Name: robust generation of hepatocyte-like cells from human embryonic stem cell populations
Uploaded: 2011-10-26T12:00:00
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Il dottor Hay è stato sostenuto da una borsa di RCUK, il dottor West è stato sostenuto dal Dipartimento di Chirurgia, il dottor Medine è stata sostenuta da una sovvenzione del Fondo Nucleo BHF, il Sig. Baltasar Lucendo-Villarin è stata sostenuta da un dottorato di ricerca MRC Studenship. Il dottor Zhou è stato sostenuto da una borsa di studio dal governo cinese.

1. Preparazione iniziale di tutti gli stock chimica e rivestimento della cultura Plasticware Tutti i passaggi da effettuare in una cappa di coltura dei tessuti in condizioni asettiche. <ol><li> Preparazione delle risorse umane fattore di crescita fibroblastico (hbFGF) <ol><li> Preparare soluzione al 10% BSA in PBS e filtrare su un filtro di 0,22 micron. </li><li> Dalla soluzione al 10% di BSA preparare una soluzione 0,2% BSA. </li><li> Aggiungere 10 ml 0,2% di BSA hbFGF mcg solution/100. </li...

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	<li>Asgari, S., Pournasr, B., Salekdeh, G. H., Ghodsizadeh, A., Ott, M., Baharvand, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells:+a+new+era+for+hepatology.">Induced pluripotent stem cells: a new era for hepatology.</a> J. Hepatol. 53, 738-751 (2010).</li><li>Hay, D. C., Pernagallo, S., Diaz-Mochon, J. J., Medine, C. N., Greenhough, S., Hannoun, Z., Schrader, J., Black, J. R., Fletcher, J., Dalgetty, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbiased+Screening+of+Polymer+Libraries+to+Define+Novel+Substrates+for+Functional+Hepatocytes+with+Inducible+Drug+Metabolism.">Unbiased Screening of Polymer Libraries to Define Novel Substrates for Functional Hepatocytes with Inducible Drug Metabolism.</a> Stem Cell Research. 6, 92-101 (2011).</li><li>Payne, C. M., Samuel, K., Pryde, A., King, J., Brownstein, D., Schrader, J., Medine, C. N., Forbes, S. J., Iredale, J. P., Newsome, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistence+of+Functional+Hepatocyte+Like+Cells+in+Immune+Compromised+Mice.">Persistence of Functional Hepatocyte Like Cells in Immune Compromised Mice.</a> Liver International. 31, 254-262 (2011).</li><li>Greenhough, S., Medine, C., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+Stem+Cell+Derived+Hepatocyte+Like+Cells+and+their+Potential+in+Toxicity+Screening.">Pluripotent Stem Cell Derived Hepatocyte Like Cells and their Potential in Toxicity Screening.</a> Toxicology. 278, 250-255 (2010).</li><li>Medine, C. N., Greenhough, S., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Stem+Cell+Derived+Hepatic+Endoderm+in+Human+Drug+Discovery.">The Role of Stem Cell Derived Hepatic Endoderm in Human Drug Discovery.</a> Biochemical Society Transactions. 38, 1033-1036 (2010).</li><li>Hannoun, Z., Fletcher, J., Greenhough, S., Medine, C. N., Samuel, K., Sharma, R., Pryde, A., Black, J. R., Ross, J. A., Wilmut, I., Iredale, J. P., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Comparison+between+Conditioned+Media+and+Serum+Free+Media+in+Human+Embryonic+Stem+Cell+Culture+and+Differentiation.">The Comparison between Conditioned Media and Serum Free Media in Human Embryonic Stem Cell Culture and Differentiation.</a> Cellular Reprogramming. 12, 133-140 (2010).</li><li>Dalgetty, D. M., Medine, C., Iredale, J. P., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+and+Future+Challenges+in+Stem+Cell-Derived+Liver+Technologies.">Progress and Future Challenges in Stem Cell-Derived Liver Technologies.</a> American Journal of Physiology - Gastrointestinal and Liver Physiology. 297, 241-248 (2009).</li><li>Hay, D. C., Fletcher, J., Payne, C., Terrace, J. D., Gallagher, R. C. J., Snoeys, J., Black, J., Wojtacha, D., Samuel, K., Hannoun, Z., Pryde, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Efficient+Differentiation+of+hESCs+to+Functional+Hepatic+Endoderm+Requires+ActivinA+and+Wnt3a+Signalling.">Highly Efficient Differentiation of hESCs to Functional Hepatic Endoderm Requires ActivinA and Wnt3a Signalling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 12301-12306 (2008).</li><li>Fletcher, J., Cui, W., Samuels, K., Black, J. R., Currie, I. S., Terrace, J. D., Payne, C., Filippi, C., Newsome, P., Forbes, S. J., Ross, J. A., Iredale, J. P., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Inhibitory+Role+of+Stromal+Cell+Mesenchyme+on+Human+Embryonic+Stem+Cell+Hepatocyte+Differentiation+is+Overcome+by+Wnt3a+Treatment.">The Inhibitory Role of Stromal Cell Mesenchyme on Human Embryonic Stem Cell Hepatocyte Differentiation is Overcome by Wnt3a Treatment.</a> Cloning and Stem Cells. 10, 331-340 (2008).</li></ol>

