Name: robust generation of hepatocyte-like cells from human embryonic stem cell populations
Uploaded: 2011-10-26T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Robust Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Embryonic Stem Cell Populations at JoVE.com

Dr Hay fick stöd av en RCUK Fellowship, var dr West stöds av Institutionen för kirurgi, var dr Medine stöds av ett bidrag från BHF Core-fonden, var han Baltasar Lucendo-Villarin stöds av en MRC doktorsexamen Studenship. Dr Zhou fick stöd av ett stipendium från den kinesiska regeringen.

1. Första bearbetning av alla kemiska lager och ytbeläggning av kultur plasten Alla steg skall utföras i en vävnad kultur huva under aseptiska förhållanden. <ol><li> Beredning av människans grundläggande Fibroblast Growth Factor (hbFGF) <ol><li> Bered 10% BSA lösning i PBS och filtrera genom ett 0,22 ìm filter. </li><li> Från 10% BSA Bered en 0,2% BSA lösning. </li><li> Tillsätt 10 ml 0,2% BSA solution/100 mikrogram hbFGF. </li><li> Pre-wet ett 0,22 ìm filter genom att filtrera ...

<ol>
	<li>Asgari, S., Pournasr, B., Salekdeh, G. H., Ghodsizadeh, A., Ott, M., Baharvand, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells:+a+new+era+for+hepatology.">Induced pluripotent stem cells: a new era for hepatology.</a> J. Hepatol. 53, 738-751 (2010).</li><li>Hay, D. C., Pernagallo, S., Diaz-Mochon, J. J., Medine, C. N., Greenhough, S., Hannoun, Z., Schrader, J., Black, J. R., Fletcher, J., Dalgetty, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbiased+Screening+of+Polymer+Libraries+to+Define+Novel+Substrates+for+Functional+Hepatocytes+with+Inducible+Drug+Metabolism.">Unbiased Screening of Polymer Libraries to Define Novel Substrates for Functional Hepatocytes with Inducible Drug Metabolism.</a> Stem Cell Research. 6, 92-101 (2011).</li><li>Payne, C. M., Samuel, K., Pryde, A., King, J., Brownstein, D., Schrader, J., Medine, C. N., Forbes, S. J., Iredale, J. P., Newsome, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistence+of+Functional+Hepatocyte+Like+Cells+in+Immune+Compromised+Mice.">Persistence of Functional Hepatocyte Like Cells in Immune Compromised Mice.</a> Liver International. 31, 254-262 (2011).</li><li>Greenhough, S., Medine, C., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+Stem+Cell+Derived+Hepatocyte+Like+Cells+and+their+Potential+in+Toxicity+Screening.">Pluripotent Stem Cell Derived Hepatocyte Like Cells and their Potential in Toxicity Screening.</a> Toxicology. 278, 250-255 (2010).</li><li>Medine, C. N., Greenhough, S., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Stem+Cell+Derived+Hepatic+Endoderm+in+Human+Drug+Discovery.">The Role of Stem Cell Derived Hepatic Endoderm in Human Drug Discovery.</a> Biochemical Society Transactions. 38, 1033-1036 (2010).</li><li>Hannoun, Z., Fletcher, J., Greenhough, S., Medine, C. N., Samuel, K., Sharma, R., Pryde, A., Black, J. R., Ross, J. A., Wilmut, I., Iredale, J. P., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Comparison+between+Conditioned+Media+and+Serum+Free+Media+in+Human+Embryonic+Stem+Cell+Culture+and+Differentiation.">The Comparison between Conditioned Media and Serum Free Media in Human Embryonic Stem Cell Culture and Differentiation.</a> Cellular Reprogramming. 12, 133-140 (2010).</li><li>Dalgetty, D. M., Medine, C., Iredale, J. P., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+and+Future+Challenges+in+Stem+Cell-Derived+Liver+Technologies.">Progress and Future Challenges in Stem Cell-Derived Liver Technologies.</a> American Journal of Physiology - Gastrointestinal and Liver Physiology. 297, 241-248 (2009).</li><li>Hay, D. C., Fletcher, J., Payne, C., Terrace, J. D., Gallagher, R. C. J., Snoeys, J., Black, J., Wojtacha, D., Samuel, K., Hannoun, Z., Pryde, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Efficient+Differentiation+of+hESCs+to+Functional+Hepatic+Endoderm+Requires+ActivinA+and+Wnt3a+Signalling.">Highly Efficient Differentiation of hESCs to Functional Hepatic Endoderm Requires ActivinA and Wnt3a Signalling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 12301-12306 (2008).</li><li>Fletcher, J., Cui, W., Samuels, K., Black, J. R., Currie, I. S., Terrace, J. D., Payne, C., Filippi, C., Newsome, P., Forbes, S. J., Ross, J. A., Iredale, J. P., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Inhibitory+Role+of+Stromal+Cell+Mesenchyme+on+Human+Embryonic+Stem+Cell+Hepatocyte+Differentiation+is+Overcome+by+Wnt3a+Treatment.">The Inhibitory Role of Stromal Cell Mesenchyme on Human Embryonic Stem Cell Hepatocyte Differentiation is Overcome by Wnt3a Treatment.</a> Cloning and Stem Cells. 10, 331-340 (2008).</li></ol>

