Name: long-term culture of human breast cancer specimens and their analysis using optical projection tomography
Uploaded: 2011-07-29T13:00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Long-term Culture of Human Breast Cancer Specimens and Their Analysis Using Optical Projection Tomography at JoVE.com

Vi tackar Lorna Renshaw (Edinburgh Breast Unit) för hennes ovärderliga hjälp med att få kliniska prover. Användning av tumörvävnad godkändes av Lothian forskningsetiska kommittén (08/S1101/41) och som erhållits under beskydd av experimentell cancermedicin Centre programmet (Edinburgh). Detta arbete stöds av den skotska Finansiering rådet. ADL är en miss Margaret Butters Reekie Lita kliniska kolleger.

1. Extrahera kollagen från skolästfiskar <ol><li> Placera frysta färska skolästfiskar i 70% etanol. </li><li> Deglove den överliggande huden med en skalpell utsätta senor. </li><li> Strip senor bort från svansen och placera i 70% etanol för att sterilisera. </li><li> Väg in senor och transfer till ättiksyra (1g senan till 250ml 0,5 ättiksyra). Blanda 48hr vid 4 ° C. </li><li> Centrifugera senan / ättiksyra blandas vid 10000 g under 30min och kasta pelleten. </li><li> Tillsätt en motsvarande volym på 10% (w / v) NaCl till supernatanten och låt blandningen stå över natten vid 4 ° C. </li><li> Samla kollagen-rika, olösliga understa lagret och centrifugat i ytterligare 30 min vid 10000 g. </li><li> Resuspendera kollagen-rika material i 0,25 m ättiksyra vid 4 ° C och dialysera mot 1:1000 ättiksyra vid 4 ° C under 3 dagar, byte av dialys bufferten två gånger dagligen. </li><li> Ytterligare sterilisera kollagen lösningen genom centrifugering (20.000 g för 2hr) och förvara vid 4 ° C. </li><li> Späd kollagen behov med tillägg av sterila 1:1000 ättiksyra ett bestånd koncentration av 1mg/ml. </li></ol> 2. 3D-analys Creation 3D-analysen är baserad på en cellinje analys, som publicerades tidigare 2. <ol><li> Flera kärna biopsier skördas från samtycker patienter vid kurativ kirurgisk resektion för invasiv bröstcancer. </li><li> Genom ögat, dela upp kärnorna med en skalpell i 1mm 3 fragment. Trim och kasta makroskopiskt distinkt fett. </li><li> Doppa bitarna i MEGM Komplett medier. Vävnaden kan lagras i detta tillstånd i upp till 1 timme. </li><li> För att skapa kollagen gel, blanda på is 1mg/ml råtta svans kollagen, till 1:1000 filtreras ättiksyra, 10x DMEM/F12 och 0.22M NaOH i förhållandet 3:5:1:1 skapa en slutlig kollagen koncentration av 0,3 mg / ml. </li><li> Injicera 1,2 ml av kollagen blandningen i enskilda brunnar i en 24 brunnar och placera i en inkubator vid 37 ° C i 10min att inleda geleringsmedel. </li><li> Efter 10min, ta ut 24 bra plattan från kuvösen. Placera tumören bitarna vidare till geleringsmedel kollagen och tryck försiktigt in dem till mitten av gelen med hjälp av en 10μl pipettspetsen. Returnera 24 brunnar till inkubatorn för 1 timme. </li><li> För ER + tumörer, komplettera MEGM Komplett media med β-östradiol till en koncentration av 3.2x10 -10 M. När gelen tester har geléartad för 1 timme, tillsätt försiktigt 1,2 ml av den kompletteras medier i varje brunn. Den slutliga β-östradiol koncentration analysen kommer equilibriate att 1.6x10 -10 M sammanfatta fysiologiska östrogen nivåer som finns i bröstvävnad 3. </li><li> Kör en 10μl pipettspets runt innerkanten av varje brunn, frigöra varje gel runt om, så att varje gel att flyta fritt inom media. Returnera 24 brunnar till inkubatorn. </li><li> Börsen kompletteras media två gånger per vecka tills uppsägning av experimentet. Avsluta experimentet genom att ta bort media och lägga till en formalin fixativ. </li></ol> 3. Antikropp Infärgning av analys som förberedelse för Optisk Projektions Tomografi Vi har antagit en tidigare publicerad metod för hela urvalet färgning 4. <ol><li> Tvätta formalin fasta prover för 30min i PBS. Torka av geler stegvis i metanol som spätts i PBS som innehåller 0,05% Tween 20 (0,05% PBST): 33%, 66% och 100% för ≥ 15 min vid