Name: robust generation of hepatocyte-like cells from human embryonic stem cell populations
Uploaded: 2011-10-26T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Robust Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Embryonic Stem Cell Populations at JoVE.com

Dr Hay ble støttet av en RCUK Fellowship, var dr. West støttet av Kirurgisk avdeling, var Dr Medine støttet av et stipend fra BHF Core-fondet, var Mr. Baltasar Lucendo-Villarin støttet av et MRC PhD Studenship. Dr Zhou ble støttet av et stipend fra den kinesiske regjeringen.

1. Initial utarbeidelse av alle kjemiske bestander og belegg av kultur plasticware Alle trinn skal utføres i en vevskultur hette under aseptiske forhold. <ol><li> Utarbeidelse av menneskelig grunnleggende fibroblast vekstfaktor (hbFGF) <ol><li> Forbered 10% BSA løsning i PBS og filtrere gjennom en 0,22 mikrometer filter. </li><li> Fra 10% BSA løsning forberede en 0,2% BSA løsning. </li><li> Tilsett 10 ml 0,2% BSA solution/100 mikrogram hbFGF. </li><li> Pre-vått en 0,22 mikrometer filter ...

<ol>
	<li>Asgari, S., Pournasr, B., Salekdeh, G. H., Ghodsizadeh, A., Ott, M., Baharvand, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells:+a+new+era+for+hepatology.">Induced pluripotent stem cells: a new era for hepatology.</a> J. Hepatol. 53, 738-751 (2010).</li><li>Hay, D. C., Pernagallo, S., Diaz-Mochon, J. J., Medine, C. N., Greenhough, S., Hannoun, Z., Schrader, J., Black, J. R., Fletcher, J., Dalgetty, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbiased+Screening+of+Polymer+Libraries+to+Define+Novel+Substrates+for+Functional+Hepatocytes+with+Inducible+Drug+Metabolism.">Unbiased Screening of Polymer Libraries to Define Novel Substrates for Functional Hepatocytes with Inducible Drug Metabolism.</a> Stem Cell Research. 6, 92-101 (2011).</li><li>Payne, C. M., Samuel, K., Pryde, A., King, J., Brownstein, D., Schrader, J., Medine, C. N., Forbes, S. J., Iredale, J. P., Newsome, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistence+of+Functional+Hepatocyte+Like+Cells+in+Immune+Compromised+Mice.">Persistence of Functional Hepatocyte Like Cells in Immune Compromised Mice.</a> Liver International. 31, 254-262 (2011).</li><li>Greenhough, S., Medine, C., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+Stem+Cell+Derived+Hepatocyte+Like+Cells+and+their+Potential+in+Toxicity+Screening.">Pluripotent Stem Cell Derived Hepatocyte Like Cells and their Potential in Toxicity Screening.</a> Toxicology. 278, 250-255 (2010).</li><li>Medine, C. N., Greenhough, S., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Stem+Cell+Derived+Hepatic+Endoderm+in+Human+Drug+Discovery.">The Role of Stem Cell Derived Hepatic Endoderm in Human Drug Discovery.</a> Biochemical Society Transactions. 38, 1033-1036 (2010).</li><li>Hannoun, Z., Fletcher, J., Greenhough, S., Medine, C. N., Samuel, K., Sharma, R., Pryde, A., Black, J. R., Ross, J. A., Wilmut, I., Iredale, J. P., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Comparison+between+Conditioned+Media+and+Serum+Free+Media+in+Human+Embryonic+Stem+Cell+Culture+and+Differentiation.">The Comparison between Conditioned Media and Serum Free Media in Human Embryonic Stem Cell Culture and Differentiation.</a> Cellular Reprogramming. 12, 133-140 (2010).</li><li>Dalgetty, D. M., Medine, C., Iredale, J. P., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+and+Future+Challenges+in+Stem+Cell-Derived+Liver+Technologies.">Progress and Future Challenges in Stem Cell-Derived Liver Technologies.</a> American Journal of Physiology - Gastrointestinal and Liver Physiology. 297, 241-248 (2009).</li><li>Hay, D. C., Fletcher, J., Payne, C., Terrace, J. D., Gallagher, R. C. J., Snoeys, J., Black, J., Wojtacha, D., Samuel, K., Hannoun, Z., Pryde, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Efficient+Differentiation+of+hESCs+to+Functional+Hepatic+Endoderm+Requires+ActivinA+and+Wnt3a+Signalling.">Highly Efficient Differentiation of hESCs to Functional Hepatic Endoderm Requires ActivinA and Wnt3a Signalling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 12301-12306 (2008).</li><li>Fletcher, J., Cui, W., Samuels, K., Black, J. R., Currie, I. S., Terrace, J. D., Payne, C., Filippi, C., Newsome, P., Forbes, S. J., Ross, J. A., Iredale, J. P., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Inhibitory+Role+of+Stromal+Cell+Mesenchyme+on+Human+Embryonic+Stem+Cell+Hepatocyte+Differentiation+is+Overcome+by+Wnt3a+Treatment.">The Inhibitory Role of Stromal Cell Mesenchyme on Human Embryonic Stem Cell Hepatocyte Differentiation is Overcome by Wnt3a Treatment.</a> Cloning and Stem Cells. 10, 331-340 (2008).</li></ol>