Vi har utvecklat en enkel, enhetlig och mycket reproducerbar in vitro-modell för att skapa skalbara nivåer av mänsklig HLCs. Vår modell har godkänts av ett antal externa samverkande laboratorier. Vi karakteriserar rutinmässigt stamceller härstammar HLCs använda vår i huset verktygslåda av utvecklingsstörningar markörer och lever specifika funktionella tester (varav de flesta kommersiellt tillgängliga). Den kritiska steg i vår process är: underhåll av stamceller pluripotens, förmågan att styra ...

Matrigel beläggning tallrikar och flaskor <ol><li> Matrigel (10 ml, BD Biosciences, Storbritannien), förvara vid -20 ° C. </li><li> KO-DMEM (500 ml, Gibco, Invitrogen, Storbritannien), förvaras vid 4 ° C. </li><li> Vävnadskultur plattor (6 bra, 12 bra, Corning, Storbritannien) </li><li> Vävnadskultur kolv (25 cm2 ventilerade, Corning, Storbritannien) </li></ol> hESC Underhåll <ol><li> Mus embryonala fibroblast betingad medium (MEF-CM) (100 ml, R &amp; D Systems, USA), förvara vid -20 ° C. </li><li> BSA-lösning (50 ml, Sigma Aldrich, Förenade kungariket), förvaras vid 4 ° C. </li><li> Mänskliga grundläggande fibroblast tillväxtfaktor (100 mikrogram, Peprotech, USA), förvara vid -20 ° C. </li></ol> Passaging hESCs med kollagenas <ol><li> Sammanflytande bra eller flaska hESCs. </li><li> Matrigel brunnarna eller flaskor som är lämpligt. </li><li> Fosfatsyntasgen saltlösning (-MgCl 2,-CaCl 2) (500 ml, Gibco, Invitrogen, Storbritannien), förvara i rumstemperatur. </li><li> Kollagenas IV (1 g, Gibco, InvitrOgen, Storbritannien), förvaras vid 4 ° C. </li><li> Mus embryonala fibroblast betingad medium (MEF-CM) (100 ml, R &amp; D Systems, USA). </li><li> Mänskliga grundläggande fibroblast tillväxtfaktor (100 mikrogram, Peprotech, USA). </li></ol> Differentiering av hESCs till nedsatt endoderm <ol><li> RPMI 1640 (500 ml, Gibco, Invitrogen, Storbritannien), förvaras vid 4 ° C. </li><li> B27 Supplement (10 ml, Gibco, Invitrogen, Storbritannien), förvara vid -20 ° C. </li><li> Activin A (2 mikrogram, Peprotech, USA), förvara vid -20 ° C. </li><li> Rekombinant mus Wnt3a (2 mikrogram, FoU Systems, USA), förvara vid -20 ° C. </li><li> KO-DMEM (500 ml, Gibco, Invitrogen, Storbritannien), förvaras vid 4 ° C. </li><li> KO-SR (500 ml, Gibco, Invitrogen, Storbritannien), förvara vid -20 ° C. </li><li> Icke-essentiella aminosyror (100 ml, Gibco, Invitrogen, Storbritannien), förvaras vid 4 ° C. </li><li> β-Mercaptoethanol (10 ml, Gibco, Invitrogen, Storbritannien), förvaras vid 4 ° C. </li><li> DMSO (Sigma Aldrich, Förenade kungariket), förvara i rumstemperatur </li><li> Leibovitz L-15 odlingsmedium (500 ml, Sigmen Aldrich, Storbritannien), förvaras vid 4 ° C. </li><li> Tryptos fosfat buljong (100 ml, Sigma Aldrich, Förenade kungariket), förvaras vid 4 ° C. </li><li> Fetal bovint serum, värmeinaktiverad (500 ml, Gibco, Invitrogen, Storbritannien), förvara vid -20 ° C. </li><li> Hydrokortison 21-hemisuccinate (100 mg, Sigma Aldrich, Förenade