Name: cell-based calcium assay for medium to high throughput screening of trp channel functions using flexstation 3
Uploaded: 2011-08-17T12:00:00
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우리는 DRS 감사합니다. 존 핸콕, 레이 그릴, 앤드류 모리스과 지원 올가 Chumakova. FlexStation 3 시스템은 UTHSC Cytodynamic 이미징 시설의 일부입니다. 우리는 또한 DRS 감사합니다. 스크립스 연구소와 HEK293 - hTRPA1 안정 세포주를 제공 노바티스 연구 재단 (GNF)의 게놈 연구소에서 Ardem Patapoutian 마이클 Bandell. 연구는 NIH (MXZ에 GM081658)와 텍사스 메디컬 센터 소화기 질환 센터 (HH)을하고 미션 연결 / TIRR 재단 (HH로)에서 부여로 일부에서 지원됩니다.

1. 96 - 웰 플레이트에 셀 준비 transiently cDNA 인간 TRPA1와 trasfected HEK293 세포에 대한 <ol><li> HEK293 세포는 10 %의 열 inactivated 태아 소 혈청 (Invitrogen, 16000-044)와 보충 4.5 MG / ML 포도당 (써모 과학, SH3002201)이있는 Dulbecco의 최소 필수 매체 1~2일 (DMEM), 50 단위 재배 / ML 페니실린 50 μg / ML 스트렙토 마이신 (Invitrogen, 15140-163). transfection의 날, 세포 밀도는 70-90%에 도달해야합니다. </li...

<ol>
	<li>Hu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+TRPA1+channels+by+fenamate+nonsteroidal+anti-inflammatory+drugs.">Activation of TRPA1 channels by fenamate nonsteroidal anti-inflammatory drugs.</a> Pflugers Arch. 459, 579-592 (2010).</li><li>Hu, H., Bandell, M., Petrus, M. J., Zhu, M. X., Patapoutian, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zinc+activates+damage-sensing+TRPA1+ion+channels.">Zinc activates damage-sensing TRPA1 ion channels.</a> Nat Chem Biol. 5, 183-190 (2009).</li><li>Perney, T. M., Hirning, L. D., Leeman, S. E., Miller, R. 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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-contraction+relationship+in+rat+mesenteric+arterial+smooth+muscle.+Effects+of+exogenous+and+neurogenic+noradrenaline.">Calcium-contraction relationship in rat mesenteric arterial smooth muscle. Effects of exogenous and neurogenic noradrenaline.</a> Pflugers Arch. 436, 262-269 (1998).</li><li>Alagarsamy, S., Johnson, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-dependent+calcium+channel+involvement+in+NMDA-induced+activation+of+NOS.">Voltage-dependent calcium channel involvement in NMDA-induced activation of NOS.</a> Neuroreport. 6, 2250-2254 (1995).</li><li>Su, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRPM7+regulates+cell+adhesion+by+controlling+the+calcium-dependent+protease+calpain.">TRPM7 regulates cell adhesion by controlling the calcium-dependent protease calpain.</a> J Biol Chem. 281, 11260-11270 (2006).</li><li>Dubinsky, J. M., Rothman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+calcium+concentrations+during+"chemical+hypoxia"+and+excitotoxic+neuronal+injury.">Intracellular calcium concentrations during "chemical hypoxia" and excitotoxic neuronal injury.</a> J Neurosci. 11, 2545-2551 (1991).</li><li>George, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sodium+channel+activation+augments+NMDA+receptor+function+and+promotes+neurite+outgrowth+in+immature+cerebrocortical+neurons.">Sodium channel activation augments NMDA receptor function and promotes neurite outgrowth in immature cerebrocortical neurons.</a> J Neurosci. 29, 3288-3301 (2009).</li><li>Price, K. L., Lummis, S. 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Assay Drug Dev Technol.</a> 5, 191-203 (2007).</li><li>Christensen, B. N., Kochukov, M., McNearney, T. A., Taglialatela, G., Westlund, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proton-sensing+G+protein-coupled+receptor+mobilizes+calcium+in+human+synovial+cells.">Proton-sensing G protein-coupled receptor mobilizes calcium in human synovial cells.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 289, C601-C608 (2005).</li><li>Boulay, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+expression+of+a+novel+mammalian+homolog+of+Drosophila+transient+receptor+potential+(Trp)+involved+in+calcium+entry+secondary+to+activation+of+receptors+coupled+by+the+Gq+class+of+G+protein.">Cloning and expression of a novel mammalian homolog of Drosophila transient receptor potential (Trp) involved in calcium entry secondary to activation of receptors coupled by the Gq class of G protein.</a> J Biol Chem. 272, 29672-29680 (1997).</li><li>Nanda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+screening+of+adrenergic+receptors+by+measuring+intracellular+calcium+using+the+FlexStation+scanning+fluorimeter.">Functional screening of adrenergic receptors by measuring intracellular calcium using the FlexStation scanning fluorimeter.</a> Biotechnol J. 4, 417-422 (2009).</li></ol>

