Name: robust generation of hepatocyte-like cells from human embryonic stem cell populations
Uploaded: 2011-10-26T12:00:00
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Dr. Hay von einem RCUK Fellowship unterstützt wurde, Dr. West von der Abteilung für Chirurgie unterstützt wurde, Dr Medine durch einen Zuschuss aus der BHF-Core Fund unterstützt wurde, war Herr Baltasar SHS-Villarin durch eine MRC PhD Studenship unterstützt. Dr. Zhou wurde durch ein Stipendium der chinesischen Regierung unterstützt.

1. Erste Vorbereitung aller chemischen Aktien und Beschichtung von Kultur Plastikwaren Alle Schritte, die in einem Gewebekultur Motorhaube durchgeführt werden unter aseptischen Bedingungen. <ol><li> Vorbereitung des menschlichen basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor (hbFGF) <ol><li> Bereiten Sie 10% BSA-Lösung in PBS und durch ein 0,22 um-Filter. </li><li> Von den 10% BSA-Lösung vorzubereiten einer 0,2% igen BSA-Lösung. </li><li> Fügen Sie 10 ml 0,2% BSA solution/100 pg hbFGF. </li><li>...

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	<li>Asgari, S., Pournasr, B., Salekdeh, G. H., Ghodsizadeh, A., Ott, M., Baharvand, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells:+a+new+era+for+hepatology.">Induced pluripotent stem cells: a new era for hepatology.</a> J. Hepatol. 53, 738-751 (2010).</li><li>Hay, D. C., Pernagallo, S., Diaz-Mochon, J. J., Medine, C. N., Greenhough, S., Hannoun, Z., Schrader, J., Black, J. R., Fletcher, J., Dalgetty, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbiased+Screening+of+Polymer+Libraries+to+Define+Novel+Substrates+for+Functional+Hepatocytes+with+Inducible+Drug+Metabolism.">Unbiased Screening of Polymer Libraries to Define Novel Substrates for Functional Hepatocytes with Inducible Drug Metabolism.</a> Stem Cell Research. 6, 92-101 (2011).</li><li>Payne, C. M., Samuel, K., Pryde, A., King, J., Brownstein, D., Schrader, J., Medine, C. N., Forbes, S. J., Iredale, J. P., Newsome, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistence+of+Functional+Hepatocyte+Like+Cells+in+Immune+Compromised+Mice.">Persistence of Functional Hepatocyte Like Cells in Immune Compromised Mice.</a> Liver International. 31, 254-262 (2011).</li><li>Greenhough, S., Medine, C., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+Stem+Cell+Derived+Hepatocyte+Like+Cells+and+their+Potential+in+Toxicity+Screening.">Pluripotent Stem Cell Derived Hepatocyte Like Cells and their Potential in Toxicity Screening.</a> Toxicology. 278, 250-255 (2010).</li><li>Medine, C. N., Greenhough, S., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Stem+Cell+Derived+Hepatic+Endoderm+in+Human+Drug+Discovery.">The Role of Stem Cell Derived Hepatic Endoderm in Human Drug Discovery.</a> Biochemical Society Transactions. 38, 1033-1036 (2010).</li><li>Hannoun, Z., Fletcher, J., Greenhough, S., Medine, C. N., Samuel, K., Sharma, R., Pryde, A., Black, J. R., Ross, J. A., Wilmut, I., Iredale, J. P., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Comparison+between+Conditioned+Media+and+Serum+Free+Media+in+Human+Embryonic+Stem+Cell+Culture+and+Differentiation.">The Comparison between Conditioned Media and Serum Free Media in Human Embryonic Stem Cell Culture and Differentiation.</a> Cellular Reprogramming. 12, 133-140 (2010).</li><li>Dalgetty, D. M., Medine, C., Iredale, J. P., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+and+Future+Challenges+in+Stem+Cell-Derived+Liver+Technologies.">Progress and Future Challenges in Stem Cell-Derived Liver Technologies.</a> American Journal of Physiology - Gastrointestinal and Liver Physiology. 297, 241-248 (2009).</li><li>Hay, D. C., Fletcher, J., Payne, C., Terrace, J. D., Gallagher, R. C. J., Snoeys, J., Black, J., Wojtacha, D., Samuel, K., Hannoun, Z., Pryde, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Efficient+Differentiation+of+hESCs+to+Functional+Hepatic+Endoderm+Requires+ActivinA+and+Wnt3a+Signalling.">Highly Efficient Differentiation of hESCs to Functional Hepatic Endoderm Requires ActivinA and Wnt3a Signalling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 12301-12306 (2008).</li><li>Fletcher, J., Cui, W., Samuels, K., Black, J. R., Currie, I. S., Terrace, J. D., Payne, C., Filippi, C., Newsome, P., Forbes, S. J., Ross, J. A., Iredale, J. P., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Inhibitory+Role+of+Stromal+Cell+Mesenchyme+on+Human+Embryonic+Stem+Cell+Hepatocyte+Differentiation+is+Overcome+by+Wnt3a+Treatment.">The Inhibitory Role of Stromal Cell Mesenchyme on Human Embryonic Stem Cell Hepatocyte Differentiation is Overcome by Wnt3a Treatment.</a> Cloning and Stem Cells. 10, 331-340 (2008).</li></ol>