Abbiamo sviluppato un modello semplice, omogeneo e altamente riproducibili in vitro per generare livelli scalabili di HLCS umano. Il nostro modello è stato convalidato da una serie di laboratori esterni collaborazione. Noi abitualmente caratterizzano HLCS cellule staminali derivate usando il nostro strumento di casa nella casella dei marcatori dello sviluppo e del fegato analisi specifiche funzionali (la maggior parte dei quali sono disponibili in commercio). Le fasi critiche del nostro processo sono: il mante...

Lastre di verniciatura Matrigel e fiaschi <ol><li> Matrigel (10 ml, BD Biosciences, UK); conservare a -20 ° C. </li><li> KO-DMEM (500 ml, Gibco, Invitrogen, UK); conservare a 4 ° C. </li><li> Piastre di coltura tissutale (6 bene, ben 12, Corning, UK) </li><li> Tessuto fiasco cultura (25 cm2 ventilati, Corning, UK) </li></ol> hESC manutenzione <ol><li> Topo di medie fibroblasti embrionali condizionata (MEF-CM) (100 ml, R &amp; D Systems, USA); conservare a -20 ° C. </li><li> BSA soluzione (50 ml, Sigma Aldrich, UK); conservare a 4 ° C. </li><li> Umano fondamentale fattore di crescita dei fibroblasti (100 mcg, Peprotech, USA); conservare a -20 ° C. </li></ol> HESC Passaging con collagenasi <ol><li> Ben confluenti o fiasco di hESC. </li><li> Matrigel pozzi rivestiti o fiaschi a seconda dei casi. </li><li> Fosfato salina tamponata (-MgCl 2,-CaCl 2) (500 ml, Gibco, Invitrogen, UK); conservare a temperatura ambiente. </li><li> Collagenasi IV (1 g, Gibco, InvitrOgen, UK); conservare a 4 ° C. </li><li> Topo di medie fibroblasti embrionali condizionata (MEF-CM) (100 ml, R &amp; D Systems, USA). </li><li> Umano fondamentale fattore di crescita dei fibroblasti (100 mcg, Peprotech, USA). </li></ol> Differenziazione delle hESC a endoderma epatica <ol><li> RPMI 1640 (500 ml, Gibco, Invitrogen, UK); conservare a 4 ° C. </li><li> Supplemento B27 (10 ml, Gibco, Invitrogen, UK); conservare a -20 ° C. </li><li> Activin A (2 mg, Peprotech, USA); conservare a -20 ° C. </li><li> Ricombinante Wnt3a del mouse (2 mg, R &amp; D Systems, USA); conservare a -20 ° C. </li><li> KO-DMEM (500 ml, Gibco, Invitrogen, UK); conservare a 4 ° C. </li><li> KO-SR (500 ml, Gibco, Invitrogen, UK); conservare a -20 ° C. </li><li> Aminoacidi non essenziali (100 ml, Gibco, Invitrogen, UK); conservare a 4 ° C. </li><li> β-mercaptoetanolo (10 ml, Gibco, Invitrogen, UK); conservare a 4 ° C. </li><li> DMSO (Sigma Aldrich, UK); conservare a temperatura ambiente </li><li> Leibovitz L-15 terreno di coltura (500 ml, SIGMuno Aldrich, UK); conservare a 4 ° C. </li><li> Triptosio fosfato brodo (100 ml, Sigma Aldrich, UK); conservare a 4 ° C. </li><li> Siero fetale bovino, inattivato con il calore (500 ml, Gibco, Invitrogen, UK); conservare a -20 ° C. </li><li> Idrocortisone 21-emisuccinato (100 mg, Sigma Aldrich, UK); conservare a -20 ° C. </li><li> Insulina (pancreas bovino) (100 mg, Sigma Aldrich, UK); conservare a -20 ° C. </li><li> L-Glutammina (100 ml, Gibco, Invitrogen, UK); conservare a -20 ° C. </li><li> Acido ascorbico (25 g, Sigma Aldrich, UK); conservare a -20 ° C. </li><li> Umano HGF (10 mcg, Peprotech, USA); conservare a -20 ° C. </li><li> Ricombinante umana oncostatina M (OSM) (50 mcg, R &amp; D Systems, USA); conservare a -20 ° C. </li><li> Siringa guidato unità filtro 0,22 micron (Millipore, UK) </li></ol> Caratterizzazione di Endoderma epatica derivati ​​dalle hESC Immunocolorazione <ol><li> Tampone fosfato salino (-MgCl 2,-CaCl 2) (500 ml, Gibco, Invitrogen, UK); STOre a temperatura ambiente. </li><li> PBST, PBS composto con 0,1% di Tween 20 (Sigma-Aldrich, UK). </li><li> Paraformaldeide (PFA) (Sigma-Aldrich, UK) è costituito in PBS, conservare a -20 ° C. </li><li> Glicerolo (Sigma-Aldrich, UK), conservare a temperatura ambiente. </li><li> Tris base (Sigma-Aldrich, UK), conservare a temperatura ambiente. </li><li> Etanolo </li><li> Siero (ABD Serotech, UK), conservare a -20 ° C. </li><li> Anticorpo secondario, Fluorofori Alexa (Molecular Probes, Invitrogen, UK). </li><li> MOWIOL 4-88 (Polysciences Inc, USA) è realizzata in Tris HCL e glicerolo come da istruzioni del produttore. DAPI (Pierce, Thermo Fisher Scientific, UK) è aggiunto alla soluzione MOWIOL a una diluizione 1:1000. </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> Anticorpi primari </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Antigen * </td><td> Tipo </td><td> Fornitore </td><td> Diluizione </td></tr><tr><td> ALB </td><td> Monoclonali del mouse </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 1 / 500 </td></tr><tr><td> E-caderina </td><td> Monoclonali del mouse </td><td> Millipore </td><td> 1 / 100 </td></tr><tr><td> α-fetoproteina </td><td> Monoclonali del mouse </td><td> Sigma </td><td> 1 / 500 </td></tr><tr><td> SSE-4 FITC </td><td> Monoclonali del mouse </td><td> Biolegend </td><td> 1 / 100 </td></tr><tr><td> IgG </td><td> Monoclonali del mouse </td><td> DAKO </td><td> 1 / 500 </td></tr><tr><td colspan="2"> Anticorpi secondari </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Anti-topo coniugato FITC </td><td> Capra monoclonali </td><td> Invitrogen </td><td> 1 / 400 </td></tr></tbody></table> Tabella 2. Gli anticorpi utilizzati per immunocolorazione epatiche derivate endoderma hESC, le concentrazioni utilizzate, la specie ha sviluppato nel e le società che essi siano acquistati. Analisi funzionale di Endoderma epatica e Normalisation (per mg di proteina) <ol><li> p4-GLO CYP3A4, CYP1A2, Kit e luminometro (Promega, USA). </li><li value="1"> Bianco fondo piatto piastra da 96 dosaggio bene (BD Biosciences, UK). </li><li> BCA Assay Kit (Pierce, Thermo Fisher Scientific, UK). </li><li> Trasparente piastra da 96 dosaggio bene (Iwaki, UK) </li></ol>

