Name: use of an optical trap for study of host-pathogen interactions for dynamic live cell imaging
Uploaded: 2011-07-28T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging at JoVE.com

Detta arbete stöddes av Massachusetts General Hospital Institutionen för medicin interna medel (JMT, MKM, MLC, JMV), National Institute of Biomedical Imaging och bioteknik bevilja T32EB006348 (CEC), Massachusetts General Hospital Center for Computational och integrativ biologi utvecklingsfonden och AI062773 ( RJH), AI062773 bidrag, DK83756 och Danmark 043.351 (RJX), NSF 0.643.745 (MJL), NIH R21CA133576 (MJL) och National Institute of Allergy och infektionssjukdomar (NIAID) av National Institutes of Health (NIH) AI057999 (JMV ). Vi tackar Nicholas C. Yoder för bra diskussioner, och Charles filtar (RPI, Inc.) för tekniskt stöd.

1. Kultur villkor för patogener för optiska fällor <ol><li> Grow A. fumigatus (B-5233/RGD12-8) på en halvfast agar media som innehåller SBD (Sabouraud dextros) vid 30 ° C i 3 dagar. </li><li> Väx C. albicans (SC5314) i YPD (jäst-Peptone dextros) flytande kultur som innehåller 100 mikrogram / ​​ml ampicillin över natten i en shaker inkubator vid 30 ° C. </li></ol> 2. Beredning av patogener för fluorescerande märkning <ol><li> Harvest önskad mängd av patogen...

<ol>
	<li>Grakoui, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunological+synapse:+A+molecular+machine+controlling+T+cell+activation.">The immunological synapse: A molecular machine controlling T cell activation.</a> Science. 285, 221-227 (1999).</li><li>Monks, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+segregation+of+supramolecular+activation+clusters+in+T+cells.">Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells.</a> Nature. 395, 82-86 (1998).</li><li>Stuart, L. M., Ezekowitz, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytosis+and+comparative+innate+immunity:+Learning+on+the+fly.">Phagocytosis and comparative innate immunity: Learning on the fly.</a> Nat Rev Immunol. 8, 131-141 (2008).</li><li>Neuman, K. C., Block, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+trapping.">Optical trapping.</a> Rev Sci Instrum. 75, 2787-2809 (2004).</li><li>Ashkin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+trapping+and+manipulation+of+neutral+particles+using+lasers.">Optical trapping and manipulation of neutral particles using lasers.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 94, 4853-4860 (1997).</li><li>Ashkin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acceleration+and+trapping+of+particles+by+radiation+pressure.">Acceleration and trapping of particles by radiation pressure.</a> Phys Rev Lett. 24, 156-159 (1970).</li><li>Ashkin, A., Dziedzic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+trapping+and+manipulation+of+viruses+and+bacteria+Science.">Optical trapping and manipulation of viruses and bacteria Science.</a> Nature. 235, 1517-1520 (1987).</li><li>Khalil, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+M13+bacteriophage+tethering+and+stretching.">Single M13 bacteriophage tethering and stretching.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104, 4892-4897 (2007).</li><li>Khalil, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin's+cover-neck+bundle+folds+forward+to+generate+force.">Kinesin's cover-neck bundle folds forward to generate force.</a> Proc Natl Acad Sci USA.. 105, 19247-19252 (2008).</li><li>Li, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+tether+formation+from+outer+hair+cells+with+optical+tweezers.">Membrane tether formation from outer hair cells with optical tweezers.</a> Biophys J. , 1386-1395 (2002).</li><li>Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+&#945;&#946;+T+cell+receptor+is+an+anisotropic+mechanosensor.">The &#945;&#946; T cell receptor is an anisotropic mechanosensor.</a> J Biol Chem. 284, 31028-31028 (2009).</li><li>Mohanty, S., Mohanty, K., Gupta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+interaction+of+RBC+with+optical+tweezers.">Dynamics of interaction of RBC with optical tweezers.</a> Opt. Express. 13, 4745-4751 (2005).</li><li>Tam, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+and+manipulation+of+pathogens+with+an+optical+trap+for+live+cell+imaging+of+intercellular+interactions.">Control and manipulation of pathogens with an optical trap for live cell imaging of intercellular interactions.</a> PLoS One. 5, e15215-e15215 (2010).</li><li>Lin, S. J., Schranz, J., Teutsch, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspergillosis+case-fatality+rate:+Systematic+review+of+the+literature.">Aspergillosis case-fatality rate: Systematic review of the literature.</a> Clin Infect Dis.. 32, 358-366 (2001).</li><li>Wey, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hospital-acquired+candidemia+-+the+attributable+mortality+and+excess+length+of+stay.">Hospital-acquired candidemia - the attributable mortality and excess length of stay.</a> Arch. Intern. Med. 148, 2642-2645 (1988).</li></ol>

I detta arbete använder vi en optisk fälla för att fånga patogener med dimensioner mellan 3 ìm - 5 ìm. Även om patogener av intresse för vårt labb har normalt dessa dimensioner är den optiska pincett som beskrivs här flexibla för att fälla ett stort utbud av storlekar. I själva verket optiska fällor har använts för att fånga partiklar från enskilda atomer till celler cirka 10 mikrometer i diameter. Dessutom var denna optiska fällor system som kan fånga upp partiklar av olika former: sfäriska, ellip...