Vi har utviklet et enkelt, homogen og svært reproduserbare in vitro modell for å generere skalerbar nivåer av menneskelige HLCs. Vår modell har blitt validert av en rekke eksterne samarbeidende laboratorier. Vi rutinemessig karakterisere stamceller hentet HLCs bruke vår i huset verktøykasse av utviklingsforstyrrelser markører og lever spesifikke funksjonelle assays (de fleste som er kommersielt tilgjengelig). Den kritiske stadier i prosessen vår er: vedlikehold av stamcelle pluripotency, evnen til direk...

Matrigel belegg plater og flakonger <ol><li> Matrigel (10 mL, BD biovitenskap, Storbritannia), lagre ved -20 ° C. </li><li> KO-DMEM (500 ml, Gibco, Invitrogen, Storbritannia), lagre ved 4 ° C. </li><li> Tissue kultur plater (6 bra, 12 bra, Corning, Storbritannia) </li><li> Tissue kultur kolbe (25 cm2 ventilert, Corning, Storbritannia) </li></ol> hESC Vedlikehold <ol><li> Mus embryonale fibroblast betinget medium (MEF-CM) (100 ml, R &amp; D Systems, USA), lagre ved -20 ° C. </li><li> BSA-løsning (50 mL, Sigma Aldrich, Storbritannia), lagre ved 4 ° C. </li><li> Menneskelig grunnleggende fibroblast vekstfaktor (100 mikrogram, Peprotech, USA), lagre ved -20 ° C. </li></ol> Passaging hESCs med collagenase <ol><li> Confluent godt eller kolbe hESCs. </li><li> Matrigel belagt brønner eller kolber som passer. </li><li> Phospate buffered saltvann (-MgCl 2-CaCl 2) (500 ml, Gibco, Invitrogen, Storbritannia), lagre ved romtemperatur. </li><li> Collagenase IV (1 g, Gibco, Invitrogen, Storbritannia), lagre ved 4 ° C. </li><li> Mus embryonale fibroblast betinget medium (MEF-CM) (100 ml, R &amp; D Systems, USA). </li><li> Menneskelig grunnleggende fibroblast vekstfaktor (100 mikrogram, Peprotech, USA). </li></ol> Differensiering av hESCs til nedsatt endoderm <ol><li> RPMI 1640 (500 ml, Gibco, Invitrogen, Storbritannia), lagre ved 4 ° C. </li><li> B27 Supplement (10 mL, Gibco, Invitrogen, Storbritannia), lagre ved -20 ° C. </li><li> Activin A (2 mikrogram, Peprotech, USA), lagre ved -20 ° C. </li><li> Rekombinant mus Wnt3a (2 mikrogram, R &amp; D Systems, USA), lagre ved -20 ° C. </li><li> KO-DMEM (500 ml, Gibco, Invitrogen, Storbritannia), lagre ved 4 ° C. </li><li> KO-SR (500 ml, Gibco, Invitrogen, Storbritannia), lagre ved -20 ° C. </li><li> Ikke-essensielle aminosyrer (100 ml, Gibco, Invitrogen, Storbritannia), lagre ved 4 ° C. </li><li> β-Mercaptoethanol (10 mL, Gibco, Invitrogen, Storbritannia), lagre ved 4 ° C. </li><li> DMSO (Sigma Aldrich, Storbritannia), lagre ved romtemperatur </li><li> Leibovitz L-15 kulturen medium (500 ml, Sigmen Aldrich, Storbritannia), lagre ved 4 ° C. </li><li> Tryptose fosfat kjøttkraft (100 ml, Sigma Aldrich, Storbritannia), lagre ved 4 ° C. </li><li> Føtal bovint serum, varme inaktivert (500 ml, Gibco, Invitrogen, Storbritannia), lagre ved -20 ° C. </li><li> Hydrokortison 21-hemisuccinate (100 mg, Sigma Aldrich, Storbritannia), lagre ved -20 ° C. </li><li> Insulin (storfe bukspyttkjertel) (100 mg, Sigma Aldrich, Storbritannia), lagre ved -20 ° C. </li><li> L-Glutamin (100 ml, Gibco, Invitrogen, Storbritannia), lagre ved -20 ° C. </li><li> Askorbinsyre (25 g, Sigma Aldrich, Storbritannia), lagre ved -20 ° C. </li><li> Menneskelig HGF (10 mikrogram, Peprotech, USA), lagre ved -20 ° C. </li><li> Rekombinant Menneskelig Oncostatin M (OSM) (50 mikrogram, R &amp; D Systems, USA), lagre ved -20 ° C. </li><li> Sprøyte drevet filter enhet 0,22 mikrometer (Millipore, Storbritannia) </li></ol> Karakterisering av hESC avledet Nedsatt endoderm Farging <ol><li> Fosfatbuffer saltvannsoppløsning (-MgCl 2-CaCl 2) (500 ml, Gibco, Invitrogen, Storbritannia), STOre ved romtemperatur. </li><li> PBST, PBS gjort opp med 0,1% Tween 20 (Sigma-Aldrich, Storbritannia). </li><li> Paraformaldehyde (PFA) (Sigma-Aldrich, Storbritannia) er gjort opp i PBS, oppbevare -20 ° C. </li><li> Glyserol (Sigma-Aldrich, Storbritannia), lagre ved romtemperatur. </li><li> Tris Base (Sigma-Aldrich, Storbritannia), oppbevares ved romtemperatur. </li><li> Etanol </li><li> Serum (Abd Serotech, Storbritannia), lagre ved -20 ° C. </li><li> Sekundær antistoff, Alexa Fluorophores (molekylære prober, Invitrogen, Storbritannia). </li><li> MOWIOL 4-88 (Polysciences Inc, USA) er gjort opp i Tris HCL og glyserol som per produsentens instruksjoner. DAPI (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Storbritannia) er lagt til MOWIOL løsningen på et 1:1000 fortynning. </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> Primære antistoffer </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Antigen * </td><td> Type </td><td> Leverandør </td><td> Fortynning </td></tr><tr><td> ALB </td><td> Monoklonalt </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 1 / 500 </td></tr><tr><td> E-cadherin </td><td> Monoklonalt </td><td> Millipore </td><td> 1 / 100 </td></tr><tr><td> α-fetoprotein </td><td> Monoklonalt </td><td> Sigma </td><td> 1 / 500 </td></tr><tr><td> SSEA-4 FITC </td><td> Monoklonalt </td><td> Biolegend </td><td> 1 / 100 </td></tr><tr><td> IgG </td><td> Monoklonalt </td><td> DAKO </td><td> 1 / 500 </td></tr><tr><td colspan="2"> Sekundær antistoffer </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Anti-mus FITC konjugat </td><td> Goat Monoklonale </td><td> Invitrogen </td><td> 1 / 400 </td></tr></tbody></table> Tabell 2. Antistoffene som brukes for hESC avledet nedsatt endoderm farging, konsentrasjonene som brukes, arten utviklet i og selskapene de er kjøpt fra. Funksjonell analyse av Lever endoderm og Normalisering (per mg protein) <ol><li> P4-GLO CYP3A4, CYP1A2, Kits og luminometer (Promega, USA). </li><li value="1"> Hvit flat bunn 96 godt analysen plate (BD biovitenskap, Storbritannia). </li><li> BCA Assay Kit (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Storbritannia). </li><li> Transparent 96 godt analysen plate (IWAKI, Storbritannia) </li></ol>