Wir haben eine einfache, homogene und reproduzierbare in vitro-Modell, um skalierbare Ebenen der menschlichen HLCs generieren entwickelt. Unser Modell wurde von einer Reihe von externen kooperierenden Laboratorien validiert. Wir routinemäßig charakterisieren Stammzellen abgeleitete HLCs mit unserem Haus in Tool-Box von Entwicklungs-Marker und der Leber spezifischen funktionellen Assays (die meisten davon sind im Handel erhältlich). Die kritischen Phasen in unserem Prozess sind: die Erhaltung von Stammzellen ...

Matrigel Beschichtung Platten und Flaschen <ol><li> Matrigel (10 ml, BD Biosciences, UK); bei -20 ° C. </li><li> KO-DMEM (500 ml, Gibco, Invitrogen, UK); lagern bei 4 ° C. </li><li> Zellkulturplatten (6 gut, 12 gut, Corning, UK) </li><li> Zellkulturflasche (25 cm2 entlüftet, Corning, UK) </li></ol> hESC Wartung <ol><li> Maus embryonale Fibroblasten-konditioniertem Medium (MEF-CM) (100 mL, R &amp; D Systems, USA); bei -20 ° C. </li><li> BSA-Lösung (50 ml, Sigma Aldrich, UK); lagern bei 4 ° C. </li><li> Menschliche basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor (100 ug, PeproTech, USA); bei -20 ° C. </li></ol> Die Passage hESCs mit Kollagenase <ol><li> Confluent gut oder Flasche hESCs. </li><li> Matrigel beschichteten Vertiefungen oder Flaschen als angemessen. </li><li> Phospate Kochsalzlösung (-MgCl 2, CaCl-2) (500 ml, Gibco, Invitrogen, UK); bei Raumtemperatur lagern. </li><li> Collagenase IV (1 g, Gibco, Invitrogen, UK); lagern bei 4 ° C. </li><li> Maus embryonale Fibroblasten-konditioniertem Medium (MEF-CM) (100 mL, R &amp; D Systems, USA). </li><li> Menschliche basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor (100 ug, PeproTech, USA). </li></ol> Differenzierung von hES hepatische Entoderm <ol><li> RPMI 1640 (500 mL, Gibco, Invitrogen, UK); lagern bei 4 ° C. </li><li> B27 Supplement (10 ml, Gibco, Invitrogen, UK); bei -20 ° C. </li><li> Activin A (2 pg, PeproTech, USA); bei -20 ° C. </li><li> Rekombinantes Maus Wnt3a (2 g, R &amp; D Systems, USA); bei -20 ° C. </li><li> KO-DMEM (500 ml, Gibco, Invitrogen, UK); lagern bei 4 ° C. </li><li> KO-SR (500 ml, Gibco, Invitrogen, UK); bei -20 ° C. </li><li> Nicht-essentielle Aminosäuren (100 ml, Gibco, Invitrogen, UK); lagern bei 4 ° C. </li><li> β-Mercaptoethanol (10 ml, Gibco, Invitrogen, UK); lagern bei 4 ° C. </li><li> DMSO (Sigma Aldrich, UK); bei Raumtemperatur lagern </li><li> Leibovitz L-15 Kulturmedium (500 ml, Sigmein Aldrich, UK); lagern bei 4 ° C. </li><li> Tryptosephosphat Brühe (100 ml, Sigma Aldrich, UK); lagern bei 4 ° C. </li><li> Fetale Rinderserum, Hitze inaktiviert (500 ml, Gibco, Invitrogen, UK); bei -20 ° C. </li><li> Hydrocortison 21-hemisuccinat (100 mg, Sigma Aldrich, UK); bei -20 ° C. </li><li> Insulin (Rinderpankreas) (100 mg, Sigma