Name: cell-based calcium assay for medium to high throughput screening of trp channel functions using flexstation 3
Uploaded: 2011-08-17T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cell-based Calcium Assay for Medium to High Throughput Screening of TRP Channel Functions using FlexStation 3 at JoVE.com

Vi tackar Dr. John Hancock, Ray Grill, Andrew Morris och Olga Chumakova för deras stöd. Det FlexStation 3-systemet är en del av UTHSC Cytodynamic Imaging Facility. Vi vill också tacka Dr. Ardem Patapoutian och Michael Bandell från Scripps Research Institute och genomik Institutet för Novartis Research Foundation (GNF) för att tillhandahålla HEK293-hTRPA1 stabil cellinje. Forskningen stöds delvis av anslag från NIH (GM081658 till MXZ) och Texas Medical Center matsmältningssjukdomar Center (till HH) och Mission Anslut / TIRR Foundation (till HH).

1. Cell beredningar i 96-brunnars plattor För HEK293-celler övergående trasfected med mänskliga TRPA1 cDNA <ol><li> HEK293 celler odlas i en till två dagar i Dulbecco är minimal Essential Medium (DMEM) som innehåller 4,5 mg / ml glukos (Thermo Scientific, SH3002201), kompletterat med 10% värmeinaktiveras fetalt bovinserum (Invitrogen, 16.000-044), 50 enheter / ml penicillin och 50 mikrogram / ml streptomycin (Invitrogen, 15.140-163). På dagen för transfektion bör cellt?...

<ol>
	<li>Hu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+TRPA1+channels+by+fenamate+nonsteroidal+anti-inflammatory+drugs.">Activation of TRPA1 channels by fenamate nonsteroidal anti-inflammatory drugs.</a> Pflugers Arch. 459, 579-592 (2010).</li><li>Hu, H., Bandell, M., Petrus, M. J., Zhu, M. X., Patapoutian, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zinc+activates+damage-sensing+TRPA1+ion+channels.">Zinc activates damage-sensing TRPA1 ion channels.</a> Nat Chem Biol. 5, 183-190 (2009).</li><li>Perney, T. M., Hirning, L. D., Leeman, S. E., Miller, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+calcium+channels+mediate+neurotransmitter+release+from+peripheral+neurons.">Multiple calcium channels mediate neurotransmitter release from peripheral neurons.</a> Proc Natl Acad Sci. 83, 6656-6659 (1986).</li><li>Mason, S. A., MacLeod, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+action+potential+duration+and+calcium+regulation+in+males+and+females.">Cardiac action potential duration and calcium regulation in males and females.</a> Biochem Biophys Res Commun. 388, 565-570 (2009).</li><li>Raat, N. J., Wetzels, G. E., DeMey, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-contraction+relationship+in+rat+mesenteric+arterial+smooth+muscle.+Effects+of+exogenous+and+neurogenic+noradrenaline.">Calcium-contraction relationship in rat mesenteric arterial smooth muscle. Effects of exogenous and neurogenic noradrenaline.</a> Pflugers Arch. 436, 262-269 (1998).</li><li>Alagarsamy, S., Johnson, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-dependent+calcium+channel+involvement+in+NMDA-induced+activation+of+NOS.">Voltage-dependent calcium channel involvement in NMDA-induced activation of NOS.</a> Neuroreport. 6, 2250-2254 (1995).</li><li>Su, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRPM7+regulates+cell+adhesion+by+controlling+the+calcium-dependent+protease+calpain.">TRPM7 regulates cell adhesion by controlling the calcium-dependent protease calpain.</a> J Biol Chem. 281, 11260-11270 (2006).</li><li>Dubinsky, J. M., Rothman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+calcium+concentrations+during+"chemical+hypoxia"+and+excitotoxic+neuronal+injury.">Intracellular calcium concentrations during "chemical hypoxia" and excitotoxic neuronal injury.</a> J Neurosci. 11, 2545-2551 (1991).</li><li>George, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sodium+channel+activation+augments+NMDA+receptor+function+and+promotes+neurite+outgrowth+in+immature+cerebrocortical+neurons.">Sodium channel activation augments NMDA receptor function and promotes neurite outgrowth in immature cerebrocortical neurons.</a> J Neurosci. 29, 3288-3301 (2009).</li><li>Price, K. L., Lummis, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FlexStation+examination+of+5-HT3+receptor+function+using+Ca2++-+and+membrane+potential-sensitive+dyes:+advantages+and+potential+problems.">FlexStation examination of 5-HT3 receptor function using Ca2+ - and membrane potential-sensitive dyes: advantages and potential problems.</a> J Neurosci Methods. 149, 172-177 (2005).</li><li>Laude, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+functional+assays+of+recombinant+IP3+receptors.">Rapid functional assays of recombinant IP3 receptors.</a> Cell Calcium. 38, 45-51 (2005).</li><li>Marincsak, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+analgesic+drug,+tramadol,+acts+as+an+agonist+of+the+transient+receptor+potential+vanilloid-1.">The analgesic drug, tramadol, acts as an agonist of the transient receptor potential vanilloid-1.</a> Anesth Analg. 106, 1890-1896 (2008).</li><li>Xie, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+high+throughput+screening+assays+against+three+subtypes+of+Ca(v)3+T-type+channels+using+molecular+and+pharmacologic+approaches.+Assay+Drug+Dev+Technol.">Validation of high throughput screening assays against three subtypes of Ca(v)3 T-type channels using molecular and pharmacologic approaches. Assay Drug Dev Technol.</a> 5, 191-203 (2007).</li><li>Christensen, B. N., Kochukov, M., McNearney, T. A., Taglialatela, G., Westlund, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proton-sensing+G+protein-coupled+receptor+mobilizes+calcium+in+human+synovial+cells.">Proton-sensing G protein-coupled receptor mobilizes calcium in human synovial cells.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 289, C601-C608 (2005).</li><li>Boulay, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+expression+of+a+novel+mammalian+homolog+of+Drosophila+transient+receptor+potential+(Trp)+involved+in+calcium+entry+secondary+to+activation+of+receptors+coupled+by+the+Gq+class+of+G+protein.">Cloning and expression of a novel mammalian homolog of Drosophila transient receptor potential (Trp) involved in calcium entry secondary to activation of receptors coupled by the Gq class of G protein.</a> J Biol Chem. 272, 29672-29680 (1997).</li><li>Nanda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+screening+of+adrenergic+receptors+by+measuring+intracellular+calcium+using+the+FlexStation+scanning+fluorimeter.">Functional screening of adrenergic receptors by measuring intracellular calcium using the FlexStation scanning fluorimeter.</a> Biotechnol J. 4, 417-422 (2009).</li></ol>

