Name: cell-based calcium assay for medium to high throughput screening of trp channel functions using flexstation 3
Uploaded: 2011-08-17T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cell-based Calcium Assay for Medium to High Throughput Screening of TRP Channel Functions using FlexStation 3 at JoVE.com

Мы благодарим доктора. Джон Хэнкок, Рэй Гриль, Эндрю Моррис и Ольга Чумакова за их поддержку. FlexStation 3 система является частью UTHSC Cytodynamic фонда Imaging. Мы также благодарим д-ра. Ardem Patapoutian и Майкл Bandell из исследовательского института Скриппса и геномики Института Новартис Фонд исследований (GNF) для обеспечения HEK293-hTRPA1 стабильной клеточной линии. Исследование частично поддержана грантами NIH (GM081658 для MXZ) и Техасского медицинского центра болезней пищеварительного тракта центр (к HH) и Миссия Connect / TIRR Foundation (для домохозяйств).

1. Сотовые препаратов в 96-луночных Для НЕК293 временно trasfected с человеческими TRPA1 кДНК <ol><li> HEK293 клетки выращивают в течение одного-двух дней в минимальной необходимой среде Дульбекко (DMEM), содержащих 4,5 мг / мл глюкозы (Thermo Scientific, SH3002201), с добавлением 10% тепла инактивиров...

<ol>
	<li>Hu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+TRPA1+channels+by+fenamate+nonsteroidal+anti-inflammatory+drugs.">Activation of TRPA1 channels by fenamate nonsteroidal anti-inflammatory drugs.</a> Pflugers Arch. 459, 579-592 (2010).</li><li>Hu, H., Bandell, M., Petrus, M. J., Zhu, M. X., Patapoutian, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zinc+activates+damage-sensing+TRPA1+ion+channels.">Zinc activates damage-sensing TRPA1 ion channels.</a> Nat Chem Biol. 5, 183-190 (2009).</li><li>Perney, T. M., Hirning, L. D., Leeman, S. E., Miller, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+calcium+channels+mediate+neurotransmitter+release+from+peripheral+neurons.">Multiple calcium channels mediate neurotransmitter release from peripheral neurons.</a> Proc Natl Acad Sci. 83, 6656-6659 (1986).</li><li>Mason, S. A., MacLeod, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+action+potential+duration+and+calcium+regulation+in+males+and+females.">Cardiac action potential duration and calcium regulation in males and females.</a> Biochem Biophys Res Commun. 388, 565-570 (2009).</li><li>Raat, N. J., Wetzels, G. E., DeMey, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-contraction+relationship+in+rat+mesenteric+arterial+smooth+muscle.+Effects+of+exogenous+and+neurogenic+noradrenaline.">Calcium-contraction relationship in rat mesenteric arterial smooth muscle. Effects of exogenous and neurogenic noradrenaline.</a> Pflugers Arch. 436, 262-269 (1998).</li><li>Alagarsamy, S., Johnson, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-dependent+calcium+channel+involvement+in+NMDA-induced+activation+of+NOS.">Voltage-dependent calcium channel involvement in NMDA-induced activation of NOS.</a> Neuroreport. 6, 2250-2254 (1995).</li><li>Su, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRPM7+regulates+cell+adhesion+by+controlling+the+calcium-dependent+protease+calpain.">TRPM7 regulates cell adhesion by controlling the calcium-dependent protease calpain.</a> J Biol Chem. 281, 11260-11270 (2006).</li><li>Dubinsky, J. M., Rothman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+calcium+concentrations+during+"chemical+hypoxia"+and+excitotoxic+neuronal+injury.">Intracellular calcium concentrations during "chemical hypoxia" and excitotoxic neuronal injury.</a> J Neurosci. 11, 2545-2551 (1991).</li><li>George, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sodium+channel+activation+augments+NMDA+receptor+function+and+promotes+neurite+outgrowth+in+immature+cerebrocortical+neurons.">Sodium channel activation augments NMDA receptor function and promotes neurite outgrowth in immature cerebrocortical neurons.</a> J Neurosci. 29, 3288-3301 (2009).</li><li>Price, K. L., Lummis, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FlexStation+examination+of+5-HT3+receptor+function+using+Ca2++-+and+membrane+potential-sensitive+dyes:+advantages+and+potential+problems.">FlexStation examination of 5-HT3 receptor function using Ca2+ - and membrane potential-sensitive dyes: advantages and potential problems.</a> J Neurosci Methods. 149, 172-177 (2005).</li><li>Laude, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+functional+assays+of+recombinant+IP3+receptors.">Rapid functional assays of recombinant IP3 receptors.</a> Cell Calcium. 38, 45-51 (2005).</li><li>Marincsak, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+analgesic+drug,+tramadol,+acts+as+an+agonist+of+the+transient+receptor+potential+vanilloid-1.">The analgesic drug, tramadol, acts as an agonist of the transient receptor potential vanilloid-1.</a> Anesth Analg. 106, 1890-1896 (2008).</li><li>Xie, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+high+throughput+screening+assays+against+three+subtypes+of+Ca(v)3+T-type+channels+using+molecular+and+pharmacologic+approaches.+Assay+Drug+Dev+Technol.">Validation of high throughput screening assays against three subtypes of Ca(v)3 T-type channels using molecular and pharmacologic approaches. Assay Drug Dev Technol.</a> 5, 191-203 (2007).</li><li>Christensen, B. N., Kochukov, M., McNearney, T. A., Taglialatela, G., Westlund, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proton-sensing+G+protein-coupled+receptor+mobilizes+calcium+in+human+synovial+cells.">Proton-sensing G protein-coupled receptor mobilizes calcium in human synovial cells.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 289, C601-C608 (2005).</li><li>Boulay, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+expression+of+a+novel+mammalian+homolog+of+Drosophila+transient+receptor+potential+(Trp)+involved+in+calcium+entry+secondary+to+activation+of+receptors+coupled+by+the+Gq+class+of+G+protein.">Cloning and expression of a novel mammalian homolog of Drosophila transient receptor potential (Trp) involved in calcium entry secondary to activation of receptors coupled by the Gq class of G protein.</a> J Biol Chem. 272, 29672-29680 (1997).</li><li>Nanda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+screening+of+adrenergic+receptors+by+measuring+intracellular+calcium+using+the+FlexStation+scanning+fluorimeter.">Functional screening of adrenergic receptors by measuring intracellular calcium using the FlexStation scanning fluorimeter.</a> Biotechnol J. 4, 417-422 (2009).</li></ol>

