Name: biophysical assays to probe the mechanical properties of the interphase cell nucleus: substrate strain application and microneedle manipulation
Uploaded: 2011-09-14T12:00:00
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Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health (R01 e R01 HL082792 NS059348) e do Hospital Brigham and Women Award do Grupo de Liderança Cardiovascular.

1. Aplicação tensão substrato A medição da tensão nuclear normalizado inclui a preparação de pratos com tensão transparente, membranas de silicone elástico como a superfície de cultura de células, cultivo de células para os pratos, e aquisição de imagens das células antes, durante e depois (uniaxial ou biaxial) a aplicação de tensão. Preparação de pratos silicone membrana e adesão de células <ol><li> Cada prato consiste em um esforço feito ...

<ol>
	<li>Friedl, P., Wolf, K., Lammerding, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+mechanics+during+cell+migration.">Nuclear mechanics during cell migration.</a> Curr Opin Cell Biol. 23, 55-64 (2011).</li><li>Mejat, A., Misteli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LINC+complexes+in+health+and+disease.">LINC complexes in health and disease.</a> Nucleus. 1, 40-52 (2010).</li><li>Worman, H. J., Fong, L. G., Muchir, A., Young, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminopathies+and+the+long+strange+trip+from+basic+cell+biology+to+therapy.">Laminopathies and the long strange trip from basic cell biology to therapy.</a> J Clin Invest. 119, 1825-1836 (2009).</li><li>Caille, N., Tardy, Y., Meister, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+strain+field+in+endothelial+cells+subjected+to+uniaxial+deformation+of+their+substrate.">Assessment of strain field in endothelial cells subjected to uniaxial deformation of their substrate.</a> Ann Biomed Eng. 26, 409-416 (1998).</li><li>Lammerding, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lamins+A+and+C+but+not+lamin+B1+regulate+nuclear+mechanics.">Lamins A and C but not lamin B1 regulate nuclear mechanics.</a> J Biol Chem. 281, 25768-25780 (2006).</li><li>Lammerding, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+nuclear+shape+and+impaired+mechanotransduction+in+emerin-deficient+cells.">Abnormal nuclear shape and impaired mechanotransduction in emerin-deficient cells.</a> J Cell Biol. 170, 781-791 (2005).</li><li>Lammerding, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lamin+A/C+deficiency+causes+defective+nuclear+mechanics+and+mechanotransduction.">Lamin A/C deficiency causes defective nuclear mechanics and mechanotransduction.</a> J Clin Invest. 113, 370-378 (2004).</li><li>Verstraeten, V. L., Ji, J. Y., Cummings, K. S., Lee, R. T., Lammerding, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+mechanosensitivity+and+nuclear+stiffness+in+Hutchinson-Gilford+progeria+cells:+effects+of+farnesyltransferase+inhibitors.">Increased mechanosensitivity and nuclear stiffness in Hutchinson-Gilford progeria cells: effects of farnesyltransferase inhibitors.</a> Aging Cell. 7, 383-393 (2008).</li><li>Brooks, S. V., Zerba, E., Faulkner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injury+to+muscle+fibres+after+single+stretches+of+passive+and+maximally+stimulated+muscles+in+mice.">Injury to muscle fibres after single stretches of passive and maximally stimulated muscles in mice.</a> J Physiol. 488, 459-469 (1995).</li><li>Maniotis, A. J., Chen, C. S., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demonstration+of+mechanical+connections+between+integrins,+cytoskeletal+filaments,+and+nucleoplasm+that+stabilize+nuclear+structure.">Demonstration of mechanical connections between integrins, cytoskeletal filaments, and nucleoplasm that stabilize nuclear structure.</a> Proc Natl Acad Sci. 94, 849-854 (1997).</li></ol>

