的荧光团（分子探针，Invitrogen公司，英国）。 </li><li> MOWIOL 4-88（Polysciences公司，美国）在Tris HCL和甘油为每制造商的指示。 DAPI（皮尔斯，赛默飞世尔科技，英国）是在1:1000稀释MOWIOL解决方案。 </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2">一抗</td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗原* </td><td>类型</td><td>供应商</td><td>稀释</td></tr><tr><td>白蛋白</td><td>鼠单克隆</td><td>西格玛爱秩序</td><td> 1 / 500 </td></tr><tr><td> E - cadherin的</td><td>鼠单克隆</td><td> Millipore公司</td><td> 1 / 100 </td></tr><tr><td>甲胎蛋白</td><td>鼠单克隆</td><td>西格玛</td><td> 1 / 500 </td></tr><tr><td> SSEA - 4 FITC </td><td>鼠单克隆</td><td> Biolegend </td><td> 1 / 100 </td></tr><tr><td> IgG抗体</td><td>鼠单克隆</td><td> DAKO公司</td><td> 1 / 500 </td></tr><tr><td colspan="2">二抗</td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗鼠FITC标记的共轭</td><td>山羊单克隆</td><td> Invitrogen公司</td><td> 1 / 400 </td></tr></tbody></table> 表2使用人类胚胎干细胞源性肝胚层免疫抗体，使用浓度，和公司开发的物种，他们购买。 肝胚层和正常化的功能分析（每毫克蛋白） <ol><li> P4 - GLO CYP3A4，CYP1A2，工具箱和光度计（美国Promega公司，）。 </li><li value="1">白色平底96孔检测板（BD公司，英国）。 </li><li> BCA检测试剂盒（皮尔斯，赛默飞世尔科技，英国）。 </li><li>透明96孔检测板（磐，英国） </li></ol>

robust generation of hepatocyte-like cells from human embryonic stem cell populations

尽管在模拟人类药物的毒性取得了进展，许多化合物在由于预见的副作用临床试验失败。临床研究的成本是巨大的，因此它是至关重要的，更预测毒理学屏幕在药物开发（Greenhough等2010）早期开发和部署。人肝细胞的代表，目前黄金标准模型评价药物毒性，而且是一种有限的资源，表现出变量的函数。因此，使用永生细胞株和动物组织模型是经常雇由于其丰富度。虽然这两个来源的信息，他们是有限的功能较差，物种变异和/或文化的不稳定（Dalgetty等2009）。多能干细胞（PSCS）是一个有吸引力的替代来源的人类肝细胞样细胞（HLCs）（Medine等2010）。物业服务公司的自我更新和分化，在成人中发现所有的体细胞类型的能力，从而代表分化细胞的一个潜在的不竭源泉。我们已经开发出一种程序，是简单，高效，适合自动化和产量人类功能HLCs（Hay等人2008;弗莱彻等人2008; Hannoun等2010;佩恩等人2011年和干草等2011）。我们相信我们的技术会导致可扩展性生产的药物研发，疾病模型，额外的有形的设备建设和可能基于细胞移植治疗HLCs。

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Robust Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Embryonic Stem Cell Populations

本文将着重从人类胚胎干细胞群的人肝胚层代。

肝细胞样细胞从人类胚胎干细胞群的鲁棒代

Despite progress in modelling human drug toxicity, many compounds fail during clinical trials due to unpredicted side effects. The cost of clinical ...

Research

JoVE Journal

Biology

Propagation of Human Embryonic Stem (ES) Cells

Propagation of Human Embryonic Stem ES Cells

人类胚胎干细胞（ES细胞）的繁殖

科研

生物学

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

从小鼠胚胎干细胞的造血干细胞的推导

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

人类胚胎干细胞的推导Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

从人类胚胎干细胞的染色质免疫沉淀

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are ...

Generation of Human CD40-activated B cells

人CD40激活的B细胞的生成

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

胚胎干细胞分化成少突胶质前体

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation

人类胚胎干细胞畸胎瘤形成命运的映射

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three ...

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

高效的推导人类心脏的前体和从多能干的小分子诱导人类胚胎干细胞的心肌细胞

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Rapid Fibroblast Removal from High Density Human Embryonic Stem Cell Cultures

快速高密度的人类胚胎干细胞培养成纤维细胞去除

Mouse embryonic fibroblasts (MEFs) were used to establish human embryonic stem cells (hESCs) cultures after blastocyst isolation1. This feeder system ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

诱导多能干细胞来源于小鼠的生成

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...