Внутриклеточного Са 2 + играет важную роль во многих физиологических и патологических состояний, таких как нейромедиатор релиз (3), сердечной потенциала действия (4), сокращение мышечных клеток (5), сотовые передачи сигнала (6-7), и excitotoxic клеточной смерти ( 8). Измерение внутриклеточног?...

<table border="1"><tbody><tr><th> Название реагента </th><th> Компания </th><th> Номер в каталоге </th><th> Комментарии (необязательно) </th></tr><tr><td> FlexStation 3 </td><td> Molecular Devices </td><td> ПК3 </td><td></td></tr><tr><td> 96-Ну, Советы FlexStation Пипетируйте </td><td> Molecular Devices </td><td> 9000-0912 </td><td></td></tr><tr><td> 96-луночных </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 655090 </td><td></td></tr><tr><td> 96-Ну Открытый плоские пластины Нижний </td><td> Costar </td><td> 3595 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 12430-104 </td><td></td></tr><tr><td> Opti-MEM </td><td> Invitrogen </td><td> 31985-070 </td><td></td></tr><tr><td> Lipofectamine 2000 </td><td> Invitrogen </td><td> 11668-019 </td><td></td></tr><tr><td> Fluo-4 утра </td><td> Invitrogen </td><td> F14202 </td><td></td></tr><tr><td> PluronicF-127 </td><td> Invitrogen </td><td> P3000MP </td><td></td></tr><tr><td> Поли-L-орнитин </td><td> Сигма </td><td> P36551 </td><td></td></tr><tr><td> пробенецид </td><td> Сигма </td><td> P8761 </td><td></td></tr><tr><td> Бычий сывороточный альбумин </td><td> Сигма </td><td> A9418 </td><td></td></tr></tbody></table>

cell-based calcium assay for medium to high throughput screening of trp channel functions using flexstation 3