varje steg. </li><li> Inkubera vävnaden i nyberedda MeOH: DMSO: 30% H 2 O 2 i förhållandet 2:01:03 (15% v / v H 2 O 2) i rumstemperatur i 24 tim för att släcka autofluorescens. </li><li> Tvätta prov två gånger för 30min i metanol. Frysa proverna till -80 ° C fem gånger för åtminstone 1 timme varje gång och tillbaka till rumstemperatur (RT) för att säkerställa att antigener i de djupare delarna av vävnad är kan göras tillgängligt. </li><li> Rehydrera vävnaden tillbaka till 0,05% PBST med metanol som lösningsmedel (33%, 66% och 100% för 15min vid varje steg). </li><li> Blockera vävnad i blockerande lösningen (10% serum i 0,05% PBST) för 24h. </li><li> Inkubera vävnaden med primär antikropp för att identifiera de epiteliala innehåll, med kanin anti-Cytokeratin vid en koncentration av 1:500 utspädd i 1,5 ml för att blockera lösning som innehåller 5% DMSO för 48hr. </li><li> Tvätta prov fyra gånger med 0,05% PBST för 30min vardera. </li><li> Inkubera vävnaden med fluorescerande sekundär antikropp (1:100 get anti-kanin Alexa555), utspädd i 1,5 ml blockerande lösningen innehåller 5% DMSO för 48hr. </li><li> Tvätta proverna igen med 0,05% PBST fyra gånger för 30min vardera. </li></ol> 4. Optisk Projektions Tomografi Optisk projektion tomografi är en mikroskopi teknik som tidigare utvecklats för att producera högupplösta 3D-bilder av fluorescerande biologiska prover med en tjocklek på upp till 15 millimeter 5. <ol><li> Montera sbehållas gel i 1% låg smältpunkt agaros och torka i 100% metanol för 24h. Rensa förlagan i Babb lösning (01:02 Bensylalkohol, bensylbensoat) för 48hr och skanna med hjälp av OPT 3001M Scanner (Bioptonics). </li><li> Både mål och autofluorescens har tagits med de Cy3 filtret set (Exciter 545nm/30 nm, emitter 610/75 nm) och GFP1 filter set (Exciter 425nm/40 nm, emitter LP475 nm) respektive. </li></ol> 5. Återuppbyggnad och 3D-kvantifiering <ol><li> Uppsättningen av kantiga prognoser förvärvades av OPT kan rekonstrueras med hjälp av NRecon programvara (SkyScan) för att skapa en serie av tvärsnitt skär genom invasionen analysen. Denna programvara finns att ladda ned gratis på <a href="http://www.skyscan.be/products/downloads.htm">http://www.skyscan.be/products/downloads.htm</a> . </li><li> Analysera rekonstruerade data med hjälp av Volocity programvara (PerkinElmer). Gratis demonstration programvara är tillgänglig för nedladdning på <a href="http://www.cellularimaging.com/products/Volocity/demo/">http://www.cellularimaging.com/products/Volocity/demo/</a> . </li><li> För att kvantifiera epiteliala volym genom Cytokeratin färgning, fastställa en lägsta Voxel intensitet tröskeln för att minska störningar från bakgrunden fluorescens i målet kanal. Vi definierade denna tröskel empiriskt på 9000 au enligt en lista med tillgängliga parametrar i mätningen ansökan, kvantifieras vi volymen av epitel i kontinuitet med den ursprungliga kärnan (avgränsade i autofluorescent kanalen). Detta gjorde det möjligt för oss att kvantifiera volymerna av epitelceller utväxt mellan olika tumörprover. </li></ol> 6. Representativa resultat: Under utvecklingen av analysen, totalt 52 bröstcancer biopsi prover med ett brett utbud av histopatologi använts. Av dessa &lt;10% (5 / 52) misslyckades med att tillhandahålla minst ett livskraftigt invasion analys. Analysen felet berodde på antingen bakteriell supra-infektion eller otillräcklig tumör biopsimaterial. Därför tillämpning av analysen inte begränsas till en viss subtyp av bröstcancer. Typiska tester (figur 1) fast efter 20 dagar i kollagen kultur och därefter färgas för Cytokeratin. Volocity programvara kan känna igen både epiteliala delen kontinuerligt med den ursprungliga kärnan och fristående grupper av invaderande celler och kvantifiera varje volym separat. <img src="/files/ftp_upload/3085/3085fig1.jpg" alt="Figur 1" /> Figur 1. Invasion analyser efter fixering och kvantifiering. Analysen stöder prover från flera olika subtyper bröstcancer: a) ER + b) HER2 + och c) ER-.

