Name: biophysical assays to probe the mechanical properties of the interphase cell nucleus: substrate strain application and microneedle manipulation
Uploaded: 2011-09-14T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Biophysical Assays to Probe the Mechanical Properties of the Interphase Cell Nucleus: Substrate Strain Application and Microneedle Manipulation at JoVE.com

Detta arbete stöddes av National Institutes of Health (R01 HL082792 och R01 NS059348) och Brigham and Women sjukhus Hjärt Leadership Group Award.

1. Substrat stam ansökan Mätningen av normaliserade nukleära stam innefattar beredning av stam rätter med transparent, elastiskt silikon membran som cellodling yta, plätering celler på disken, och hämta bilder av cellerna före, under och efter (enaxlig eller tvåaxiala) stam ansökan. Beredning av maträtter silikon membran och efterlevnad av celler <ol><li> Varje stam maträtt består av en skräddarsydd bottenlösa plast skålen med en diameter på 3 &qu...

<ol>
	<li>Friedl, P., Wolf, K., Lammerding, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+mechanics+during+cell+migration.">Nuclear mechanics during cell migration.</a> Curr Opin Cell Biol. 23, 55-64 (2011).</li><li>Mejat, A., Misteli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LINC+complexes+in+health+and+disease.">LINC complexes in health and disease.</a> Nucleus. 1, 40-52 (2010).</li><li>Worman, H. J., Fong, L. G., Muchir, A., Young, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminopathies+and+the+long+strange+trip+from+basic+cell+biology+to+therapy.">Laminopathies and the long strange trip from basic cell biology to therapy.</a> J Clin Invest. 119, 1825-1836 (2009).</li><li>Caille, N., Tardy, Y., Meister, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+strain+field+in+endothelial+cells+subjected+to+uniaxial+deformation+of+their+substrate.">Assessment of strain field in endothelial cells subjected to uniaxial deformation of their substrate.</a> Ann Biomed Eng. 26, 409-416 (1998).</li><li>Lammerding, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lamins+A+and+C+but+not+lamin+B1+regulate+nuclear+mechanics.">Lamins A and C but not lamin B1 regulate nuclear mechanics.</a> J Biol Chem. 281, 25768-25780 (2006).</li><li>Lammerding, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+nuclear+shape+and+impaired+mechanotransduction+in+emerin-deficient+cells.">Abnormal nuclear shape and impaired mechanotransduction in emerin-deficient cells.</a> J Cell Biol. 170, 781-791 (2005).</li><li>Lammerding, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lamin+A/C+deficiency+causes+defective+nuclear+mechanics+and+mechanotransduction.">Lamin A/C deficiency causes defective nuclear mechanics and mechanotransduction.</a> J Clin Invest. 113, 370-378 (2004).</li><li>Verstraeten, V. L., Ji, J. Y., Cummings, K. S., Lee, R. T., Lammerding, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+mechanosensitivity+and+nuclear+stiffness+in+Hutchinson-Gilford+progeria+cells:+effects+of+farnesyltransferase+inhibitors.">Increased mechanosensitivity and nuclear stiffness in Hutchinson-Gilford progeria cells: effects of farnesyltransferase inhibitors.</a> Aging Cell. 7, 383-393 (2008).</li><li>Brooks, S. V., Zerba, E., Faulkner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injury+to+muscle+fibres+after+single+stretches+of+passive+and+maximally+stimulated+muscles+in+mice.">Injury to muscle fibres after single stretches of passive and maximally stimulated muscles in mice.</a> J Physiol. 488, 459-469 (1995).</li><li>Maniotis, A. J., Chen, C. S., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demonstration+of+mechanical+connections+between+integrins,+cytoskeletal+filaments,+and+nucleoplasm+that+stabilize+nuclear+structure.">Demonstration of mechanical connections between integrins, cytoskeletal filaments, and nucleoplasm that stabilize nuclear structure.</a> Proc Natl Acad Sci. 94, 849-854 (1997).</li></ol>

Substrat stam analys Sila ansökan med framgång har använts av oss och andra grupper för att studera inducerade kärnkraft deformationer i celler utsätts för mekanisk stress och att undersöka bidrag från särskilda kärnhöljet proteiner till kärnkraft stelhet. 4-8 Fördelen med denna teknik är att den sonder mekaniska egenskaper att leva kärnor i sin normala cellulära och cytoskelettala miljö och att substratet stammen ansökan liknar fysiologiska belastning ansökan som...