FlexStation Molecular Devices &#39;3 представляет собой настольный многорежимный планшет ридер, способный автоматизированного измерения флуоресценции в мульти-луночных планшетах. Он идеально подходит для средней и высокой пропускной способностью экраны в академических условиях. Она имеет интегрированный модуль передачи жидкости оснащены многоканальным pipetter и машина читает одну колонку в то время, контролировать изменения флуоресценции различных флуоресцентных реагентов. Например, FlexStation 3 был использован для изучения функции Са 2 +-проницаемые ионные каналы и G-белком рецепторы, измеряя изменения внутриклеточного свободного Са 2 + уровня. Переходный рецепторный потенциал (ГТО) каналы большое семейство неселективных каналов катионов, которые играют важную роль во многих физиологических и патофизиологических функций. Большинство каналов ГТО являются кальций проницаемыми и вызывают приток кальция после активации. В этом видео, мы демонстрируем применение FlexStation 3 до исследования фармакологических профиля TRPA1 канал, молекулярный сенсор для многочисленных вредных раздражителей. НЕК293 временно или стабильно выражения человеческих TRPA1 каналов, вырос в 96-луночных планшетах, которые загружаются с Са 2 +-чувствительного флуоресцентного красителя, Fluo-4, и в реальном времени флуоресценции изменения в этих клетках измеряются до и во время применения TRPA1 агонист используя режим FLEX из FlexStation 3. Влияние предполагаемых TRPA1 антагонист был также рассмотрен. Данные передаются из программного обеспечения SoftMax Pro построить концентрация-ответ отношения TRPA1 активаторов и ингибиторов.

Watch this Scientific Journal Video about Cell-based Calcium Assay for Medium to High Throughput Screening of TRP Channel Functions using FlexStation 3 at JoVE.com

Cell-based Calcium Assay for Medium to High Throughput Screening of TRP Channel Functions using FlexStation 3

Это видео содержит подробный протокол для изучения фармакологического профиля человека TRPA1 каналов с использованием FlexStation 3. Протокол охватывает детали клеточного подготовки, краситель загрузки и эксплуатации микропланшетов читателя, FlexStation 3.

Клеточная Кальций Пробирной для средних и высокопроизводительного скрининга из ГТО Функции канала с помощью FlexStation 3

The Molecular Devices' FlexStation 3 is a benchtop multi-mode microplate reader capable of automated fluorescence measurement in multi-well plates.  It is ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

Полимерные Microarrays высоких Discovery Пропускная биоматериалов

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

Candida albicans Biofilm Chip (CaBChip) for High-throughput Antifungal Drug Screening

Candida albicans Biofilm Chip CaBChip for High-throughput Antifungal Drug Screening

Candida Albicans биопленки Chip (Ca BChip) для высокой пропускной Противогрибковые Скрининг наркотиков

Candida  albicans remains the main etiological agent of candidiasis, which  currently represents the fourth most common nosocomial bloodstream infection ...

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

Высокая пропускная способность экспрессии белков генератора с использованием платформы Микрофлюидных

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Generation of Scalable, Metallic High-Aspect Ratio Nanocomposites in a Biological Liquid Medium

Генерация масштабируемой, металлик высоких-Aspect Ratio нанокомпозитов в биологическом жидкой среде

The goal of this protocol is to describe the synthesis of two novel biocomposites with high-aspect ratio structures. The biocomposites consist of copper ...

Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography

Использование Tomoauto: протокол для высокой пропускной автоматизированной Cryo-электронной томографии

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native ...

High-throughput Identification of Bacteria Repellent Polymers for Medical Devices

Высокая пропускная способность идентификации бактерий репелленты Полимеры для медицинских приборов

Medical devices are often associated with hospital-acquired infections, which place enormous strain on patients and the healthcare system as well as ...

3D Microtissues for Injectable Regenerative Therapy and High-throughput Drug Screening

3D Microtissues для инъекций восстановительной терапии и высок объём наркотиков скрининг

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous ...

Process Optimization using High Throughput Automated Micro-Bioreactors in Chinese Hamster Ovary Cell Cultivation

Оптимизация процесса с использованием высокой пропускной связи Автоматизированные микро-биореакторы в китайском Хомстер яичников культивирования клеток

Optimization of bioprocesses to increase the yield of desired products is of importance in the biopharmaceutical industry. This can be achieved by strain ...

High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay

High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay

Высокопроходичная идентификация сопротивления Pseudomonas syringae pv. Помидор в томате с использованием рассеять рассаду наводнение

Tomato is an agronomically important crop that can be infected by Pseudomonas syringae, a Gram-negative bacterium, resulting in bacterial speck disease. ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

Поколение динамических экологических условий с использованием микрофлюидного устройства с высокой пропускной способностью

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...