<ol>
	<li>Lopez-Garcia, M. A., Geyer, F. C., Lacroix-Triki, M., Marchio, C., Reis-Filho, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+cancer+precursors+revisited:+molecular+features+and+progression+pathways.+Histopathology.">Breast cancer precursors revisited: molecular features and progression pathways. Histopathology.</a> 57, 171-192 (2010).</li><li>Sabeh, F., Shimizu-Hirota, R., Weiss, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protease-dependent+versus+-independent+cancer+cell+invasion+programs:+three-dimensional+amoeboid+movement+revisited.">Protease-dependent versus -independent cancer cell invasion programs: three-dimensional amoeboid movement revisited.</a> J Cell Biol. 185, 11-19 (2009).</li><li>Dabrosin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+extracellular+local+levels+of+estradiol+in+normal+breast+in+vivo+during+the+luteal+phase+of+the+menstrual+cycle.">Increased extracellular local levels of estradiol in normal breast in vivo during the luteal phase of the menstrual cycle.</a> J Endocrinol. 187, 103-108 (2005).</li><li>Alanentalo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tomographic+molecular+imaging+and+3D+quantification+within+adult+mouse+organs.">Tomographic molecular imaging and 3D quantification within adult mouse organs.</a> Nat Methods. 4, 31-33 (2007).</li><li>Sharpe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+projection+tomography+as+a+tool+for+3D+microscopy+and+gene+expression+studies.">Optical projection tomography as a tool for 3D microscopy and gene expression studies.</a> Science. 296, 541-545 (2002).</li><li>Hidalgo-Carcedo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+cell+migration+requires+suppression+of+actomyosin+at+cell-cell+contacts+mediated+by+DDR1+and+the+cell+polarity+regulators+Par3+and+Par6.">Collective cell migration requires suppression of actomyosin at cell-cell contacts mediated by DDR1 and the cell polarity regulators Par3 and Par6.</a> Nat Cell Biol. 13, 49-58 (2011).</li><li>Katz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gene+on+the+HER2+amplicon,+C35,+is+an+oncogene+in+breast+cancer+whose+actions+are+prevented+by+inhibition+of+Syk.">A gene on the HER2 amplicon, C35, is an oncogene in breast cancer whose actions are prevented by inhibition of Syk.</a> Br J Cancer. 103, 401-410 (2010).</li><li>Timpson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+Regulation+of+RhoA+Activity+during+Pancreatic+Cancer+Cell+Invasion+Driven+by+Mutant+p53.">Spatial Regulation of RhoA Activity during Pancreatic Cancer Cell Invasion Driven by Mutant p53.</a> Cancer Res. 71, 747-757 (2011).</li></ol>

SEW och JF är anställda av MRC Technology, som är kommersialisera Bioptonics OPT skannrar. Andra författare förklarar ingen intressekonflikt.

Kollagen-baserade analyser för att studera beteende cancercellinjer är nu allmänt används 6,7,8. Icke desto mindre har dessa tester återspeglas inte fullt ut komplexiteten av tumören och dess miljö. I denna studie visar vi att mänskliga bröstcancer material kan användas på ett liknande sätt, ex vivo. Dessutom är OPT ett användbart verktyg för att karakterisera 3D utbyggnaden av bröstcancer. Vi fann att den främsta begränsningen av denna teknik är tillgången på tumören material (en enkel kärna biopsi räcker för 4-6 analyser). En annan begränsande faktor är att de strukturella invasionen förekommer endast i cirka 40% av analyser. För att lösa detta lägger vi regelbundet önskad behandling runt dag 7 till alla analyser med synlig tillväxt. Användningen av OPT skulle kunna utvidgas i framtiden för att också upptäcka bulk förändringar, ex vivo, till följd av läkemedelsbehandling. Detta i sin tur kan underlätta en mer individualiserad cancerbehandling, oberoende av djurmodeller. Vi är för närvarande undersöker svar ER + tumörer med tamoxifen ex vivo.

<table border="1"><tbody><tr><td> Namn på Reagens </td><td> Företag </td><td> Katalog Nr </td></tr><tr><td> MEGM Komplett </td><td> Lonza </td><td> CC-3150 </td></tr><tr><td> DMEM/F12 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D8900 10X1L </td></tr><tr><td> β-östradiol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E8875-250mg </td></tr><tr><td> Kanin anti-Cytokeratin </td><td> Dako </td><td> Z0622 </td></tr><tr><td> Get-anti-kanin Alexa555 </td><td> Invitrogen </td><td> A21422 </td></tr></tbody></table> Alla andra standardreagens erhölls från Sigma-Aldrich.

long-term culture of human breast cancer specimens and their analysis using optical projection tomography

