Name: use of an optical trap for study of host-pathogen interactions for dynamic live cell imaging
Uploaded: 2011-07-28T12:00:00
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Este trabalho foi financiado pelo Massachusetts General Hospital Departamento de Fundos de Medicina Interna (JMT, MKM, MLC, JMV), Instituto Nacional de Imagem Biomédica e Bioengenharia conceder T32EB006348 (CEC), Centro de Massachusetts General Hospital para financiar Computacional e Integrative Biology desenvolvimento e AI062773 ( rjh), concede AI062773, DK83756, e DK 043351 (RJX), NSF 0.643.745 (MJL), NIH R21CA133576 (MJL), e Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas (NIAID) dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH) AI057999 (JMV ). Agradecemos a Nicholas C. Yoder para discussões úteis, e Charles Felts (RPI, Inc.) para obter assistência técnica.

1. Condições de cultivo de patógenos para a captura óptica <ol><li> Crescer A. fumigatus (B-5233/RGD12-8) em uma mídia semi-sólido de ágar contendo SBD (Sabouraud dextrose) a 30 ° C durante 3 dias. </li><li> Crescer C. albicans (SC5314) em YPD (Yeast-peptona Dextrose) de cultura líquido contendo 100 mg / mL ampicilina durante a noite em uma incubadora shaker a 30 ° C. </li></ol> 2. Preparação de agentes patogênicos para a rotulagem fluorescentes <ol><li> Colheit...

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	<li>Grakoui, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunological+synapse:+A+molecular+machine+controlling+T+cell+activation.">The immunological synapse: A molecular machine controlling T cell activation.</a> Science. 285, 221-227 (1999).</li><li>Monks, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+segregation+of+supramolecular+activation+clusters+in+T+cells.">Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells.</a> Nature. 395, 82-86 (1998).</li><li>Stuart, L. M., Ezekowitz, R. 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Neste trabalho nós usamos uma armadilha óptica para capturar patógenos com dimensões entre 3 mm - 5 mm. Apesar de patógenos de interesse para o nosso laboratório normalmente têm estas dimensões, o sistema de pinça óptica aqui descrito é flexível para capturar uma grande variedade de tamanhos. Na verdade armadilhas ópticas têm sido usados ​​para capturar partículas que variam de átomos individuais para as células de aproximadamente 10 m de diâmetro. Além disso, este sistema de captura óptica foi c...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentários (opcional) </th></tr><tr><td> A. fumigatus </td><td></td><td></td><td> Tensão Albino, B-5233/RGD12-8, dom de KJ Kwon-Chung, NIH </td></tr><tr><td> C. albicans </td><td></td><td></td><td> SSY50-B mutante, presente de Eleftherios Mylonakis, MGH; SC5314 tensão, presente de Gerald Fink, Whitehead Institute </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 </td><td> Invitrogen </td><td> A20000 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor 647 </td><td> Invitrogen </td><td> A20006 </td><td></td></tr><tr><td> dimetilformamida </td><td> Sigma </td><td> D4551 </td><td></td></tr><tr><td> Sangue fresco </td><td></td><td></td><td> Dom de RJW Heath, MGH, HMS </td></tr><tr><td> Nikon microscópio invertido </td><td> Nikon </td><td></td><td> Modelo Ti-E </td></tr><tr><td> Laser de aprisionamento, ChromaLase </td><td> Pesquisa Blue Sky </td><td> CLAS-106-STF02-02 </td><td></td></tr><tr><td> Laser de excitação de fluorescência </td><td> Coerente </td><td></td><td> Innova modelo 70C </td></tr><tr><td> Breadboards para componentes armadilhas </td><td> Thorlabs </td><td> MB1224, MB1218 </td><td></td></tr><tr><td> Mesa de ar óptica </td><td> Técnico Manufacturing Corporation </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Obturador eletrônico com controle de pedal </td><td> Uniblitz </td><td></td><td> Comprado de Vincent Associates, Rochester, NY </td></tr><tr><td> Fibra óptica monomodo </td><td> Oz Optics </td><td> PMJ-3S3S-1064-6 </td><td></td></tr><tr><td> Posicionador de fibra </td><td> Thorlabs </td><td> PAF-X-5-C </td><td></td></tr><tr><td> Colimador de fibra </td><td> Oz Optics </td><td> HPUCO-23-1064-P-25AC </td><td></td></tr><tr><td> Lentes para o telescópio </td><td> Thorlabs </td><td> AC254-150-B </td><td> Distância focal de 150 mm </td></tr><tr><td> Estágios de tradução (x, y, z) </td><td> Newport </td><td> M-461-XYZ </td><td></td></tr><tr><td> IR dichroic espelho </td><td> Chroma </td><td> ET750-sp-2p8 </td><td></td></tr><tr><td> Lente objetiva (100X) </td><td> Nikon </td><td></td><td> NA = 1,49, imersão em óleo, o objetivo TIRF </td></tr><tr><td> Cabeça confocal </td><td> Yokogawa </td><td> CSU-XI </td><td></td></tr><tr><td> Polarizador </td><td> Nikon </td><td> MEN51941 </td><td></td></tr><tr><td> Wollaston prisma </td><td> Nikon </td><td> MBH76190 </td><td></td></tr><tr><td> EM-câmera CCD </td><td> Hamamatsu </td><td> C9100-13 </td><td></td></tr><tr><td> CCD da câmera (ORCA ER) </td><td> Hamamatsu </td><td> C4742-80-12AG </td><td></td></tr><tr><td> Roda de filtros </td><td> Ludl </td><td> 99A353 </td><td></td></tr><tr><td> Roda de filtros </td><td> Sutter </td><td> LB10-NWE </td><td></td></tr><tr><td> Chambered lamela </td><td> Lab-Tek/Nunc </td><td> 155409 </td><td></td></tr><tr><td> Dynabeads </td><td> Invitrogen </td><td> 111-51D </td><td> Revestidas com anti-CD3 </td></tr><tr><td> Meio modificado Dulbecco Águia (DMEM) </td><td> Invitrogen / Gibco </td><td> 10313 </td><td></td></tr><tr><td> Penicilina / estreptomicina </td><td> Invitrogen / Gibco </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> L-glutamina </td><td> Invitrogen / Gibco </td><td> 25030-081 </td><td></td></tr><tr><td> De soro fetal bovino (HyClone) </td><td> ThermoScientific </td><td> SH30071.03 </td><td></td></tr></tbody></table>

