Name: cell-based calcium assay for medium to high throughput screening of trp channel functions using flexstation 3
Uploaded: 2011-08-17T12:00:00
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Agradecemos a los Dres. John Hancock, Ray Grill, Andrew Morris y Olga Chumakova por su apoyo. El FlexStation 3 sistema es parte del Fondo de imágenes Cytodynamic UTHSC. También queremos agradecer a los Dres. Ardem Patapoutian y Michael Bandell del Instituto de Investigación Scripps y del Instituto de Genómica de la Fundación de Investigación Novartis (GNF) para proporcionar la línea celular HEK293-hTRPA1 estable. La investigación fue apoyada en parte por subvenciones del NIH (GM081658 a MXZ) y Centro Médico de Texas Centro de Enfermedades Digestivas (a HH) y la Misión de conexión / TIRR Fundación (a HH).

1. Preparaciones de células en placas de 96 pozos Para las células HEK293 transitoria trasfected con cDNA TRPA1 humanos <ol><li> HEK293 células se cultivan para uno o dos días en medio esencial mínimo de Dulbecco (DMEM) que contiene 4,5 mg / ml de glucosa (Thermo Scientific, SH3002201), suplementado con 10% inactivado por calor suero fetal bovino (Invitrogen, 16000-044), 50 unidades / ml de penicilina y 50 mg / ml de estreptomicina (Invitrogen, 15140-163). En el día de la tr...

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	<li>Hu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+TRPA1+channels+by+fenamate+nonsteroidal+anti-inflammatory+drugs.">Activation of TRPA1 channels by fenamate nonsteroidal anti-inflammatory drugs.</a> Pflugers Arch. 459, 579-592 (2010).</li><li>Hu, H., Bandell, M., Petrus, M. J., Zhu, M. X., Patapoutian, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zinc+activates+damage-sensing+TRPA1+ion+channels.">Zinc activates damage-sensing TRPA1 ion channels.</a> Nat Chem Biol. 5, 183-190 (2009).</li><li>Perney, T. M., Hirning, L. D., Leeman, S. E., Miller, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+calcium+channels+mediate+neurotransmitter+release+from+peripheral+neurons.">Multiple calcium channels mediate neurotransmitter release from peripheral neurons.</a> Proc Natl Acad Sci. 83, 6656-6659 (1986).</li><li>Mason, S. A., MacLeod, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+action+potential+duration+and+calcium+regulation+in+males+and+females.">Cardiac action potential duration and calcium regulation in males and females.</a> Biochem Biophys Res Commun. 388, 565-570 (2009).</li><li>Raat, N. J., Wetzels, G. E., DeMey, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-contraction+relationship+in+rat+mesenteric+arterial+smooth+muscle.+Effects+of+exogenous+and+neurogenic+noradrenaline.">Calcium-contraction relationship in rat mesenteric arterial smooth muscle. Effects of exogenous and neurogenic noradrenaline.</a> Pflugers Arch. 436, 262-269 (1998).</li><li>Alagarsamy, S., Johnson, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-dependent+calcium+channel+involvement+in+NMDA-induced+activation+of+NOS.">Voltage-dependent calcium channel involvement in NMDA-induced activation of NOS.</a> Neuroreport. 6, 2250-2254 (1995).</li><li>Su, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRPM7+regulates+cell+adhesion+by+controlling+the+calcium-dependent+protease+calpain.">TRPM7 regulates cell adhesion by controlling the calcium-dependent protease calpain.</a> J Biol Chem. 281, 11260-11270 (2006).</li><li>Dubinsky, J. M., Rothman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+calcium+concentrations+during+"chemical+hypoxia"+and+excitotoxic+neuronal+injury.">Intracellular calcium concentrations during "chemical hypoxia" and excitotoxic neuronal injury.</a> J Neurosci. 11, 2545-2551 (1991).</li><li>George, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sodium+channel+activation+augments+NMDA+receptor+function+and+promotes+neurite+outgrowth+in+immature+cerebrocortical+neurons.">Sodium channel activation augments NMDA receptor function and promotes neurite outgrowth in immature cerebrocortical neurons.</a> J Neurosci. 29, 3288-3301 (2009).</li><li>Price, K. L., Lummis, S. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+functional+assays+of+recombinant+IP3+receptors.">Rapid functional assays of recombinant IP3 receptors.</a> Cell Calcium. 38, 45-51 (2005).</li><li>Marincsak, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+analgesic+drug,+tramadol,+acts+as+an+agonist+of+the+transient+receptor+potential+vanilloid-1.">The analgesic drug, tramadol, acts as an agonist of the transient receptor potential vanilloid-1.</a> Anesth Analg. 106, 1890-1896 (2008).</li><li>Xie, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+high+throughput+screening+assays+against+three+subtypes+of+Ca(v)3+T-type+channels+using+molecular+and+pharmacologic+approaches.+Assay+Drug+Dev+Technol.">Validation of high throughput screening assays against three subtypes of Ca(v)3 T-type channels using molecular and pharmacologic approaches. Assay Drug Dev Technol.</a> 5, 191-203 (2007).</li><li>Christensen, B. N., Kochukov, M., McNearney, T. A., Taglialatela, G., Westlund, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proton-sensing+G+protein-coupled+receptor+mobilizes+calcium+in+human+synovial+cells.">Proton-sensing G protein-coupled receptor mobilizes calcium in human synovial cells.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 289, C601-C608 (2005).</li><li>Boulay, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+expression+of+a+novel+mammalian+homolog+of+Drosophila+transient+receptor+potential+(Trp)+involved+in+calcium+entry+secondary+to+activation+of+receptors+coupled+by+the+Gq+class+of+G+protein.">Cloning and expression of a novel mammalian homolog of Drosophila transient receptor potential (Trp) involved in calcium entry secondary to activation of receptors coupled by the Gq class of G protein.</a> J Biol Chem. 272, 29672-29680 (1997).</li><li>Nanda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+screening+of+adrenergic+receptors+by+measuring+intracellular+calcium+using+the+FlexStation+scanning+fluorimeter.">Functional screening of adrenergic receptors by measuring intracellular calcium using the FlexStation scanning fluorimeter.</a> Biotechnol J. 4, 417-422 (2009).</li></ol>