kungariket), förvara vid -20 ° C. </li><li> Insulin (bovin bukspottkörteln) (100 mg, Sigma Aldrich, Förenade kungariket), förvara vid -20 ° C. </li><li> L-glutamin (100 ml, Gibco, Invitrogen, Storbritannien), förvara vid -20 ° C. </li><li> Askorbinsyra (25 g, Sigma Aldrich, Förenade kungariket), förvara vid -20 ° C. </li><li> Mänskliga HGF (10 mikrogram, Peprotech, USA), förvara vid -20 ° C. </li><li> Rekombinant humant Oncostatin M (OSM) (50 mikrogram, FoU Systems, USA), förvara vid -20 ° C. </li><li> Spruta drivna filter 0,22 ìm (Millipore, Storbritannien) </li></ol> Karakterisering av hESC härrör Lever endoderm Immunfärgning <ol><li> Fosfatbuffert saltlösning (-MgCl 2,-CaCl 2) (500 ml, Gibco, Invitrogen, Förenade kungariket), store vid rumstemperatur. </li><li> PBST, PBS gjort upp med 0,1% Tween 20 (Sigma-Aldrich, Storbritannien). </li><li> Paraformaldehyd (PFA) (Sigma-Aldrich, Storbritannien) består i PBS, lagra -20 ° C. </li><li> Glycerol (Sigma-Aldrich, Storbritannien), förvara i rumstemperatur. </li><li> Tris Base (Sigma-Aldrich, Storbritannien), förvara i rumstemperatur. </li><li> Etanol </li><li> Serum (ABD Serotech, Storbritannien), förvara vid -20 ° C. </li><li> Sekundär antikropp, Alexa fluoroforer (molekylära sonder, Invitrogen, Storbritannien). </li><li> MOWIOL 4-88 (Polysciences Inc, USA) består i Tris HCl och glycerol enligt tillverkarens anvisningar. DAPI (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Storbritannien) läggs till MOWIOL lösning vid en 1:1000 spädning. </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> Primära antikroppar </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Antigen * </td><td> Typ </td><td> Leverantör </td><td> Utspädning </td></tr><tr><td> ALB </td><td> Monoklonala </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 1 / 500 </td></tr><tr><td> E-cadherin </td><td> Monoklonala </td><td> Millipore </td><td> 1 / 100 </td></tr><tr><td> α-fetoprotein </td><td> Monoklonala </td><td> Sigma </td><td> 1 / 500 </td></tr><tr><td> SSEA-4 FITC </td><td> Monoklonala </td><td> Biolegend </td><td> 1 / 100 </td></tr><tr><td> IgG </td><td> Monoklonala </td><td> DAKO </td><td> 1 / 500 </td></tr><tr><td colspan="2"> Sekundära antikroppar </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Anti-mus-FITC-konjugat </td><td> Goat Monoklonala </td><td> Invitrogen </td><td> 1 / 400 </td></tr></tbody></table> Tabell 2. Antikropparna som används för hESC härrör nedsatt endoderm immunfärgning, de koncentrationer som används, de arter som utvecklats i och bolagen köps från. Funktionell analys av nedsatt endoderm och Normalisering (per mg protein) <ol><li> P4-GLO CYP3A4, CYP1A2, Kits och luminometer (Promega, USA). </li><li value="1"> Vit platta botten 96 bra analys platta (BD Biosciences, Storbritannien). </li><li> BCA Assay Kit (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Storbritannien). </li><li> Transparent 96 bra analys platta (Iwaki, Storbritannien) </li></ol>