use of an optical trap for study of host-pathogen interactions for dynamic live cell imaging

Imagens de células ao vivo dinâmica permite a visualização direta de tempo-real interações entre as células do sistema imunitário 1, 2, no entanto, a falta de controle espacial e temporal entre a célula fagocítica e micróbio tornou foco observações sobre a interação inicial de resposta do hospedeiro a patógenos difícil. Historicamente, os eventos de contato intercelular tais como fagocitose 3 foram fotografadas pela mistura de dois tipos de células, e depois continuamente digitalização do campo de visão para encontrar serendipitous contatos intercelulares no estágio apropriado de interação. A natureza estocástica desses eventos torna este processo tedioso, e é difícil de observar eventos cedo ou fugazes em contato célula-célula por esta abordagem. Este método requer encontrar pares de células que estão à beira de contato, e observá-los até que entre em contato com consumado, ou não. Para lidar com essas limitações, nós usamos a captura óptica como um método não invasivo, não-destrutivo, mas rápido e eficaz para a posição células em cultura. Armadilhas ópticas, ou pinças ópticas, estão cada vez mais utilizados em pesquisa biológica para capturar e manipular fisicamente as células e outros micro-empresas partículas em três dimensões 4. Pressão de radiação foi observada pela primeira vez e aplicada a sistemas de pinça óptica em 1970 5, 6, e foi usado pela primeira vez para controlar espécimes biológicos em 1987 7. Desde então, a pinça óptica amadureceram em uma tecnologia para sondar uma variedade de fenômenos biológicos 13/08. Nós descrevemos um método de 14 que avanços ao vivo imagens de células através da integração de uma armadilha óptica com spinning microscopia confocal de disco com controle de temperatura e umidade para fornecer controle espacial e temporal requintada de organismos patogênicos em um ambiente fisiológico para facilitar a interação com células hospedeiras, como determinado pelo operador. Live, organismos patogênicos, como Candida albicans e Aspergillus fumigatus, que pode causar potencialmente letal, infecções invasivas em indivíduos imunocomprometidos 15, 16 (por exemplo, AIDS, quimioterapia e transplante de órgãos doentes), foram presos opticamente usando intensidades não-destrutivo a laser e mudou-se junto ao macrófagos, o que pode fagocitam o patógeno. De alta resolução, transmitido filmes de luz e de fluorescência baseada estabelecida a capacidade de observar os primeiros eventos de fagocitose em células vivas. Para demonstrar a ampla aplicabilidade em imunologia, principais células T também foram presos e manipulados para formar sinapses com anti-CD3 microesferas revestidas in vivo, e lapso de tempo de imagem de formação de sinapses também foi obtida. Ao fornecer um método para exercer o controle de patógenos espaciais bem viver com respeito às células imunológicas, as interações celulares podem ser capturados por microscopia de fluorescência com perturbação mínima para as células e pode render uma visão poderosa em respostas iniciais de imunidade inata e adaptativa.

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Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

Um método é descrito para selecionar individualmente, manipular e patógenos imagem ao vivo usando uma armadilha óptica acoplada a um microscópio disco giratório. A armadilha óptica fornece controle espacial e temporal dos organismos e os coloca ao lado células hospedeiras. Microscopia de fluorescência captura dinâmica interações intercelulares com perturbação mínima para as células.

Uso de uma armadilha óptica de Estudos de Interações Hospedeiro-Patógeno para imagens de células dinâmica ao vivo

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

Utilização do Modelo EpiAirway para caracterizar a longo prazo Interações Hospedeiro-Patógeno

Nontypeable Haemophilus influenzae  (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory ...

Imunologia e Infecção

A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions

Uma abordagem comparativa para caracterizar a paisagem de Patógeno-Hospedeiro interações proteína-proteína

Significant efforts were gathered to generate  large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is  instrumental to understand the ...

Study of Phagolysosome Biogenesis in Live Macrophages

Estudo da fagolisossomo Biogenesis em macrófagos ao vivo

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Utilização de<em&gt; Shigella flexneri</em&gt; Para estudar interações Autophagy-Cytoskeleton

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Avaliação da eficácia e toxicidade de RNAs Segmentação HIV-1 Produção para uso em Gene ou Quimioterapia

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Fabricating Optical-quality Glass Surfaces to Study Macrophage Fusion

Fabricação de superfícies de vidro de qualidade óptica para estudar a fusão do macrófago

Visualizing the formation of multinucleated giant cells (MGCs) from living specimens has been challenging due to the fact that most live imaging ...

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

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In Vitro Formação canina neutrófilos extracelular armadilha: Análise dinâmica e quantitativa por microscopia de fluorescência

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Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Avaliação das respostas do hospedeiro-patógeno e eficácia da vacina em camundongos

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...

Infection of Zebrafish Larvae with Aspergillus Spores for Analysis of Host-Pathogen Interactions

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Infecção de larvas de zebrafish com esporos de Aspergillus para análise de interações hospedeiro-patógeno

Invasive aspergillosis (IA) is one of&#160;the most common fungal infections among immunocompromised individuals. Despite the availability of antifungal ...

Label-Free Quantitative Proteomics Workflow for Discovery-Driven Host-Pathogen Interactions

Fluxo de trabalho de proteômica quantitativa sem rótulo para interações de patógenos de host-pathogen orientadas para a descoberta

The technological achievements of mass spectrometry (MS)-based quantitative proteomics opens many undiscovered avenues for analyzing an organism&#8217;s ...