Name: robust generation of hepatocyte-like cells from human embryonic stem cell populations
Uploaded: 2011-10-26T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Robust Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Embryonic Stem Cell Populations at JoVE.com

Dr. Hay blev støttet af et RCUK Fellowship, var Dr. West støttet af Department of Surgery, var Dr. Medine støttet af en bevilling fra BHF Core fonden, var Mr. Baltasar Lucendo-Villarin støttet af en MRC ph.d. Studenship. Dr. Zhou blev støttet af et legat fra den kinesiske regering.

1. Indledende forberedelse af alle kemiske lagre og belægning af kultur plastvarer Alle skridt, der skal gennemføres i en vævskultur hætte under aseptiske forhold. <ol><li> Udarbejdelse af menneskelige grundlæggende fibroblast vækstfaktor (hbFGF) <ol><li> Forbered 10% BSA løsning i PBS og filtreres gennem et 0,22 mm filter. </li><li> Fra 10% BSA oploesning fremstilles en 0,2% BSA løsning. </li><li> Tilsæt 10 mL 0,2% BSA opløsning/100 mikrogram hbFGF. </li><li> Pre-våde en 0,22 mm f...

<ol>
	<li>Asgari, S., Pournasr, B., Salekdeh, G. H., Ghodsizadeh, A., Ott, M., Baharvand, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells:+a+new+era+for+hepatology.">Induced pluripotent stem cells: a new era for hepatology.</a> J. Hepatol. 53, 738-751 (2010).</li><li>Hay, D. C., Pernagallo, S., Diaz-Mochon, J. J., Medine, C. N., Greenhough, S., Hannoun, Z., Schrader, J., Black, J. R., Fletcher, J., Dalgetty, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbiased+Screening+of+Polymer+Libraries+to+Define+Novel+Substrates+for+Functional+Hepatocytes+with+Inducible+Drug+Metabolism.">Unbiased Screening of Polymer Libraries to Define Novel Substrates for Functional Hepatocytes with Inducible Drug Metabolism.</a> Stem Cell Research. 6, 92-101 (2011).</li><li>Payne, C. M., Samuel, K., Pryde, A., King, J., Brownstein, D., Schrader, J., Medine, C. N., Forbes, S. J., Iredale, J. P., Newsome, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistence+of+Functional+Hepatocyte+Like+Cells+in+Immune+Compromised+Mice.">Persistence of Functional Hepatocyte Like Cells in Immune Compromised Mice.</a> Liver International. 31, 254-262 (2011).</li><li>Greenhough, S., Medine, C., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+Stem+Cell+Derived+Hepatocyte+Like+Cells+and+their+Potential+in+Toxicity+Screening.">Pluripotent Stem Cell Derived Hepatocyte Like Cells and their Potential in Toxicity Screening.</a> Toxicology. 278, 250-255 (2010).</li><li>Medine, C. N., Greenhough, S., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Stem+Cell+Derived+Hepatic+Endoderm+in+Human+Drug+Discovery.">The Role of Stem Cell Derived Hepatic Endoderm in Human Drug Discovery.</a> Biochemical Society Transactions. 38, 1033-1036 (2010).</li><li>Hannoun, Z., Fletcher, J., Greenhough, S., Medine, C. N., Samuel, K., Sharma, R., Pryde, A., Black, J. R., Ross, J. A., Wilmut, I., Iredale, J. P., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Comparison+between+Conditioned+Media+and+Serum+Free+Media+in+Human+Embryonic+Stem+Cell+Culture+and+Differentiation.">The Comparison between Conditioned Media and Serum Free Media in Human Embryonic Stem Cell Culture and Differentiation.</a> Cellular Reprogramming. 12, 133-140 (2010).</li><li>Dalgetty, D. M., Medine, C., Iredale, J. P., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+and+Future+Challenges+in+Stem+Cell-Derived+Liver+Technologies.">Progress and Future Challenges in Stem Cell-Derived Liver Technologies.</a> American Journal of Physiology - Gastrointestinal and Liver Physiology. 297, 241-248 (2009).</li><li>Hay, D. C., Fletcher, J., Payne, C., Terrace, J. D., Gallagher, R. C. J., Snoeys, J., Black, J., Wojtacha, D., Samuel, K., Hannoun, Z., Pryde, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Efficient+Differentiation+of+hESCs+to+Functional+Hepatic+Endoderm+Requires+ActivinA+and+Wnt3a+Signalling.">Highly Efficient Differentiation of hESCs to Functional Hepatic Endoderm Requires ActivinA and Wnt3a Signalling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 12301-12306 (2008).</li><li>Fletcher, J., Cui, W., Samuels, K., Black, J. R., Currie, I. S., Terrace, J. D., Payne, C., Filippi, C., Newsome, P., Forbes, S. J., Ross, J. A., Iredale, J. P., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Inhibitory+Role+of+Stromal+Cell+Mesenchyme+on+Human+Embryonic+Stem+Cell+Hepatocyte+Differentiation+is+Overcome+by+Wnt3a+Treatment.">The Inhibitory Role of Stromal Cell Mesenchyme on Human Embryonic Stem Cell Hepatocyte Differentiation is Overcome by Wnt3a Treatment.</a> Cloning and Stem Cells. 10, 331-340 (2008).</li></ol>