Intracellulär Ca 2 + spelar en viktig roll i många fysiologiska och patologiska tillstånd, såsom frisättningen av neurotransmittorer (3), hjärt aktionspotential (4), muskelcell kontraktion (5), cell signaltransduktion (6-7), och excitotoxic celldöd ( 8). Mätning av intracellulära Ca 2 + nivåer bidrar till att belysa funktionella förändringar av Ca2 +-genomsläppliga kanaler i plasmamembranet eller intracellulära organeller och bidrag Ca 2 + till ...

<table border="1"><tbody><tr><th> Reagensets namn </th><th> Företag </th><th> Katalognummer </th><th> Kommentarer (frivilligt) </th></tr><tr><td> FlexStation 3 </td><td> Molecular Devices </td><td> FLEX3 </td><td></td></tr><tr><td> 96-Tja, FlexStation Pipettera tips </td><td> Molecular Devices </td><td> 9000-0912 </td><td></td></tr><tr><td> 96-brunnars plattor </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 655.090 </td><td></td></tr><tr><td> 96-Tja Klar flat botten plattor </td><td> Costar </td><td> 3595 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 12430-104 </td><td></td></tr><tr><td> Opti-MEM </td><td> Invitrogen </td><td> 31985-070 </td><td></td></tr><tr><td> Lipofectamine 2000 </td><td> Invitrogen </td><td> 11668-019 </td><td></td></tr><tr><td> Fluo-4:00 </td><td> Invitrogen </td><td> F14202 </td><td></td></tr><tr><td> PluronicF-127 </td><td> Invitrogen </td><td> P3000MP </td><td></td></tr><tr><td> Poly-L-Ornithine </td><td> Sigma </td><td> P36551 </td><td></td></tr><tr><td> probenecid </td><td> Sigma </td><td> P8761 </td><td></td></tr><tr><td> Bovint serumalbumin </td><td> Sigma </td><td> A9418 </td><td></td></tr></tbody></table>

cell-based calcium assay for medium to high throughput screening of trp channel functions using flexstation 3

