Name: biophysical assays to probe the mechanical properties of the interphase cell nucleus: substrate strain application and microneedle manipulation
Uploaded: 2011-09-14T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Biophysical Assays to Probe the Mechanical Properties of the Interphase Cell Nucleus: Substrate Strain Application and Microneedle Manipulation at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par le National Institutes of Health (R01 et R01 HL082792 NS059348) et le Brigham and Women Award de l&#39;Hôpital de cardiologie Leadership Group.

1. L&#39;application de contrainte Substrat La mesure de la déformation nucléaire normalisée inclut la préparation de plats souche avec transparence, membranes en silicone élastique que la surface de culture de cellules, cellules plaquage sur la vaisselle, et d&#39;acquérir des images des cellules, avant, pendant et après l&#39;application de contrainte (uniaxial ou biaxial). Préparation de plats membrane en silicone et l&#39;adhérence des cellules <ol><l...

<ol>
	<li>Friedl, P., Wolf, K., Lammerding, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+mechanics+during+cell+migration.">Nuclear mechanics during cell migration.</a> Curr Opin Cell Biol. 23, 55-64 (2011).</li><li>Mejat, A., Misteli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LINC+complexes+in+health+and+disease.">LINC complexes in health and disease.</a> Nucleus. 1, 40-52 (2010).</li><li>Worman, H. J., Fong, L. G., Muchir, A., Young, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminopathies+and+the+long+strange+trip+from+basic+cell+biology+to+therapy.">Laminopathies and the long strange trip from basic cell biology to therapy.</a> J Clin Invest. 119, 1825-1836 (2009).</li><li>Caille, N., Tardy, Y., Meister, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+strain+field+in+endothelial+cells+subjected+to+uniaxial+deformation+of+their+substrate.">Assessment of strain field in endothelial cells subjected to uniaxial deformation of their substrate.</a> Ann Biomed Eng. 26, 409-416 (1998).</li><li>Lammerding, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lamins+A+and+C+but+not+lamin+B1+regulate+nuclear+mechanics.">Lamins A and C but not lamin B1 regulate nuclear mechanics.</a> J Biol Chem. 281, 25768-25780 (2006).</li><li>Lammerding, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+nuclear+shape+and+impaired+mechanotransduction+in+emerin-deficient+cells.">Abnormal nuclear shape and impaired mechanotransduction in emerin-deficient cells.</a> J Cell Biol. 170, 781-791 (2005).</li><li>Lammerding, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lamin+A/C+deficiency+causes+defective+nuclear+mechanics+and+mechanotransduction.">Lamin A/C deficiency causes defective nuclear mechanics and mechanotransduction.</a> J Clin Invest. 113, 370-378 (2004).</li><li>Verstraeten, V. L., Ji, J. Y., Cummings, K. S., Lee, R. T., Lammerding, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+mechanosensitivity+and+nuclear+stiffness+in+Hutchinson-Gilford+progeria+cells:+effects+of+farnesyltransferase+inhibitors.">Increased mechanosensitivity and nuclear stiffness in Hutchinson-Gilford progeria cells: effects of farnesyltransferase inhibitors.</a> Aging Cell. 7, 383-393 (2008).</li><li>Brooks, S. V., Zerba, E., Faulkner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injury+to+muscle+fibres+after+single+stretches+of+passive+and+maximally+stimulated+muscles+in+mice.">Injury to muscle fibres after single stretches of passive and maximally stimulated muscles in mice.</a> J Physiol. 488, 459-469 (1995).</li><li>Maniotis, A. J., Chen, C. S., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demonstration+of+mechanical+connections+between+integrins,+cytoskeletal+filaments,+and+nucleoplasm+that+stabilize+nuclear+structure.">Demonstration of mechanical connections between integrins, cytoskeletal filaments, and nucleoplasm that stabilize nuclear structure.</a> Proc Natl Acad Sci. 94, 849-854 (1997).</li></ol>