Intracelular de Ca 2 + juega un papel importante en muchas condiciones fisiológicas y patológicas, como la liberación de neurotransmisores (3), potencial de acción cardíaco (4), la contracción de las células musculares (5), la transducción de señal de celular (6-7), y la muerte celular excitotóxica ( 8). La medición de Ca 2 + intracelular niveles de ayuda a dilucidar los cambios funcionales de Ca 2 +-permeables los canales en la membrana plasmática o organelos intracelulares ...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del reactivo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentarios (opcional) </th></tr><tr><td> FlexStation 3 </td><td> Molecular Devices </td><td> FLEX3 </td><td></td></tr><tr><td> 96-Bueno, Consejos FlexStation Pipet </td><td> Molecular Devices </td><td> 9000-0912 </td><td></td></tr><tr><td> Placas de 96 pozos </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 655090 </td><td></td></tr><tr><td> 96-Bueno, claro placas de fondo plano </td><td> Costar </td><td> 3595 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 12430-104 </td><td></td></tr><tr><td> Opti-MEM </td><td> Invitrogen </td><td> 31985-070 </td><td></td></tr><tr><td> Lipofectamine 2000 </td><td> Invitrogen </td><td> 11668-019 </td><td></td></tr><tr><td> Fluo-4 AM </td><td> Invitrogen </td><td> F14202 </td><td></td></tr><tr><td> PluronicF-127 </td><td> Invitrogen </td><td> P3000MP </td><td></td></tr><tr><td> Poli-L-ornitina </td><td> Sigma </td><td> P36551 </td><td></td></tr><tr><td> probenecid </td><td> Sigma </td><td> P8761 </td><td></td></tr><tr><td> Albúmina de suero bovino </td><td> Sigma </td><td> A9418 </td><td></td></tr></tbody></table>

cell-based calcium assay for medium to high throughput screening of trp channel functions using flexstation 3

El FlexStation Molecular Devices &quot;3 es una mesa de trabajo multi-modo de lector de microplacas capaz de medir la fluorescencia automatizado de múltiples placas. Es ideal para medianas y de alto rendimiento de las pantallas en el ámbito académico. Tiene un módulo de transferencia de fluidos integrado equipado con una pipeta de canales múltiples y la máquina lee una columna a la hora de controlar los cambios de fluorescencia de una variedad de reactivos fluorescentes. Por ejemplo, FlexStation 3 se ha utilizado para estudiar la función de Ca 2 +-permeables los canales de iones y proteínas G-receptores acoplados mediante la medición de los cambios intracelulares de Ca 2 + libre los niveles. Transitoria receptor potencial (TRP) los canales son una gran familia de canales de cationes no selectivos que juegan un papel importante en muchas funciones fisiológicas y fisiopatológicas. La mayoría de los canales TRP son el calcio permeable e inducir la entrada de calcio a la activación. En este video, se demuestra la aplicación de FlexStation 3 para estudiar el perfil farmacológico de los canales TRPA1, un sensor molecular de numerosos estímulos nocivos. HEK293 transitoria o estable expresando humanos TRPA1 canales, que se cultiva en placas de 96 pozos, se cargan con una Ca 2 + sensibles tinte fluorescente, Fluo-4, y en tiempo real los cambios de fluorescencia en estas células se midió antes y durante la aplicación de un agonista de la TRPA1 utilizando el modo de flexión de la FlexStation 3. El efecto de un antagonista de los supuestos TRPA1 también fue examinado. Los datos se transfieren desde el software Pro SoftMax para construir relaciones de concentración-respuesta de TRPA1 activadores e inhibidores.

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Cell-based Calcium Assay for Medium to High Throughput Screening of TRP Channel Functions using FlexStation 3

Este video ofrece un protocolo detallado para estudiar el perfil farmacológico de humanos TRPA1 canales a través de FlexStation 3. El protocolo cubre los detalles de la preparación de la célula, la carga de tinte y el funcionamiento del lector de microplacas, FlexStation 3.

Basados ​​en células de calcio de ensayo para el medio a cribado de alto rendimiento de las funciones del PRT canal utilizando FlexStation 3

The Molecular Devices' FlexStation 3 is a benchtop multi-mode microplate reader capable of automated fluorescence measurement in multi-well plates.  It is ...

Research

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Bioengineering

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Candida albicans Biofilm Chip CaBChip for High-throughput Antifungal Drug Screening

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Proteínas de alto rendimiento del generador de expresiones utilizando una plataforma de microfluidos

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

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Basados ​​en células de calcio de ensayo para el medio a cribado de alto rendimiento de las funciones del PRT canal utilizando FlexStation 3

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