Molecular Devices &quot;FlexStation 3 är en bänk multi-mode mikrotiterplatta läsare kan automatiserade fluorescens mätning i flera bra plattor. Den är idealisk för medel-till hög kapacitet skärmar i akademisk miljö. Den har en integrerad modul vätska överföra utrustad med ett flerkanals pipetter och maskinen läser en kolumn i taget för att övervaka fluorescens förändringar av olika fluorescerande reagenser. Till exempel har FlexStation 3 använts för att studera funktionen av Ca2 +-genomsläpplig jonkanaler och G-proteinkopplade receptorer genom att mäta förändringar av intracellulära fria Ca 2 + nivåer. Transient receptor potential (TRP) kanaler är en stor familj av icke-selektiva ning kanaler som spelar en viktig roll i många fysiologiska och patofysiologiska funktioner. De flesta av TRP-kanaler är kalcium genomsläpplig och framkalla kalciuminflödet vid aktivering. I denna video visar vi tillämpningen av FlexStation 3 för att studera den farmakologiska profil TRPA1 kanal, en molekylär sensor för många skadliga stimuli. HEK293 celler tillfälligt eller stabilt uttrycka mänskliga TRPA1 kanaler, som odlas i 96-brunnars plattor, är laddade med en Ca2 +-känsliga fluorescerande färg, Fluo-4 och realtid fluorescens förändringar i dessa celler mäts före och under tillämpningen av en TRPA1 agonist med FLEX läget i FlexStation 3. Effekten av en förmodad TRPA1 antagonist undersöktes också. Data överförs från SoftMax Pro att bygga koncentration-respons-relationer TRPA1 aktivatorer och hämmare.

Watch this Scientific Journal Video about Cell-based Calcium Assay for Medium to High Throughput Screening of TRP Channel Functions using FlexStation 3 at JoVE.com

Cell-based Calcium Assay for Medium to High Throughput Screening of TRP Channel Functions using FlexStation 3

Den här videon ger en detaljerad protokoll för att studera den farmakologiska profilen för mänskliga TRPA1 kanaler med FlexStation 3. Protokollet omfattar detaljer cellberedningen, preparat lastning och drift av mikroplattan läsare, FlexStation 3.

Cell-baserad Kalcium-analys för medelstora till stora throughput screening av TRP-kanaler funktioner med FlexStation 3

The Molecular Devices' FlexStation 3 is a benchtop multi-mode microplate reader capable of automated fluorescence measurement in multi-well plates.  It is ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

Polymer Microarrays för hög genomströmning Upptäckt av Biomaterial

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

Candida albicans Biofilm Chip (CaBChip) for High-throughput Antifungal Drug Screening

Candida albicans Biofilm Chip CaBChip for High-throughput Antifungal Drug Screening

Candida albicans Biofilm Chip (Ca BChip) för hög genomströmning antimykotikum Screening

Candida  albicans remains the main etiological agent of candidiasis, which  currently represents the fourth most common nosocomial bloodstream infection ...

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

Hög genomströmning Protein Expression Generator Med en mikroflödessystem plattform

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Generation of Scalable, Metallic High-Aspect Ratio Nanocomposites in a Biological Liquid Medium

Generation av skalbara, Metallic Höga-Aspect Ratio Nanokompositer i en biologisk vätska Medium

The goal of this protocol is to describe the synthesis of two novel biocomposites with high-aspect ratio structures. The biocomposites consist of copper ...

Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography

Använda Tomoauto: Ett protokoll för hög kapacitet Automatiserad Cryo-elektron Tomography

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native ...

High-throughput Identification of Bacteria Repellent Polymers for Medical Devices

Hög genomströmning identifiering av bakterier Repellent Polymers för medicintekniska produkter

Medical devices are often associated with hospital-acquired infections, which place enormous strain on patients and the healthcare system as well as ...

3D Microtissues for Injectable Regenerative Therapy and High-throughput Drug Screening

3D Microtissues för injicerbara regenerativ terapi och hög genomströmning drogkontroll

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous ...

Process Optimization using High Throughput Automated Micro-Bioreactors in Chinese Hamster Ovary Cell Cultivation

Processoptimering med hög genomströmning Automatiserad Mikro-Bioreaktorer i kinesisk hamster äggstockscellodling

Optimization of bioprocesses to increase the yield of desired products is of importance in the biopharmaceutical industry. This can be achieved by strain ...

High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay

High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay

Hög genomströmning Identifiering av resistens mot Pseudomonas syringae pv. Tomat i tomat med plantning Flood Assay

Tomato is an agronomically important crop that can be infected by Pseudomonas syringae, a Gram-negative bacterium, resulting in bacterial speck disease. ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

Generering av dynamiska miljöförhållanden med hjälp av en mikrofluidisk enhet med hög genomströmning

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...