Name: cell-based calcium assay for medium to high throughput screening of trp channel functions using flexstation 3
Uploaded: 2011-08-17T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cell-based Calcium Assay for Medium to High Throughput Screening of TRP Channel Functions using FlexStation 3 at JoVE.com

אנו מודים בני הזוג. ג&#39;ון הנקוק, ריי גריל, אנדרו מוריס אולגה Chumakova על תמיכתם. מערכת 3 FlexStation הוא חלק מתקן הדמיה UTHSC Cytodynamic. אנו מודים גם בני הזוג. Ardem Patapoutian ומיכאל Bandell מן המחקר סקריפס מכון Genomics של מכון המחקר של נוברטיס קרן (GNF) למתן את הקו הסלולרי HEK293-hTRPA1 יציב. המחקר נתמך בחלקו על ידי מענקי NIH (GM081658 כדי MXZ) וטקסס המרכז הרפואי העיכול מחלות מרכז (אל ה&quot;ה) ואת המשימה חבר / TIRR קרן (אל ה&quot;ה).

1. תא ההכנות 96-היטב צלחות עבור HEK293 תאים trasfected transiently עם TRPA1 האדם cDNA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> HEK293 התאים גדלים על 1-2 ימים בינונית Essential מינימלי של Dulbecco (DMEM) המכיל 4.5 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​גלוקוז (Thermo Scientific, SH3002201), ?...

<ol>
	<li>Hu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+TRPA1+channels+by+fenamate+nonsteroidal+anti-inflammatory+drugs.">Activation of TRPA1 channels by fenamate nonsteroidal anti-inflammatory drugs.</a> Pflugers Arch. 459, 579-592 (2010).</li><li>Hu, H., Bandell, M., Petrus, M. J., Zhu, M. X., Patapoutian, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zinc+activates+damage-sensing+TRPA1+ion+channels.">Zinc activates damage-sensing TRPA1 ion channels.</a> Nat Chem Biol. 5, 183-190 (2009).</li><li>Perney, T. M., Hirning, L. D., Leeman, S. E., Miller, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+calcium+channels+mediate+neurotransmitter+release+from+peripheral+neurons.">Multiple calcium channels mediate neurotransmitter release from peripheral neurons.</a> Proc Natl Acad Sci. 83, 6656-6659 (1986).</li><li>Mason, S. A., MacLeod, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+action+potential+duration+and+calcium+regulation+in+males+and+females.">Cardiac action potential duration and calcium regulation in males and females.</a> Biochem Biophys Res Commun. 388, 565-570 (2009).</li><li>Raat, N. J., Wetzels, G. E., DeMey, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-contraction+relationship+in+rat+mesenteric+arterial+smooth+muscle.+Effects+of+exogenous+and+neurogenic+noradrenaline.">Calcium-contraction relationship in rat mesenteric arterial smooth muscle. Effects of exogenous and neurogenic noradrenaline.</a> Pflugers Arch. 436, 262-269 (1998).</li><li>Alagarsamy, S., Johnson, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-dependent+calcium+channel+involvement+in+NMDA-induced+activation+of+NOS.">Voltage-dependent calcium channel involvement in NMDA-induced activation of NOS.</a> Neuroreport. 6, 2250-2254 (1995).</li><li>Su, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRPM7+regulates+cell+adhesion+by+controlling+the+calcium-dependent+protease+calpain.">TRPM7 regulates cell adhesion by controlling the calcium-dependent protease calpain.</a> J Biol Chem. 281, 11260-11270 (2006).</li><li>Dubinsky, J. M., Rothman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+calcium+concentrations+during+"chemical+hypoxia"+and+excitotoxic+neuronal+injury.">Intracellular calcium concentrations during "chemical hypoxia" and excitotoxic neuronal injury.</a> J Neurosci. 11, 2545-2551 (1991).</li><li>George, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sodium+channel+activation+augments+NMDA+receptor+function+and+promotes+neurite+outgrowth+in+immature+cerebrocortical+neurons.">Sodium channel activation augments NMDA receptor function and promotes neurite outgrowth in immature cerebrocortical neurons.</a> J Neurosci. 29, 3288-3301 (2009).</li><li>Price, K. L., Lummis, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FlexStation+examination+of+5-HT3+receptor+function+using+Ca2++-+and+membrane+potential-sensitive+dyes:+advantages+and+potential+problems.">FlexStation examination of 5-HT3 receptor function using Ca2+ - and membrane potential-sensitive dyes: advantages and potential problems.</a> J Neurosci Methods. 149, 172-177 (2005).</li><li>Laude, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+functional+assays+of+recombinant+IP3+receptors.">Rapid functional assays of recombinant IP3 receptors.</a> Cell Calcium. 38, 45-51 (2005).</li><li>Marincsak, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+analgesic+drug,+tramadol,+acts+as+an+agonist+of+the+transient+receptor+potential+vanilloid-1.">The analgesic drug, tramadol, acts as an agonist of the transient receptor potential vanilloid-1.</a> Anesth Analg. 106, 1890-1896 (2008).</li><li>Xie, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+high+throughput+screening+assays+against+three+subtypes+of+Ca(v)3+T-type+channels+using+molecular+and+pharmacologic+approaches.+Assay+Drug+Dev+Technol.">Validation of high throughput screening assays against three subtypes of Ca(v)3 T-type channels using molecular and pharmacologic approaches. Assay Drug Dev Technol.</a> 5, 191-203 (2007).</li><li>Christensen, B. N., Kochukov, M., McNearney, T. A., Taglialatela, G., Westlund, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proton-sensing+G+protein-coupled+receptor+mobilizes+calcium+in+human+synovial+cells.">Proton-sensing G protein-coupled receptor mobilizes calcium in human synovial cells.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 289, C601-C608 (2005).</li><li>Boulay, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+expression+of+a+novel+mammalian+homolog+of+Drosophila+transient+receptor+potential+(Trp)+involved+in+calcium+entry+secondary+to+activation+of+receptors+coupled+by+the+Gq+class+of+G+protein.">Cloning and expression of a novel mammalian homolog of Drosophila transient receptor potential (Trp) involved in calcium entry secondary to activation of receptors coupled by the Gq class of G protein.</a> J Biol Chem. 272, 29672-29680 (1997).</li><li>Nanda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+screening+of+adrenergic+receptors+by+measuring+intracellular+calcium+using+the+FlexStation+scanning+fluorimeter.">Functional screening of adrenergic receptors by measuring intracellular calcium using the FlexStation scanning fluorimeter.</a> Biotechnol J. 4, 417-422 (2009).</li></ol>