Ensaio de tensão substrato Aplicação cepa tem sido usada com sucesso por nós e outros grupos para estudar as deformações induzidas nuclear em células submetidas a estresse mecânico e investigar a contribuição das proteínas específicas envelope nuclear à rigidez nuclear. 08/04 A vantagem desta técnica é que ela sondas propriedades mecânicas núcleos de viver em seu ambiente normal celular e do citoesqueleto e que a aplicação tensão substrato assemelha-se a aplicaç?...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Fibronectina </td><td> Millipore </td><td> FC010 </td></tr><tr><td> MitoTracker Red FM e FM Verde </td><td> Invitrogen </td><td> M22425 e M-7514 </td></tr><tr><td> Hoechst 33342 </td><td> Invitrogen </td><td> H3570 </td></tr><tr><td> Saline Hank Sal Buffered </td><td> Invitrogen </td><td> 14185 </td></tr><tr><td> Livre de fenol, DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 21063 </td></tr><tr><td> Soro fetal bovino </td><td> Aleken Biologicals </td><td> FBSS500 </td></tr><tr><td> Penicilina / estreptomicina </td><td> Sigma </td><td> P0781-100ML </td></tr><tr><td> Vidro borosilicato com filamento </td><td> Instrumento Sutter </td><td> BF100-78-10 </td></tr><tr><td> Gloss / folhas silicone Gloss não-reforçada, 0.005 &quot; </td><td> Especialidade Manufacturing Inc. </td><td></td></tr><tr><td> Phosphate Buffered Saline Dulbecco </td><td> Invitrogen </td><td> 14200 </td></tr><tr><td> 35 milímetros de vidro de fundo placas de cultura (FluoroDish) </td><td> Mundial Precision Instruments, INC </td><td> FD35-100 </td></tr><tr><td> Braycote graxa de vácuo 804 </td><td> Suprimentos Spi </td><td> 05133A-AB </td></tr></tbody></table>

biophysical assays to probe the mechanical properties of the interphase cell nucleus: substrate strain application and microneedle manipulation

Na maioria das células eucarióticas, o núcleo é a maior organela e é geralmente de 2 a 10 vezes mais duro do que o citoesqueleto redor e, conseqüentemente, as propriedades físicas do núcleo contribuir significativamente para o comportamento global biomecânica de células em condições fisiológicas e patológicas. Por exemplo, na migração de neutrófilos e invadindo as células cancerosas, rigidez nuclear pode representar um grande obstáculo durante o extravasamento ou passagem através de espaços estreitos dentro dos tecidos. 1 Por outro lado, o núcleo de células no tecido mecanicamente ativos, tais como o músculo requer suporte estrutural suficiente para suportar o estresse mecânico repetitivo. Importante, o núcleo é totalmente integrado à arquitetura celular, que está fisicamente ligado ao citoesqueleto circundante, que é um requisito essencial para o movimento intracelular e posicionamento do núcleo, por exemplo, em células polarizadas, núcleos sináptica nas junções neuromusculares, ou em células de migração. 2 Não é de surpreender que mutações em proteínas do envelope nuclear, como lamins e nesprins, que desempenham um papel crítico na determinação da rigidez nuclear e nucleo-citoesqueleto acoplamento, tem sido mostrado recentemente para resultar em uma série de doenças humanas, incluindo Emery- Dreifuss distrofia muscular, cinturas pélvica e escapular distrofia muscular e miocardiopatia dilatada. 3 Para investigar a função de diversas proteínas biofísicos envelope nuclear eo efeito de mutações específicas, desenvolvemos métodos experimentais para estudar as propriedades físicas do núcleo em um único, células vivas submetido a global ou localizada perturbação mecânica. Medição induzidos deformações nucleares em resposta ao pedido precisamente aplicado substrato tensão gera informações importantes sobre a deformabilidade do núcleo e permite a comparação quantitativa entre mutações diferentes ou linhas de células específicas para deficientes proteínas do envelope nuclear. Aplicação esforço localizado citoesqueleto com microagulhas é utilizado para complementar este ensaio e pode fornecer informações adicionais sobre a transmissão de força entre o núcleo intracelular e citoesqueleto. Estudar a mecânica nuclear em células vivas intactas preserva a arquitetura normal intracelular e evita artefatos potenciais que podem surgir quando se trabalha com núcleos isolados. Além disso, a aplicação tensão substrato apresenta um bom modelo para o estresse fisiológico experimentado por células em músculos ou outros tecidos (por exemplo, células musculares lisas vasculares expostos a tensão navio). Por último, enquanto que essas ferramentas têm sido desenvolvidas principalmente para estudar mecânica nuclear, eles também podem ser aplicados para investigar a função das proteínas do citoesqueleto e sinalização Mecanotransdução.

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Biophysical Assays to Probe the Mechanical Properties of the Interphase Cell Nucleus: Substrate Strain Application and Microneedle Manipulation

Nós apresentamos dois independentes, microscópio de ferramentas baseadas em medir as deformações induzidas nucleares e citoesqueleto em single, vivendo células aderentes em resposta à aplicação de tensão global ou localizada. Estas técnicas são utilizadas para determinar a rigidez nuclear (ou seja, deformabilidade) e para transmissão de força sonda intracelular entre o núcleo e citoesqueleto.

Ensaios biofísicos para investigar as propriedades mecânicas do núcleo da célula Interphase: Aplicação de substrato Strain e Manipulação de microagulhas

In most eukaryotic cells, the nucleus is the largest organelle and is typically 2 to 10 times stiffer than the surrounding cytoskeleton; consequently, the ...

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