Aldrich, UK); bei -20 ° C. </li><li> L-Glutamin (100 ml, Gibco, Invitrogen, UK); bei -20 ° C. </li><li> Ascorbinsäure (25 g, Sigma Aldrich, UK); bei -20 ° C. </li><li> Menschliche HGF (10 ug, PeproTech, USA); bei -20 ° C. </li><li> Rekombinantem humanem Oncostatin M (OSM) (50 pg, R &amp; D Systems, USA); bei -20 ° C. </li><li> Spritze getrieben Filtereinheit 0,22 um (Millipore, UK) </li></ol> Charakterisierung von humanen embryonalen Stammzellen abgeleiteten Leber Endoderm Immunfärbung <ol><li> Phosphat-Puffer-Kochsalzlösung (-MgCl 2, CaCl-2) (500 ml, Gibco, Invitrogen, UK); store bei Raumtemperatur. </li><li> PBST, PBS aufgefüllt mit 0,1% Tween 20 (Sigma-Aldrich, UK). </li><li> Paraformaldehyd (PFA) (Sigma-Aldrich, UK) wird in PBS hergestellt, speichern -20 ° C. </li><li> Glycerol (Sigma-Aldrich, UK), bei Raumtemperatur lagern. </li><li> Tris Base (Sigma-Aldrich, UK), bei Raumtemperatur lagern. </li><li> Ethanol </li><li> Serum (AbD Serotech, UK), bei -20 ° C. </li><li> Sekundäre Antikörper, Alexa-Fluorophore (Molecular Probes, Invitrogen, UK). </li><li> MOWIOL 4-88 (Polysciences Inc, USA) ist in Tris HCL und Glycerin als je Anweisungen des Herstellers hergestellt. DAPI (Pierce, Thermo Fisher Scientific, UK) ist die MOWIOL Lösung in einer 1:1000 verdünnt. </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> Primärantikörper </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Antigen * </td><td> Typ </td><td> Lieferant </td><td> Verdünnung </td></tr><tr><td> ALB </td><td> Monoklonalen Maus- </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 1 / 500 </td></tr><tr><td> E-Cadherin </td><td> Monoklonalen Maus- </td><td> Millipore </td><td> 1 / 100 </td></tr><tr><td> α-Fetoprotein </td><td> Monoklonalen Maus- </td><td> Sigma </td><td> 1 / 500 </td></tr><tr><td> SSEA-4 FITC </td><td> Monoklonalen Maus- </td><td> Biolegend </td><td> 1 / 100 </td></tr><tr><td> IgG </td><td> Monoklonalen Maus- </td><td> DAKO </td><td> 1 / 500 </td></tr><tr><td colspan="2"> Sekundärantikörper </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Anti-Maus-FITC-Konjugat </td><td> Goat Monoklonale </td><td> Invitrogen </td><td> 1 / 400 </td></tr></tbody></table> Tabelle 2. Die Antikörper für hESC abgeleitet Leber Entoderm Immunfärbung verwendet, verwendet die Konzentrationen der Spezies in der Firmen entwickelt sie aus gekauft. Funktionelle Analyse von Leber-und Endoderm Normalisation (pro mg Protein) <ol><li> p4-GLO CYP3A4, CYP1A2, Kits und Luminometer (Promega, USA). </li><li value="1"> Weiß Flachboden 96 well Assay-Platte (BD Biosciences, UK). </li><li> BCA Assay Kit (Pierce, Thermo Fisher Scientific, UK). </li><li> Transparente 96-Well-Assay-Platte (IWAKI, UK) </li></ol>

robust generation of hepatocyte-like cells from human embryonic stem cell populations