Dosage de souche Substrat L&#39;application souche a été utilisée avec succès par nous et d&#39;autres groupes pour étudier les déformations induites nucléaire dans des cellules soumises à des contraintes mécaniques et à enquêter sur la contribution des protéines spécifiques de l&#39;enveloppe nucléaire à la rigidité nucléaires. 4-8 L&#39;avantage de cette technique est qu&#39;elle sondes propriétés mécaniques noyaux de vie dans leur environnement cellulaire et du...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom de réactif </td><td> Société </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> La fibronectine </td><td> Millipore </td><td> FC010 </td></tr><tr><td> Mitotracker Rouge FM et FM Vert </td><td> Invitrogen </td><td> M22425 et M-7514 </td></tr><tr><td> Hoechst 33342 </td><td> Invitrogen </td><td> H3570 </td></tr><tr><td> Hank Saline saline tamponnée </td><td> Invitrogen </td><td> 14185 </td></tr><tr><td> Phénol libre, DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 21063 </td></tr><tr><td> Sérum fœtal bovin </td><td> Aleken Biologicals </td><td> FBSS500 </td></tr><tr><td> Pénicilline / streptomycine </td><td> Sigma </td><td> P0781-100ML </td></tr><tr><td> Verre borosilicate avec filament </td><td> Instrument Sutter </td><td> BF100-78-10 </td></tr><tr><td> Gloss / Brillant feuilles de silicone non renforcé, 0,005 &quot; </td><td> Spécialité Manufacturing Inc </td><td></td></tr><tr><td> Phosphate de Dulbecco saline tamponnée </td><td> Invitrogen </td><td> 14200 </td></tr><tr><td> 35 mm plats en verre à fond la culture (FluoroDish) </td><td> World Precision Instruments, Inc </td><td> FD35-100 </td></tr><tr><td> Graisser Braycote vide 804 </td><td> Fournitures Spi </td><td> 05133A-AB </td></tr></tbody></table>

biophysical assays to probe the mechanical properties of the interphase cell nucleus: substrate strain application and microneedle manipulation

Dans la plupart des cellules eucaryotes, le noyau est le plus grand organite et est généralement de 2 à 10 fois plus rigide que le cytosquelette entourant, par conséquent, les propriétés physiques du noyau contribuer de manière significative au comportement global biomécanique de cellules dans des conditions physiologiques et pathologiques. Par exemple, dans la migration des neutrophiles et des cellules de cancer envahissant, de la raideur nucléaire peut constituer un obstacle majeur au cours d&#39;extravasation ou de passage dans des espaces étroits au sein des tissus. 1 D&#39;autre part, le noyau des cellules dans les tissus mécaniquement actives comme les muscles nécessite suffisamment de soutien structurel à résister aux contraintes mécaniques répétitives. Fait important, le noyau est étroitement intégré dans l&#39;architecture cellulaire, il est physiquement connecté au cytosquelette environnante, qui est une exigence essentielle pour le mouvement intracellulaire et le positionnement du noyau, par exemple, dans les cellules polarisées, les noyaux synaptiques au niveau des jonctions neuromusculaires, ou dans les cellules en migration. 2 Sans surprise, les mutations dans les protéines de l&#39;enveloppe nucléaire tels que les lamines et nesprins, qui jouent un rôle crucial dans la détermination de la raideur nucléaire et nucléo-cytosquelette d&#39;accouplement, il a été démontré récemment pour donner lieu à un certain nombre de maladies humaines, y compris d&#39;Emery- Dreifuss dystrophie musculaire, myopathie des ceintures dystrophie musculaire et une cardiomyopathie dilatée. 3 Pour étudier la fonction des divers biophysique des protéines de l&#39;enveloppe nucléaire et l&#39;effet de mutations spécifiques, nous avons développé des méthodes expérimentales pour étudier les propriétés physiques du noyau en version simple, les cellules vivantes soumis à des perturbations mécaniques globales ou localisées. Mesure des déformations induites nucléaire en réponse à la demande substrat souche justement appliquée fournissent des informations importantes sur la déformabilité du noyau et permet une comparaison quantitative entre les différentes mutations ou des lignées cellulaires déficientes pour les protéines spécifiques de l&#39;enveloppe nucléaire. Localisé application de souche du cytosquelette avec une micro-aiguille est utilisée pour compléter ce test et peuvent fournir des informations additionnelles sur la transmission intracellulaire vigueur entre le noyau et le cytosquelette. Etudier la mécanique nucléaire dans les cellules vivantes intactes préserve l&#39;architecture normale intracellulaire et évite les artefacts potentiels qui peuvent survenir lorsque vous travaillez avec des noyaux isolés. Par ailleurs, l&#39;application de contrainte substrat présente un bon modèle pour le stress physiologique expérimentés par des cellules dans les tissus musculaires ou autres (par exemple, cellules musculaires lisses vasculaires exposés à la souche du navire). Enfin, alors que ces outils ont été développés principalement pour étudier la mécanique nucléaire, ils peuvent également être appliquées pour étudier la fonction des protéines du cytosquelette et de signalisation mécanotransduction.