robust generation of hepatocyte-like cells from human embryonic stem cell populations

Nonostante i progressi nella modellazione tossicità dei farmaci umani, molti composti non durante gli studi clinici per effetti collaterali imprevisti. Il costo degli studi clinici sono notevoli, quindi è essenziale che più schermi tossicologia predittiva sono sviluppati e distribuiti nelle prime fasi di sviluppo dei farmaci (Greenhough et al 2010). Epatociti umani rappresentano il modello attuale gold standard per valutare la tossicità della droga, ma sono una risorsa limitata che presentano la funzione variabile. Pertanto, l&#39;uso di linee cellulari immortalizzate e modelli tessuti animali sono normalmente impiegati per la loro abbondanza. Mentre entrambe le fonti sono informativi, essi sono limitati dalla scarsa funzionalità, la variabilità delle specie e / o instabilità nella cultura (Dalgetty et al 2009). Le cellule staminali pluripotenti (PSC) sono una fonte interessante alternativa di epatociti umani come cellule (HLCS) (Medine et al 2010). PSC sono in grado di rinnovamento del sé e la differenziazione di tutti i tipi di cellule somatiche trovato negli adulti e, quindi, rappresentanouna fonte potenzialmente inesauribile di cellule differenziate. Abbiamo sviluppato una procedura che è semplice, altamente efficiente, suscettibili di automazione e rese funzionali HLCS umano (Hay et al 2008; Fletcher et al 2008; Hannoun et al 2010; Payne et al 2011 e Hay et al 2011). Crediamo che la nostra tecnologia porterà alla produzione scalabile di HLCS per la scoperta, la modellazione della malattia, la costruzione di dispositivi di extra-corporea e, eventualmente, le terapie cellulari a base di trapianto.

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Questo articolo si concentrerà sulla creazione di endoderma epatiche umane da popolazioni di cellule staminali embrionali.

Generazione robusta di epatociti-come le cellule da popolazioni di cellule staminali embrionali

Despite progress in modelling human drug toxicity, many compounds fail during clinical trials due to unpredicted side effects. The cost of clinical ...

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