<table border="1"><tbody><tr><th> Reagensets namn </th><th> Företag </th><th> Katalognummer </th><th> Kommentarer (frivilligt) </th></tr><tr><td> A. fumigatus </td><td></td><td></td><td> Albino stam, B-5233/RGD12-8, gåva från KJ Kwon-Chung, NIH </td></tr><tr><td> C. albicans </td><td></td><td></td><td> SSY50-B mutant, gåva från Eleftherios Mylonakis, MGH, SC5314 stam, gåva från Gerald Fink, Whitehead Institute </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 </td><td> Invitrogen </td><td> A20000 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor 647 </td><td> Invitrogen </td><td> A20006 </td><td></td></tr><tr><td> dimetylformamid </td><td> Sigma </td><td> D4551 </td><td></td></tr><tr><td> Färskt blod </td><td></td><td></td><td> Gåva från RJW Heath, MGH, HMS </td></tr><tr><td> Nikon inverterat mikroskop </td><td> Nikon </td><td></td><td> Modell Ti-E </td></tr><tr><td> Svällning laser, ChromaLase </td><td> Blue Sky Research </td><td> CLAS-106-STF02-02 </td><td></td></tr><tr><td> Fluorescens excitation laser </td><td> Sammanhängande </td><td></td><td> Modell Innova 70C </td></tr><tr><td> Breadboards för att fånga komponenter </td><td> Thorlabs </td><td> MB1224, MB1218 </td><td></td></tr><tr><td> Optisk luft bord </td><td> Tekniska Manufacturing Corporation </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Elektronisk slutare med pedal kontroll </td><td> Uniblitz </td><td></td><td> Köpt från Vincent Associates, Rochester, NY </td></tr><tr><td> Singlemode optisk fiber </td><td> Oz Optik </td><td> PMJ-3S3S-1064-6 </td><td></td></tr><tr><td> Fiber lägesställare </td><td> Thorlabs </td><td> PAF-X-5-C </td><td></td></tr><tr><td> Fiber kollimator </td><td> Oz Optik </td><td> HPUCO-23 till 1064-P-25AC </td><td></td></tr><tr><td> Objektiv för teleskop </td><td> Thorlabs </td><td> AC254-150-B </td><td> Brännvidd på 150 mm </td></tr><tr><td> Översättning stadier (x, y, z) </td><td> Newport </td><td> M-461-XYZ </td><td></td></tr><tr><td> IR dichroic spegel </td><td> Chroma </td><td> ET750-SP-2p8 </td><td></td></tr><tr><td> Objektiv (100X) </td><td> Nikon </td><td></td><td> NA = 1,49, oljeimmersion, TIRF mål </td></tr><tr><td> Konfokala huvudet </td><td> Yokogawa </td><td> CSU-XI </td><td></td></tr><tr><td> Polarisator </td><td> Nikon </td><td> MEN51941 </td><td></td></tr><tr><td> Wollaston prisma </td><td> Nikon </td><td> MBH76190 </td><td></td></tr><tr><td> EM-CCD-kamera </td><td> Hamamatsu </td><td> C9100-13 </td><td></td></tr><tr><td> CCD-kamera (ORCA ER) </td><td> Hamamatsu </td><td> C4742-80-12AG </td><td></td></tr><tr><td> Filter hjul </td><td> Ludl </td><td> 99A353 </td><td></td></tr><tr><td> Filter hjul </td><td> Sutter </td><td> LB10-NWE </td><td></td></tr><tr><td> Chambered coverglass </td><td> Lab-Tek/Nunc </td><td> 155.409 </td><td></td></tr><tr><td> Dynabeads </td><td> Invitrogen </td><td> 111-51D </td><td> Belagda med anti-CD3 </td></tr><tr><td> Dulbecco ändrade Eagles medium (DMEM) </td><td> Invitrogen / Gibco </td><td> 10.313 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillin / streptomycin </td><td> Invitrogen / Gibco </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> L-glutamin </td><td> Invitrogen / Gibco </td><td> 25030-081 </td><td></td></tr><tr><td> Fetalt bovinserum (HyClone) </td><td> ThermoScientific </td><td> SH30071.03 </td><td></td></tr></tbody></table>

use of an optical trap for study of host-pathogen interactions for dynamic live cell imaging