Watch this Scientific Journal Video about Biophysical Assays to Probe the Mechanical Properties of the Interphase Cell Nucleus: Substrate Strain Application and Microneedle Manipulation at JoVE.com

Biophysical Assays to Probe the Mechanical Properties of the Interphase Cell Nucleus: Substrate Strain Application and Microneedle Manipulation

Nous présentons deux indépendantes, basées sur le microscope des outils pour mesurer les déformations induites nucléaire et du cytosquelette dans la seule, vivant des cellules adhérentes en réponse à l&#39;application de déformation globale ou localisée. Ces techniques sont utilisées pour déterminer la rigidité nucléaire (ie, déformabilité) et de transmission de la force de sonde intracellulaire entre le noyau et le cytosquelette.

Tests biophysiques pour sonder les propriétés mécaniques du noyau cellulaire interphase: Application Strain Substrat et manipulation Microneedle

In most eukaryotic cells, the nucleus is the largest organelle and is typically 2 to 10 times stiffer than the surrounding cytoskeleton; consequently, the ...

Research

JoVE Journal

Biology

Mechanical Stimulation of Stem Cells Using Cyclic Uniaxial Strain

La stimulation mécanique des cellules souches en utilisant cyclique uniaxiale souche

The role of mechanical forces in the development and maintenance of biological tissues is well documented, including several mechanically regulated ...

Recherche

Biologie

Purification of the M. magneticum Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamA&Delta;41

Purification of the M. magneticum Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamAÃƒÅ½Ã¢â‚¬Â41

Purification de la M. magneticum Strain AMB-1 Protein magnétosome Associated MamAΔ41

Magnetotactic bacteria comprise a diverse group of aquatic microorganisms that are able to orientate themselves along geomagnetic fields. This behavior is ...

Photobleaching Assays (FRAP &amp; FLIP) to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Photobleaching Assays FRAP & FLIP to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Photobleaching essais (FRAP et FLIP) pour mesurer la dynamique des protéines de la chromatine dans Vivre cellules souches embryonnaires

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) enable the study of protein dynamics in living cells with ...

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

Pharmacologiques et des essais de génétique pour manipuler la régénération de l&#39;Planaires Japonica Dugesia</em

Free-living planarian flatworms have a long history of experimental usage owing to their remarkable regenerative abilities1. Small fragments excised from ...

Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

Capture d&#39;sélectif de 5-hydroxyméthylcytosine partir de l&#39;ADN génomique

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene ...

Super-resolution Imaging of the Bacterial Division Machinery

Super-resolution Imaging Division de la machinerie bactérienne

Bacterial cell division requires the coordinated  assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central  to this process is the formation of ...

Application of an In vitro DNA Protection Assay to Visualize Stress Mediation Properties of the Dps Protein

Application of an In vitro DNA Protection Assay to Visualize Stress Mediation Properties of the Dps Protein

Application d&#39;un<em&gt; In vitro</em&gt; DNA Assay Protection de bien visualiser les propriétés de médiation du stress de la protéine Dps

Oxidative stress is an unavoidable byproduct of  aerobic life.  Molecular oxygen is  essential for terrestrial metabolism, but it also takes part in many ...

The Cell-based L-Glutathione Protection Assays to Study Endocytosis and Recycling of Plasma Membrane Proteins

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes ...

Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs

PCR en temps réel basée sur une sonde Approches de mesure quantitative des microARN

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that ...

Sequential Application of Glass Coverslips to Assess the Compressive Stiffness of the Mouse Lens: Strain and Morphometric Analyses

Application séquentielle de verre Lamelles pour évaluer la compression Rigidité de l&#39;objectif de la souris: Strain et morphométriques Analyses

The eye lens is a transparent organ that refracts and focuses light to form a clear image on the retina. In humans, ciliary muscles contract to deform the ...