תאיים Ca 2 + משחק תפקידים חשובים בתנאים פיסיולוגיים ופתולוגיים רבים, כגון שחרור הנוירוטרנסמיטר (3), פוטנציאל פעולה הלב (4), התכווצות תא שריר (5), האות תא התמרה (6-7), ואת מותם של תאים excitotoxic ( 8). מדידת תאיים Ca 2 + רמות מסייעת להבהיר שינויים פונקציונליים של Ca 2 +-חדיר</...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> הערות (אופציונלי) </th></tr><tr><td> FlexStation 3 </td><td> מולקולרית התקנים </td><td> FLEX3 </td><td></td></tr><tr><td> 96-ובכן, Pipet FlexStation טיפים </td><td> מולקולרית התקנים </td><td> 9000-0912 </td><td></td></tr><tr><td> 96-ובכן פלטות </td><td> גריינר ביו אחד </td><td> 655090 </td><td></td></tr><tr><td> 96-טוב נקה התחתונה צלחות שטוחות </td><td> שחקן המשנה </td><td> 3595 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 12430-104 </td><td></td></tr><tr><td> Opti-ממ </td><td> Invitrogen </td><td> 31985-070 </td><td></td></tr><tr><td> Lipofectamine 2000 </td><td> Invitrogen </td><td> 11668-019 </td><td></td></tr><tr><td> Fluo, 04:00 </td><td> Invitrogen </td><td> F14202 </td><td></td></tr><tr><td> PluronicF-127 </td><td> Invitrogen </td><td> P3000MP </td><td></td></tr><tr><td> פולי-L-ornithine </td><td> סיגמא </td><td> P36551 </td><td></td></tr><tr><td> פרובנציד </td><td> סיגמא </td><td> P8761 </td><td></td></tr><tr><td> שור בסרום אלבומין </td><td> סיגמא </td><td> A9418 </td><td></td></tr></tbody></table>

cell-based calcium assay for medium to high throughput screening of trp channel functions using flexstation 3