<table border="1"><tbody><tr><td> Namn på Reagens </td><td> Företag </td><td> Katalognummer </td></tr><tr><td> Fibronektin </td><td> Millipore </td><td> FC010 </td></tr><tr><td> MitoTracker Röd FM och Grön FM </td><td> Invitrogen </td><td> M22425 och M-7514 </td></tr><tr><td> Hoechst 33.342 </td><td> Invitrogen </td><td> H3570 </td></tr><tr><td> Hanks buffrat Salt Saline </td><td> Invitrogen </td><td> 14.185 </td></tr><tr><td> Fenol gratis, DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 21.063 </td></tr><tr><td> Fostrets bovint serum </td><td> Aleken Biologicals </td><td> FBSS500 </td></tr><tr><td> Penicillin / Streptomycin </td><td> Sigma </td><td> P0781-100ml </td></tr><tr><td> Borosilikatglas med glödlampa </td><td> Sutter Instrument </td><td> BF100-78-10 </td></tr><tr><td> Glans / Glans oarmerad silikon plåt, 0,005 &quot; </td><td> Specialitet Manufacturing Inc. </td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco är Fosfatbuffrad saltlösning </td><td> Invitrogen </td><td> 14.200 </td></tr><tr><td> 35 mm glas botten kultur rätter (FluoroDish) </td><td> Världen precisionsinstrument, INC </td><td> FD35-100 </td></tr><tr><td> Braycote 804 Vacuum Grease </td><td> Spi levererar </td><td> 05133A-AB </td></tr></tbody></table>

biophysical assays to probe the mechanical properties of the interphase cell nucleus: substrate strain application and microneedle manipulation

I de flesta eukaryota celler, är kärnan största organell och är vanligen 2 till 10 gånger styvare än det omgivande cytoskelettet, varför de fysiska egenskaperna hos kärnan väsentligt bidra till den totala biomekaniska beteende celler under fysiologiska och patologiska förhållanden. Till exempel i flyttande neutrofiler och invaderande cancerceller kan kärnkraft stelhet utgöra ett stort hinder vid extravasering eller passage genom smala utrymmen i vävnader. 1 Å andra sidan kräver den kärna av celler i mekaniskt aktiv vävnad såsom muskler tillräckligt strukturstöd till tåla upprepade mekaniska påfrestningar. Viktigt är kärnan tätt integrerade i den cellulära strukturen, det är fysiskt ansluten till den omgivande cytoskelettet, vilket är ett viktigt krav för den intracellulära förflyttning och positionering av kärnan, exempelvis i polariserade celler, synaptiska kärnor vid neuromuskulära korsningar, eller att migrera celler. 2 Föga förvånande har mutationer i kärnhöljet proteiner såsom lamins och nesprins, som spelar en avgörande roll för hur kärnkraft styvhet och Nucleo-cytoskelettala kopplingen visats nyligen att resultera i ett antal mänskliga sjukdomar, bland annat Emery- Dreifuss muskeldystrofi, lem-gördel muskeldystrofi och dilaterad kardiomyopati. 3 Att undersöka biofysiska funktion av olika kärnhöljet proteiner och effekten av specifika mutationer har vi utvecklat experimentella metoder för att studera de fysiska egenskaperna hos kärnan i enda, levande celler utsätts för global eller lokal mekanisk störning. Mätning inducerad kärnkraft deformationer som svar på exakt tillämpas substrat stam ansökan ger viktig information om deformerbarhet av kärnan och tillåter kvantitativa jämförelser mellan olika mutationer eller cellinjer bristfällig för specifika kärnhöljet proteiner. Lokaliserad cytoskelettala stam ansökan med en microneedle används som komplement till denna analys och kan ge ytterligare information om intracellulära kraftöverföring mellan kärnan och cytoskelettet. Att studera kärnkraft mekaniker i intakta levande celler bevarar den normala intracellulära arkitektur och undviker potentiella artefakter som kan uppstå när man arbetar med enstaka kärnor. Dessutom presenterar substrat stam ansökan en bra modell för fysiologisk stress som upplevs av celler i muskler eller andra vävnader (t.ex. vaskulär glatt muskulatur celler som utsätts för fartyg stam). Slutligen är dessa verktyg har utvecklats främst för att studera kärnkraft mekaniker, kan de också användas för att undersöka funktionen hos cytoskelettala proteiner och signalering mechanotransduction.