세포내 칼슘 2 +과 같은 신경 전달 물질 릴리즈 (3), 심장 활동 전위 (4), 근육 세포 수축 (5), 세포 신호 전달 (6-7) 및 excitotoxic 세포 죽음 (많은 생리와 병리 학적 조건에서 중요한 역할을 담당 8). 세포내 칼슘 2 + 수준의 측정 기능 + - 투과 채널 플라즈마 막이나 세포 organelles에서 칼슘 2의 변화와 공헌을 명료하게하다하는 데 도움이 위의 프로세스 (9-13)에 CA 2 +...

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약의 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th><th> 댓글 (옵션) </th></tr><tr><td> FlexStation 3 </td><td> 분자 장치 </td><td> FLEX3 </td><td></td></tr><tr><td> 96 - 음, FlexStation의 Pipet 도움말 </td><td> 분자 장치 </td><td> 9000-0912 </td><td></td></tr><tr><td> 96 - 웰 플레이트 </td><td> 그라 이너 바이오 - 원 </td><td> 655090 </td><td></td></tr><tr><td> 96 - 웰 지우기 플랫 바텀 플레이트 </td><td> 코스타 </td><td> 3595 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 12430-104 </td><td></td></tr><tr><td> Opti - 멤 </td><td> Invitrogen </td><td> 31985-070 </td><td></td></tr><tr><td> Lipofectamine 2000 </td><td> Invitrogen </td><td> 11668-019 </td><td></td></tr><tr><td> AM Fluo - 4 </td><td> Invitrogen </td><td> F14202 </td><td></td></tr><tr><td> PluronicF - 127 </td><td> Invitrogen </td><td> P3000MP </td><td></td></tr><tr><td> 폴리 - L - ornithine </td><td> 시그마 </td><td> P36551 </td><td></td></tr><tr><td> probenecid </td><td> 시그마 </td><td> P8761 </td><td></td></tr><tr><td> 소 혈청 알부민 </td><td> 시그마 </td><td> A9418 </td><td></td></tr></tbody></table>

cell-based calcium assay for medium to high throughput screening of trp channel functions using flexstation 3

분자 장치 &#39;FlexStation 3 멀티 잘 접시에 자동 형광 측정 가능한 benchtop 다중 모드 microplate 리더입니다. 그것은 학술 설정에서 중간에 높은 처리량 화면에 이상적입니다. 그것은 멀티 채널 pipetter과 기계가 형광 시약의 다양한 형광 변화를 모니터링하기 위해 한 번에 한 컬럼을 읽고 갖춘 통합 유체 전송 모듈이 있습니다. 예를 들어, FlexStation 3 + - 투과 이온 채널과 G 단백질 결합 수용체 세포 무료 칼슘 2 + 수준의 변화를 측정하여 칼슘 2의 기능을 연구하는 데 사용되었습니다. 과도 수용체 잠재적인 (TRP) 채널은 많은 생리와 pathophysiological 기능에 중요한 역할을 nonselective 양이온 채널의 큰 가족입니다. TRP 채널의 대부분은 칼슘 투과하고 활성화시 칼슘 유입을 유도. 이 비디오에서는, 우리는 TRPA1 채널, 다양한 유해 자극에 대해 분자 센서의 약리 프로필을 공부 FlexStation 3 응용 프로그램을 보여줍니다. transiently 또는 안정 96 - 웰 플레이트에서 자란 인간 TRPA1 채널을, 표현 HEK293 세포가 + 민감한 형광 염료 칼슘 2, Fluo - 4, 이러한 세포의 실시간 형광 변경 로드된은의 적용 전과하는 동안 측정 FlexStation 3 플렉스 모드를 사용하여 TRPA1 아고 니스트. putative TRPA1 길항제의 영향도 조사했다. 데이터는 TRPA1 activators와 억제제의 농도 - 반응 관계를 구축하기 위해 SoftMax Pro 소프트웨어에서 전송됩니다.

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Cell-based Calcium Assay for Medium to High Throughput Screening of TRP Channel Functions using FlexStation 3

이 동영상은 FlexStation 3을 사용 인간 TRPA1 채널의 약리 프로필을 공부에 대한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 프로토콜은 세포 준비, 염료 로딩과 microplate 리더 FlexStation 3 작업의 세부 사항을 다룹니다.

FlexStation 3을 사용 TRP 채널 기능의 높은 처리량 검사하는 매체를위한 셀 기반의 칼슘 분석

The Molecular Devices' FlexStation 3 is a benchtop multi-mode microplate reader capable of automated fluorescence measurement in multi-well plates.  It is ...

Research

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