Vi har udviklet en enkel, ensartet og højt reproducerbare in vitro model til at generere skalerbare niveauer af menneskelig HLCs. Vores model er blevet godkendt af en række eksterne samarbejder laboratorier. Vi rutinemæssigt karakterisere stamceller udledt HLCs ved hjælp af vores i hus værktøjskasse af udviklingsforstyrrelser markører og lever specifikke funktionelle assays (hvoraf de fleste er kommercielt tilgængelige). Den kritiske stadier i vores proces, er: vedligeholdelse af stamceller pluripotency...

Matrigel belægning plader og kolber <ol><li> Matrigel (10 ml, BD Biosciences, Forenede Kongerige); opbevares ved -20 ° C. </li><li> KO-DMEM (500 ml, Gibco, Invitrogen, Forenede Kongerige); opbevares ved 4 ° C. </li><li> Vævskultur plader (6 vel, 12 ja, Corning, England) </li><li> Vævskultur kolbe (25 cm2 udluftning, Corning, England) </li></ol> hESC Vedligeholdelse <ol><li> Musen embryonale fibroblast betinget medium (MEF-CM) (100 ml, R &amp; D Systems, USA), opbevares ved -20 ° C. </li><li> BSA-løsning (50 ml, Sigma Aldrich, Forenede Kongerige); opbevares ved 4 ° C. </li><li> Menneskelige grundlæggende fibroblast vækstfaktor (100 mikrogram, Peprotech, USA); opbevares ved -20 ° C. </li></ol> Passaging hESCs med collagenase <ol><li> Sammenflydende godt eller flaske hESCs. </li><li> Matrigel coatede brønde eller kolber efter behov. </li><li> Phospate bufferet saltvand (-MgCl 2,-CaCl 2) (500 ml, Gibco, Invitrogen, Forenede Kongerige); opbevares ved stuetemperatur. </li><li> Collagenase IV (1 g, Gibco, Invitrogen, England); opbevares ved 4 ° C. </li><li> Musen embryonale fibroblast betinget medium (MEF-CM) (100 ml, R &amp; D Systems, USA). </li><li> Menneskelige grundlæggende fibroblast vækstfaktor (100 mikrogram, Peprotech, USA). </li></ol> Differentiering af hESCs til hepatisk endoderm <ol><li> RPMI 1640 (500 ml, Gibco, Invitrogen, Forenede Kongerige); opbevares ved 4 ° C. </li><li> B27 Supplement (10 ml, Gibco, Invitrogen, Forenede Kongerige); opbevares ved -20 ° C. </li><li> Activin A (2 mikrogram, Peprotech, USA); opbevares ved -20 ° C. </li><li> Rekombinant musen Wnt3a (2 mikrogram, R &amp; D Systems, USA), opbevares ved -20 ° C. </li><li> KO-DMEM (500 ml, Gibco, Invitrogen, Forenede Kongerige); opbevares ved 4 ° C. </li><li> KO-SR (500 ml, Gibco, Invitrogen, Forenede Kongerige); opbevares ved -20 ° C. </li><li> Ikke-essentielle aminosyrer (100 ml, Gibco, Invitrogen, Forenede Kongerige); opbevares ved 4 ° C. </li><li> β-mercaptoethanol (10 ml, Gibco, Invitrogen, Forenede Kongerige); opbevares ved 4 ° C. </li><li> DMSO (Sigma Aldrich, Forenede Kongerige); opbevares ved stuetemperatur </li><li> Leibovitz L-15 dyrkningsmediet (500 ml, Sigmen Aldrich, Forenede Kongerige); opbevares ved 4 ° C. </li><li> Tryptose fosfat bouillon (100 ml, Sigma Aldrich, Forenede Kongerige); opbevares ved 4 ° C. </li><li> Føtalt bovin serum, varme inaktiveret (500 ml, Gibco, Invitrogen, Forenede Kongerige); opbevares ved -20 ° C. </li><li> Hydrocortison 21-hemisuccinate (100 mg, Sigma Aldrich, Forenede Kongerige); opbevares ved -20 ° C. </li><li> Insulin (kvæg bugspytkirtlen) (100 mg, Sigma Aldrich, Forenede Kongerige); opbevares ved -20 ° C. </li><li> L-Glutamin (100 ml, Gibco, Invitrogen, Forenede Kongerige); opbevares ved -20 ° C. </li><li> Ascorbinsyre (25 g, Sigma Aldrich, Forenede Kongerige); opbevares ved -20 ° C. </li><li> Menneskelige HGF (10 mikrogram, Peprotech, USA); opbevares ved -20 ° C. </li><li> Rekombinant humant Oncostatin M (OSM) (50 mikrogram, R &amp; D Systems, USA), opbevares ved -20 ° C. </li><li> Sprøjte drevet filter enhed 0,22 mm (Millipore, England) </li></ol> Karakterisering af hESC afledt Nedsat endoderm Immunfarvning <ol><li> Fosfatbuffer saltvand (-MgCl 2,-CaCl 2) (500 ml, Gibco, Invitrogen, Forenede Kongerige); STOre ved stuetemperatur. </li><li> PBST, PBS gjort op med 0,1% Tween 20 (Sigma-Aldrich, England). </li><li> Paraformaldehyd (PFA) (Sigma-Aldrich, England) består i PBS, butikken -20 ° C. </li><li> Glycerol (Sigma-Aldrich, England), opbevares ved stuetemperatur. </li><li> Tris Base (Sigma-Aldrich, England), opbevares ved stuetemperatur. </li><li> Ethanol </li><li> Serum (ABD Serotech, England), opbevares ved -20 ° C. </li><li> Sekundært antistof, Alexa fluorophores (Molecular Probes, Invitrogen, Storbritannien). </li><li> MOWIOL 4-88 (Polysciences Inc, USA) består i Tris HCL og glycerol som pr fabrikantens anvisninger. DAPI (Pierce, Thermo Fisher Scientific, England) er føjet til MOWIOL løsning til en 1:1000 fortynding. </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> Primære antistoffer </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Antigen * </td><td> Type </td><td> Leverandør </td><td> Fortynding </td></tr><tr><td> ALB </td><td> Muse monoklonalt </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 1 / 500 </td></tr><tr><td> E-cadherin </td><td> Muse monoklonalt </td><td> Millipore </td><td> 1 / 100 </td></tr><tr><td> α-føtoprotein </td><td> Muse monoklonalt </td><td> Sigma </td><td> 1 / 500 </td></tr><tr><td> SSEA-4 FITC </td><td> Muse monoklonalt </td><td> Biolegend </td><td> 1 / 100 </td></tr><tr><td> IgG </td><td> Muse monoklonalt </td><td> DAKO </td><td> 1 / 500 </td></tr><tr><td colspan="2"> Sekundære antistoffer </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Anti-mus FITC-konjugat </td><td> Goat Monoklonale </td><td> Invitrogen </td><td> 1 / 400 </td></tr></tbody></table> Tabel 2. Antistofferne bruges til hESC afledt hepatisk endoderm immunfarvning, de anvendte koncentrationer, arterne udviklet i, og de ​​virksomheder, de er købt fra. Funktionel Analyse af Hepatisk endoderm og Normaliserings (per mg protein) <ol><li> P4-GLO CYP3A4, CYP1A2, sortimenter og luminometer (Promega, USA). </li><li value="1"> Hvid flad bund 96 brønde assaypladen (BD Biosciences, Storbritannien). </li><li> BCA Assay Kit (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Storbritannien). </li><li> Transparent 96 brønde assaypladen (Iwaki, England) </li></ol>