Watch this Scientific Journal Video about Biophysical Assays to Probe the Mechanical Properties of the Interphase Cell Nucleus: Substrate Strain Application and Microneedle Manipulation at JoVE.com

Biophysical Assays to Probe the Mechanical Properties of the Interphase Cell Nucleus: Substrate Strain Application and Microneedle Manipulation

Vi presenterar två oberoende, mikroskop-baserade verktyg för att mäta den inducerade kärnkraft och cytoskelettala deformationer i singel, lever fastsittande celler som svar på globala eller lokala stam ansökan. Dessa tekniker används för att bestämma nukleära stelhet (dvs deformerbarhet) och sond intracellulära kraftöverföring mellan kärnan och cytoskelettet.

Biofysiska analyser för att undersöka mekaniska egenskaper Interphase cellkärnan: grundmaterial Sila Ansökan och Microneedle Manipulation

In most eukaryotic cells, the nucleus is the largest organelle and is typically 2 to 10 times stiffer than the surrounding cytoskeleton; consequently, the ...

Research

JoVE Journal

Biology

Mechanical Stimulation of Stem Cells Using Cyclic Uniaxial Strain

Mekanisk stimulering av stamceller Använda Cykliska enaxlig Strain

The role of mechanical forces in the development and maintenance of biological tissues is well documented, including several mechanically regulated ...

Purification of the M. magneticum Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamA&Delta;41

Purification of the M. magneticum Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamAÃƒÅ½Ã¢â‚¬Â41

Rening av M. magneticum Sila AMB-1 Magnetosome Medverkande Protein MamAΔ41

Magnetotactic bacteria comprise a diverse group of aquatic microorganisms that are able to orientate themselves along geomagnetic fields. This behavior is ...

Photobleaching Assays (FRAP &amp; FLIP) to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Photobleaching Assays FRAP & FLIP to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Fotoblekning tester (FRAP &amp; Flip) för att mäta Chromatin Protein Dynamics i Living embryonala stamceller

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) enable the study of protein dynamics in living cells with ...

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

Farmakologiska och funktionella genetiska analyser för att manipulera Regenerering av Planarian Dugesia japonica</em

Free-living planarian flatworms have a long history of experimental usage owing to their remarkable regenerative abilities1. Small fragments excised from ...

Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

Selektiv fångst av 5-hydroxymethylcytosine från genomisk DNA

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene ...

Super-resolution Imaging of the Bacterial Division Machinery

Super-upplösning avbildning av de bakteriella Division Maskin

Bacterial cell division requires the coordinated  assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central  to this process is the formation of ...

Application of an In vitro DNA Protection Assay to Visualize Stress Mediation Properties of the Dps Protein

Application of an In vitro DNA Protection Assay to Visualize Stress Mediation Properties of the Dps Protein

Applicering av en<em&gt; In vitro</em&gt; DNA Protection Assay att visualisera Egenskaper Stress medling Dps Protein

Oxidative stress is an unavoidable byproduct of  aerobic life.  Molecular oxygen is  essential for terrestrial metabolism, but it also takes part in many ...

The Cell-based L-Glutathione Protection Assays to Study Endocytosis and Recycling of Plasma Membrane Proteins

Cell-baserade L-glutation Protection Analyser för att studera Endocytosis och återvinning av plasmamembranproteiner

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes ...

Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs

Probe-baserade Real-time PCR Approaches för kvantitativ mätning av mikroRNA

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that ...

Sequential Application of Glass Coverslips to Assess the Compressive Stiffness of the Mouse Lens: Strain and Morphometric Analyses

Sekventiell Tillämpning av täckglas för att bedöma Tryck styvhet av Mouse Lens: Strain och Morfometriska Analyser

The eye lens is a transparent organ that refracts and focuses light to form a clear image on the retina. In humans, ciliary muscles contract to deform the ...