Dynamisk levande cell imaging möjliggör direkt visualisering av realtidsinformation interaktioner mellan celler i immunsystemet 1, 2, men har bristen på tid och kontroll mellan fagocytiska cellen och mikrob återges fokuserade observationer i den inledande interaktioner mellan värd reaktion på patogener svårt. Historiskt sett har intercellulär kontakta evenemang såsom fagocytos 3 har avbildats genom att blanda två celltyper, och sedan kontinuerligt skanna field-of-view för att hitta serendipitous intercellulära kontakter i rätt skede av interaktion. Den stokastiska karaktären av dessa händelser gör denna process tråkig, och det är svårt att observera tidiga eller hastiga händelser i cell-cell kontakt med denna metod. Denna metod måste man finna cell par som är på gränsen till kontakten och observera dem tills de fulländade sin kontakt, eller inte. För att lösa dessa begränsningar, vi använder optiska fällor som en icke-invasiva, icke-förstörande, men snabb och effektiv metod för att positionera celler i kultur. Optisk fällor, eller optisk pincett, i allt högre grad används i biologisk forskning att fånga och fysiskt manipulera celler och andra micron stora partiklar i tre dimensioner 4. Strålningstryck observerades först och tillämpas på optisk pincett system i 1970 5, 6, och var först används för att styra biologiska prover i 1987 7. Sedan dess har optisk pincett mognat till en teknik för att undersöka olika biologiska fenomen 8-13. Vi beskriver en metod 14 som förskott levande cell imaging genom att integrera en optisk fälla med spinning disk konfokalmikroskopi med temperatur och luftfuktighet för att ge utsökt rumsliga och tidsmässiga kontroll av sjukdomsalstrande organismer i en fysiologisk miljö för att underlätta samspel med värdceller, som bestäms av operatören. Live var patogena organismer som Candida albicans och Aspergillus fumigatus, som kan orsaka potentiellt dödliga, invasiva infektioner med nedsatt immunförsvar 15, 16 (t.ex. aids, kemoterapi och organtransplantation patienter), optiskt fångad med icke-förstörande laser intensitet och flyttade i anslutning till makrofager, vilket kan phagocytose patogenen. Hög upplösning, genomlysning och fluorescens-baserade filmer etablerade förmågan att observera tidiga händelserna fagocytos i levande celler. För att visa det breda tillämpbarhet i immunologi, var primära T-celler också fångade och manipulerat för att bilda synapser med anti-CD3 mikrosfärer in vivo och Time-lapse avbildning av synaps bildning erhölls också. Genom att tillhandahålla en metod att utöva fina rumsliga kontrollen av levande patogener med avseende på immunceller kan cellulära interaktioner fångas upp av fluorescensmikroskopi med minimal störning för att celler och kan ge kraftfulla inblick i tidig svar medfödd och adaptiv immunitet.

Watch this Scientific Journal Video about Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging at JoVE.com

Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

En metod beskrivs för att individuellt välja, manipulera och bild lever patogener med en optisk fälla kopplad till en snurrande skiva mikroskop. Den optiska fällan ger tid och bekämpning av organismer och placerar dem i anslutning till värdceller. Fluorescensmikroskopi fångar dynamiska intercellulära interaktioner med minimal störning till celler.

Användning av en optisk fälla för studier av Host-patogen interaktioner för Dynamic levande cell imaging

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

Användning av EpiAirway modell för att karakterisera Långfristiga Värd-patogen interaktioner

Nontypeable Haemophilus influenzae  (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory ...

A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions

En komparativ metod för att karakterisera Landskap av värdpatogen Protein-protein interaktioner

Significant efforts were gathered to generate  large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is  instrumental to understand the ...

Study of Phagolysosome Biogenesis in Live Macrophages

Studie av Phagolysosome biogenes i Live Makrofager

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Användning av<em&gt; Shigella flexneri</em&gt; Att studera autophagy-Cytoskeleton interaktioner

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Utvärdering av effekt och toxicitet av RNA Targeting HIV-1-produktion för användning i Gene eller Drug Therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Fabricating Optical-quality Glass Surfaces to Study Macrophage Fusion

Fabricera optisk-kvalitet glasytor att studera makrofag Fusion

Visualizing the formation of multinucleated giant cells (MGCs) from living specimens has been challenging due to the fact that most live imaging ...

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

In Vitro Hundarnas neutrofila extracellulära fälla bildandet: Dynamiska och kvantitativ analys av fluorescensmikroskopi

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Utvärdering av värd-patogen svaren och vaccinets effekt hos möss

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...

Infection of Zebrafish Larvae with Aspergillus Spores for Analysis of Host-Pathogen Interactions

Infection of Zebrafish Larvae with Aspergillus Spores for Analysis of Host-Pathogen Interactions

Infektion av zebrafisklarver med Aspergillus Spores för analys av värdpatogeninteraktioner

Invasive aspergillosis (IA) is one of&#160;the most common fungal infections among immunocompromised individuals. Despite the availability of antifungal ...

Label-Free Quantitative Proteomics Workflow for Discovery-Driven Host-Pathogen Interactions

Etikettfritt kvantitativt proteomiskt arbetsflöde för identifieringsdrivna värdpatogeninteraktioner

The technological achievements of mass spectrometry (MS)-based quantitative proteomics opens many undiscovered avenues for analyzing an organism&#8217;s ...