FlexStation Devices &quot;מולקולרית 3 הוא קורא benchtop מצב מרובה microplate מסוגל מדידת הקרינה אוטומטיות רב גם הצלחות. הוא אידיאלי עבור בינוני עד תפוקה גבוהה מסכי במסגרות אקדמיות. יש לו נוזל משולב העברת מודול מצויד pipetter מרובת ערוצים והמכשיר קורא עמודה אחת בכל פעם, כדי לעקוב אחר שינויים הקרינה של מגוון רחב של ריאגנטים ניאון. לדוגמה, FlexStation 3 נעשה שימוש כדי ללמוד את הפונקציה של Ca 2 +-חדיר תעלות יונים ו-G-חלבון קולטנים מצמידים על ידי מדידת שינויים תאיים חינם Ca 2 + רמות. חלוף פוטנציאל קולטן (TRP) הערוצים הם משפחה גדולה של ערוצים קטיון nonselective כי תפקיד חשוב פונקציות פיזיולוגיים pathophysiological רבים. רוב ערוצי TRP הם סידן חדיר ולגרום זרימת סידן על ההפעלה. בסרטון הזה, אנחנו מדגימים את היישום של FlexStation 3 ללמוד את פרופיל פרמקולוגי של ערוץ TRPA1, חיישן מולקולרית עבור גירויים רעילים רבים. HEK293 תאים transiently או ביציבות מביע האדם TRPA1 ערוצים, גדל צלחות 96-היטב, עמוסים Ca 2 + רגיש צבע פלואורסצנטי, Fluo-4, בזמן אמת שינויים הקרינה בתאים אלה נמדדים לפני ובמהלך יישום אגוניסט TRPA1 באמצעות מצב FLEX של FlexStation 3. ההשפעה של אנטגוניסט TRPA1 המשוערת נבדקה גם. הנתונים מועברים ישירות מתוך התוכנה SoftMax Pro לבנות ריכוז בתגובה יחסים של TRPA1 activators ומעכבי.

Watch this Scientific Journal Video about Cell-based Calcium Assay for Medium to High Throughput Screening of TRP Channel Functions using FlexStation 3 at JoVE.com

Cell-based Calcium Assay for Medium to High Throughput Screening of TRP Channel Functions using FlexStation 3

וידאו זה מספק פרוטוקול מפורט לחקר פרופיל פרמקולוגי של TRPA1 ערוצי אנושי באמצעות FlexStation 3. פרוטוקול מכסה הפרטים של הכנת התאים, טוען לצבוע ותפעול של הקורא microplate, FlexStation 3.

תא מבוססי סידן Assay עבור בינוני עד הקרנת תפוקה גבוהה של פונקציות TRP באמצעות ערוץ FlexStation 3

The Molecular Devices' FlexStation 3 is a benchtop multi-mode microplate reader capable of automated fluorescence measurement in multi-well plates.  It is ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

Microarrays פולימר לגילוי תפוקה גבוהה של Biomaterials

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

Candida albicans Biofilm Chip (CaBChip) for High-throughput Antifungal Drug Screening

Candida albicans Biofilm Chip CaBChip for High-throughput Antifungal Drug Screening

קנדידה אלביקנס biofilm צ&#39;יפ (ע&quot;א BChip) להקרנה תפוקה גבוהה תרופות נגד פטריות

Candida  albicans remains the main etiological agent of candidiasis, which  currently represents the fourth most common nosocomial bloodstream infection ...

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

גנרטור ביטוי חלבון תפוקה גבוהה באמצעות פלטפורמת Microfluidic

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Generation of Scalable, Metallic High-Aspect Ratio Nanocomposites in a Biological Liquid Medium

דור של, Nanocomposites יחס Scalable מתכתי גבוהה היבט בביולוגי נוזלי בינוני

The goal of this protocol is to describe the synthesis of two novel biocomposites with high-aspect ratio structures. The biocomposites consist of copper ...

Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography

באמצעות Tomoauto: פרוטוקול לתפוקה גבוהה אוטומטית קריו אלקטרון טומוגרפיה

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native ...

High-throughput Identification of Bacteria Repellent Polymers for Medical Devices

זיהוי תפוקה גבוהה של חיידקים פולימרים דוחה עבור אביזרים ומכשור רפואי

Medical devices are often associated with hospital-acquired infections, which place enormous strain on patients and the healthcare system as well as ...

3D Microtissues for Injectable Regenerative Therapy and High-throughput Drug Screening

Microtissues תלת-ממד עבור טיפול בזריקות רגנרטיבית ותפוקה גבוהה והתרופות הקרנה

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous ...

Process Optimization using High Throughput Automated Micro-Bioreactors in Chinese Hamster Ovary Cell Cultivation

מיטוב תהליכים באמצעות תפוקה גבוהה מיקרו-Bioreactors שחקנים בסינית טיפוח תא שחלה אוגר

Optimization of bioprocesses to increase the yield of desired products is of importance in the biopharmaceutical industry. This can be achieved by strain ...

High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay

High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay

זיהוי תפוקה גבוהה של עמידות לפסאודומונס syringae pv. עגבניה בעגבניה באמצעות שתיל שיטפון שיטת

Tomato is an agronomically important crop that can be infected by Pseudomonas syringae, a Gram-negative bacterium, resulting in bacterial speck disease. ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

יצירת תנאי סביבה דינמיים באמצעות מכשיר מיקרופלואידי בעל תפוקה גבוהה

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...