Bröstcancer är en ledande orsak till dödlighet i västvärlden. Det är väletablerat att spridningen av bröstcancer, först lokalt och sedan distalt, är en viktig faktor i patientens prognos. Experimentella system av bröstcancer är beroende av cellinjer vanligen erhålls från primära tumörer eller pleurautgjutning. Två stora faktorer som hindrar denna forskning: (i) vissa kända subtyper av bröstcancer (särskilt dålig prognos luminala B tumörer) inte är representerade inom aktuell rad samlingar, (ii) påverkan av tumören mikromiljön normalt inte beaktas. Vi visar en teknik för att kultur primär exemplar bröstcancer av alla subtyper. Detta uppnås genom att använda tredimensionella (3D) kultur system där små bitar av tumör är inbäddade i mjukt råtta kollagen jag kuddar. Inom 2-3 veckor, tumörceller sprids i kollagen och bildar olika strukturer som liknar dem som observerats i mänskliga tumours1. Livskraftiga adipocyter var epitelceller och fibroblaster i den ursprungliga kärnan tydligt på histologi. Maligna epitelceller med squamoid morfologi visades invadera i den omgivande kollagen. Nuclear pleomorphism visade sig inom dessa celler, tillsammans med mitotiska siffror och apoptotiska kroppar. Vi har anställt Optical Projection Tomography (OPT), en 3D-röntgen teknik, i syfte att kvantifiera omfattningen av tumören sprida sig i kulturen. Vi har använt OPT att mäta huvuddelen volymen av tumören kultur, en parameter mäts rutinmässigt under neo-adjuvant behandling av bröstcancerpatienter att bedöma svaret på läkemedelsbehandling. Här presenterar vi en möjlighet att kultur humana brösttumörer utan subtyp partiskhet och kvantifiera spridningen av dem ex vivo. Denna metod skulle kunna användas i framtiden för att kvantifiera drog känslighet i ursprungliga tumören. Detta kan ge en mer prediktiv modell än som för närvarande används cellinjer.

Watch this Scientific Journal Video about Long-term Culture of Human Breast Cancer Specimens and Their Analysis Using Optical Projection Tomography at JoVE.com

Long-term Culture of Human Breast Cancer Specimens and Their Analysis Using Optical Projection Tomography

Vi har utvecklat en kollagenbaserade<em&gt; In vitro</em&gt; Analysen som främjar spridning och invasion från prover av alla subtyper bröstcancer. Optisk Projection Tomography, en tredimensionell mikroskopi teknik användes för att visualisera och kvantifiera tumörens expansion. Denna analys kan användas för att kvantifiera drogen svar av enskilda tumörprover.

Långsiktig kultur för mänskliga Prover bröstcancer och deras analys Använda optisk Projection Tomography

Breast cancer is a leading cause of mortality in the Western world. It is well established that the spread of breast cancer, first locally and later ...

Research

JoVE Journal

Biology

Long-term Imaging Mammalian Cells using Wide-Field Microscopy

Långsiktiga Imaging däggdjursceller med Wide-området mikroskopi

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

En Neuronal och astrocyternas Co-Kultur-analys för High innehållsanalys av Neurotoxicitet

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Born Normalization for Fluorescence Optical Projection Tomography for Whole Heart Imaging

Född Normalisering för fluorescens Optical Projection Tomography för hela hjärtat Imaging

Optical projection tomography is a three-dimensional imaging technique that has been recently introduced as an imaging tool primarily in developmental ...

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin

Isolering och odling av vuxna Epithelial stamceller från mänskliga Skin

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate ...

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Ex vivo Kultur av primära humana äggledaren epitelceller

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Långsiktig Dödligt toxicitetstest med Crustacean Artemia franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

Serial Enrichment of Spermatogonial Stem and Progenitor Cells (SSCs) in Culture for Derivation of Long-term Adult Mouse SSC Lines

Serial Enrichment of Spermatogonial Stem and Progenitor Cells SSCs in Culture for Derivation of Long-term Adult Mouse SSC Lines

Seriell Anrikning av spermatogoniala stam-och stamfaderceller (SSC) i Kultur för Härledning av långfristiga SSC vuxen mus Lines

Spermatogonial stem and progenitor cells (SSCs) of the testis represent a classic example of adult mammalian stem cells and preserve fertility for nearly ...

Detecting Somatic Genetic Alterations in Tumor Specimens by Exon Capture and Massively Parallel Sequencing

Upptäcka Somatiska genetiska förändringar i tumörprover från Exon Capture och Massively Parallel sekvense

Efforts  to detect and investigate key oncogenic mutations have proven valuable to  facilitate the appropriate treatment for cancer patients. The ...

Multilayer Mounting for Long-term Light Sheet Microscopy of Zebrafish

Multilayer Montering för Långsiktigt Ljus ark Mikroskopi av Zebrafish

Light sheet microscopy is the ideal imaging technique to study zebrafish embryonic development. Due to minimal photo-toxicity and bleaching, it is ...

Isolation, Transfection, and Long-Term Culture of Adult Mouse and Rat Cardiomyocytes

Isolering, Transfection, och långsiktig kultur av vuxna Mus och Råtta Cardiomyocytes

Ex vivo culture of the adult mammalian cardiomyocytes (CMs) presents the most relevant experimental system for the in vitro study of cardiac biology. ...