robust generation of hepatocyte-like cells from human embryonic stem cell populations

Til tross for fremgang i modellering human narkotika toksisitet, mange forbindelser mislykkes i kliniske studier på grunn av uforutsette bivirkninger. Kostnaden for kliniske studier er store, derfor er det viktig at mer prediktiv toksikologi skjermer er utviklet og distribuert tidlig i legemiddelutvikling (Greenhough et al 2010). Humane hepatocytter representerer dagens gullstandarden modell for evaluering av narkotika toksisitet, men er en begrenset ressurs som viser variabel funksjon. Derfor er bruk av foreviget cellelinjer og animalsk vev modeller rutinemessig ansatt på grunn av sin overflod. Mens begge kilder er informative, de er begrenset av dårlig funksjon, arter variabilitet og / eller ustabilitet i kultur (Dalgetty et al 2009). Pluripotent stamceller (PSCs) er et attraktivt alternativ kilde til menneskelig hepatocytter som celler (HLCs) (Medine et al 2010). PSCs er i stand til selv fornyelse og differensiering for alle somatiske celletyper som finnes i den voksne og dermed representereren potensielt uuttømmelig kilde til differensierte celler. Vi har utviklet en prosedyre som er enkel, svært effektiv, mottagelig for automatisering og gir funksjonell human HLCs (Hay et al 2008; Fletcher et al 2008; Hannoun et al 2010; Payne et al 2011 og Hay et al 2011). Vi tror vår teknologi vil føre til skalerbar produksjon av HLCs for drug discovery, sykdom modellering, bygging av ekstra-corporeal enheter og muligens cellebaserte transplantasjon terapi.

Watch this Scientific Journal Video about Robust Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Embryonic Stem Cell Populations at JoVE.com

Robust Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Embryonic Stem Cell Populations (Video) | JoVE

Denne artikkelen vil fokusere på den generasjonen av menneskelig nedsatt endoderm fra humane embryonale stamceller populasjoner.

Robust Generation of hepatocytter-lignende celler fra humane embryonale Stem Cell pasientgrupper

Despite progress in modelling human drug toxicity, many compounds fail during clinical trials due to unpredicted side effects. The cost of clinical ...

Research

JoVE Journal

Biology

Robust Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Embryonic Stem Cell Populations

Propagation of Human Embryonic Stem (ES) Cells

Propagation of Human Embryonic Stem ES Cells (Video) | JoVE

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells (Video) | JoVE

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery (Video) | JoVE

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells (Video) | JoVE

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are ...

Generation of Human CD40-activated B cells

Generation of Human CD40-activated B cells (Video) | JoVE

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer ...

Freezing and Thawing Human Embryonic Stem Cells

Freezing and Thawing Human Embryonic Stem Cells (Video) | JoVE

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells ...

Video Bioinformatics Analysis of Human Embryonic Stem Cell Colony Growth

Video Bioinformatics Analysis of Human Embryonic Stem Cell Colony Growth (Video) | JoVE

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors (Video) | JoVE

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation 

Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation (Video) | JoVE

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three ...

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction (Video) | JoVE

Effektiv Utledning av Human Cardiac Forstadier og cardiomyocytes fra pluripotent humane embryonale stamceller med lite molekyl Induksjon

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...