robust generation of hepatocyte-like cells from human embryonic stem cell populations

Trots framsteg i modellera människans läkemedelstoxicitet, många föreningar misslyckas under kliniska prövningar på grund av oförutsedda biverkningar. Kostnaden för kliniska studier är betydande, därför är det viktigt att mer prediktiva toxikologi skärmar utvecklas och distribueras tidigt i läkemedelsutveckling (Greenhough et al 2010). Humana hepatocyter representerar det nuvarande guldmyntfoten modell för utvärdering läkemedelstoxicitet, men är en begränsad resurs som uppvisar varierande funktion. Därför är användningen av förevigat cellinjer och djurmodeller vävnad rutinmässigt används på grund av sitt överflöd. Även om båda källorna är informativa, de är begränsade av dålig funktion, arter variabilitet och / eller instabilitet i kultur (Dalgetty et al 2009). Pluripotenta stamceller (PSC) är ett attraktivt alternativ källa av mänskliga hepatocyte liknande celler (HLCs) (Medine et al 2010). PSC kan självförnyelse och differentiering till alla somatiska celltyper som finns i vuxna och därmed representeraren potentiellt outtömlig källa av differentierade celler. Vi har utvecklat ett förfarande som är enkel, mycket effektiv, mottagliga för automatisering och ger funktionella mänskliga HLCs (Hay et al 2008; Fletcher et al 2008; Hannoun et al 2010; Payne et al 2011 och Hay et al 2011). Vi tror att vår teknologi kommer att leda till skalbar produktion av HLCs för läkemedelsutveckling, sjukdom modellering, konstruktion av extra fysiska enheter och eventuellt cellbaserade terapier transplantation.

Watch this Scientific Journal Video about Robust Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Embryonic Stem Cell Populations at JoVE.com

Robust Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Embryonic Stem Cell Populations

Denna artikel kommer att fokusera på skapandet av mänskliga nedsatt endoderm från mänskliga embryonala populationer stamceller.

Robust generationens Hepatocyte-liknande celler från mänskliga embryonala patientgrupper Stem Cell

Despite progress in modelling human drug toxicity, many compounds fail during clinical trials due to unpredicted side effects. The cost of clinical ...

Research

JoVE Journal

Biology

Propagation of Human Embryonic Stem (ES) Cells

Propagation of Human Embryonic Stem ES Cells

Spridning av mänskliga embryonala stamceller (ES-celler)

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

Härledning av hematopoetiska stamceller från Murine embryonala stamceller

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

Derivering av mänskliga embryonala stamceller genom Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

Kromatin Immunoprecipitation från mänskliga embryonala stamcellslinjer

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are ...

Generation of Human CD40-activated B cells

Generering av Human CD40-aktiverade B-celler

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Differentiering av embryonala stamceller till Oligodendrocyte Prekursorer

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation

Ödet Kartläggning av mänskliga embryonala stamcellslinjer som Teratom Bildning

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three ...

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Effektiv Derivering av mänskliga Hjärtat prekursorer och Cardiomyocytes från Pluripotenta mänskliga embryonala stamcellslinjer med liten molekyl Induktion

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Rapid Fibroblast Removal from High Density Human Embryonic Stem Cell Cultures

Snabb Fibroblast Borttagning med hög densitet mänskliga embryonala stamcellskulturer

Mouse embryonic fibroblasts (MEFs) were used to establish human embryonic stem cells (hESCs) cultures after blastocyst isolation1. This feeder system ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

Generering av möss härledda från inducerade pluripotenta stamceller

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...