Trotz der Fortschritte in der Modellierung menschlichen Medikamententoxizität scheitern viele Verbindungen in klinischen Studien wegen unvorhergesehener Nebenwirkungen. Die Kosten für klinische Studien sind erheblich, deshalb ist es wichtig, dass mehr prädiktiven Toxikologie Bildschirme entwickelt und frühzeitig in der Medikamentenentwicklung (Greenhough et al 2010) eingesetzt. Humane Hepatozyten stellen den aktuellen Gold-Standard-Modell für die Bewertung Medikamententoxizität, sondern sind eine begrenzte Ressource, die variable Funktion aufweisen. Daher sind die Verwendung von immortalisierten Zelllinien und tierischem Gewebe Modellen routinemäßig eingesetzt wegen ihrer Fülle. Während beide Quellen informative sind, werden sie durch eine schlechte Funktion, Arten Variabilität und / oder Instabilität in Kultur (Dalgetty et al 2009) begrenzt. Pluripotenten Stammzellen (PSCs) sind eine attraktive Alternative Quelle für humane Hepatozyten ähnlichen Zellen (HLCs) (Medine et al 2010). PSCs sind in der Lage sich selbst erneuern und sich für alle somatischen Zelltypen des erwachsenen gefunden und stellen dabeieine potenziell unerschöpfliche Quelle von differenzierten Zellen. Wir haben ein Verfahren, das einfache, sehr effiziente, Automatisierung zugänglich und liefert funktionelle menschliche HLCs (; Fletcher et al 2008; Hannoun et al 2010; Payne et al 2011 und Hay et al 2011 Hay et al 2008) entwickelt. Wir glauben, dass unsere Technologie, um das skalierbare Produktion von HLCs für die Wirkstoffforschung, Krankheit Modellierung, den Bau der extrakorporalen Geräten und möglicherweise zellbasierten Transplantation Therapien führen.

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Robust Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Embryonic Stem Cell Populations

Dieser Artikel wird auf die Erzeugung von menschlichen Leber Entoderm aus humanen embryonalen Stammzell-Populationen zu konzentrieren.

Robuste Generierung von Leber-ähnlichen Zellen aus humanen embryonalen Stammzell-Populationen

Despite progress in modelling human drug toxicity, many compounds fail during clinical trials due to unpredicted side effects. The cost of clinical ...

Research

JoVE Journal

Biology

Propagation of Human Embryonic Stem (ES) Cells

Propagation of Human Embryonic Stem ES Cells

Vermehrung von humanen embryonalen Stammzellen (ES-Zellen)

Forschung

Biologie

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

Ableitung von hämatopoetischen Stammzellen aus embryonalen Stammzellen der Maus

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

Gewinnung menschlicher embryonaler Stammzellen durch Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

Chromatin Immunopräzipitation von humanen embryonalen Stammzellen

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are ...

Generation of Human CD40-activated B cells

Generation of Human CD40-aktivierten B-Zellen

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Differenzierung von embryonalen Stammzellen in Oligodendrozyten Precursors

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation

Fate Mapping von humanen embryonalen Stammzellen durch Teratom Formation

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three ...

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Effiziente Ableitung von Human Cardiac Vorstufen und Kardiomyozyten aus pluripotenten humanen embryonalen Stammzellen mit Small Molecule Induction

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Rapid Fibroblast Removal from High Density Human Embryonic Stem Cell Cultures

Schnelle Fibroblast Entfernung aus High Density humanen embryonalen Stammzellen Kulturen

Mouse embryonic fibroblasts (MEFs) were used to establish human embryonic stem cells (hESCs) cultures after blastocyst isolation1. This feeder system ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

Generation der Mäuse aus induzierten pluripotenten Stammzellen

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...