robust generation of hepatocyte-like cells from human embryonic stem cell populations

Trods fremskridt i modellering human lægemiddeltoksicitet, undlader mange forbindelser under de kliniske studier på grund af uforudsete bivirkninger. De omkostninger ved kliniske studier er betydelige, og det er derfor afgørende, at mere forudsigende toksikologi-skærme er udviklet og installeret tidligt i lægemiddeludvikling (Greenhough et al 2010). Humane hepatocytter repræsenterer den nuværende guldstandarden model for vurdering lægemiddeltoksicitet, men er en begrænset ressource, der udviser variabel funktion. Derfor er brugen af ​​udødeliggjort cellelinjer og animalsk væv modeller rutinemæssigt ansættes på grund af deres overflod. Mens begge kilder er informative, de er begrænset af dårlig funktion, arter variabilitet og / eller ustabilitet i kultur (Dalgetty et al 2009). Pluripotente stamceller (PSC) er et attraktivt alternativ kilde til humane hepatocytter lignende celler (HLCs) (Medine et al 2010). PSC er i stand til selv fornyelse og differentiering på alle somatiske celletyper der findes i den voksne og dermed repræsentereren potentielt uudtømmelig kilde af differentierede celler. Vi har udviklet en procedure, der er enkel, yderst effektiv, gøres til genstand for automatisering og udbytter funktionelle menneskelige HLCs (Hay et al 2008; Fletcher et al 2008; Hannoun et al 2010; Payne et al 2011 og Hay et al 2011). Vi mener, at vores teknologi vil føre til skalerbare produktionen af ​​HLCs for lægemiddelforskning, sygdom modellering, opførelse af ekstra-kropslige enheder og muligvis cellebaserede transplantation behandlingsformer.

Watch this Scientific Journal Video about Robust Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Embryonic Stem Cell Populations at JoVE.com

Robust Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Embryonic Stem Cell Populations

Denne artikel vil fokusere på den generation af humane hepatiske endoderm fra humane embryonale stamceller populationer.

Robust Generering af hepatocyt-lignende celler fra menneskelige embryonale stamceller populationer

Despite progress in modelling human drug toxicity, many compounds fail during clinical trials due to unpredicted side effects. The cost of clinical ...

Research

JoVE Journal

Biology

Propagation of Human Embryonic Stem (ES) Cells

Propagation of Human Embryonic Stem ES Cells

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are ...

Generation of Human CD40-activated B cells

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three ...

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Effektiv Udledning af menneskelige Hjerte prækursorer og cardiomyocytter fra Pluripotente humane embryonale stamceller med småmolekyle Induktion

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Rapid Fibroblast Removal from High Density Human Embryonic Stem Cell Cultures

Hurtig Fibroblast fjernelse fra High Density humane embryonale stamceller Cultures

Mouse embryonic fibroblasts (MEFs) were used to establish human embryonic stem cells (hESCs) cultures after blastocyst isolation1. This feeder system ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

Generering af mus afledt fra induceret pluripotente stamceller

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...