Name: teratoma generation in the testis capsule
Uploaded: 2011-11-07T13:00:00
Duration: 5 min 24 s
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这项工作是由摆围赠款＃TR-1250，电阻RT1-01108，CL1-00502。

注：所有动物的程序必须由IACUC或相当于批准。 所有手术设备，手术前必须经过消毒。必须使用无菌手套，窗帘和纱布。 1。手术前准备<ol><li>获得6周大的小家鼠CbySmn.CB17-Prkdc SCID鼠/ J的雄性小鼠或其他免疫功能低下小鼠品系。 </li><li>消毒所有的手术器械，手套和纱布。 </li><li>游离hPSCs被与accutase注射。 </li><li>计数细胞和悬浮1,000,000每20-30μL细胞基底膜稀释DMEM/F-12 1:1。细胞置于冰上，直到完成。 </li><li>请注意，往往通过注射台盼蓝实验运行是有益的事情。这将有助于识别任何潜在的问题，在任何细胞都浪费掉了。 </li><li>在饲养箱，麻醉你的鼠标，根据你的机构接受的程序。在我们的实验中，我们使用了麻醉ESIA机与异氟醚。小鼠最初被放置在一个感应室1L/min氧和3-4％的异氟醚。一旦麻醉，鼻锥与1L/min的氧气和2-3％的异氟醚。 </li><li>剃光与快船队的腹部，并清理鼠标腹部前壁，从腹部的中心开始向外顺时针方向和工作。首次使用聚维酮碘溶液，然后用70％乙醇。重复3次，每次改变拭子。动物转移到一个加热垫，保持温暖的动物组织培养或解剖罩内。 </li><li>使1厘米的纵向切口，通过皮肤与腹膜无菌手术剪刀，略低于髋关节水平。 </li><li>腹膜，用镊子走向右臀达到另一个无菌forcept和白色脂肪组织连同附睾丸拉出。 </li><li>睾丸放在无菌纱布。 </li><li>补充结核菌素或哈密尔顿（1CC）注射器无线TH的hPSCs被注入。请注意，这是一个好主意，包括一个控制的HPSC行，你知道是WA09（也称为H9亚型），如多能干。这样，你有一个积极的控制，你可以用它来确定是否是有缺陷的注​​射或手术。 </li><li>慢慢的hPSCs（20-30μL）注入睾丸胶囊中心远离任何大血管，停止，如果睾丸胶囊开始膨胀。 </li><li>慢慢取下针，以避免回流的细胞。 </li><li>使用镊子，转移到其原来的位置在腹部的睾丸和脂肪组织回。 </li><li>关闭了2个或3个re​​absorbable缝合腹膜和皮肤与autoclips关闭。 </li><li>鼠标应保持温暖，直到它恢复和手术后的一些镇痛药的形式（见什么是你的饲养箱中接受）一天两次1-2天。 请注意，既不是麻醉剂，也不镇痛干扰与肿瘤的发展。 </li><li>监测日é动物为6-12周的肿瘤生长。很少，肿瘤可能增长至6个星期前，注射后5毫米大小，因此它是重要的监测动物。如果发生这种情况，动物应安乐死和肿瘤处理和分析，像往常一样。 </li><li>一旦肿瘤扪及达到约5毫米大小，麻醉鼠标，根据公认的动物协议的程序和牺牲。 </li><li>取出肿瘤和文件 - 照片，测量尺寸，重量。 </li><li>切成小块的肿瘤，并固定在4％多聚甲醛溶液。商店在4％多聚甲醛，直到样品被送到病理学家切片，染色和分析。 </li></ol> 2。代表性成果： 当此协议的描述和注射的细胞是多能干，一个明显的，直观明显，肿瘤形成大多数在12个星期内。对于像WA09建立HPSC线，我们通常看到的6个星期内肿瘤。 IPSC的线，它是不寻常地看到8-10个星期内肿瘤。这是非常重要的，给老鼠注入了线，被称为是能干，作为阳性对照，以确保该程序是正确执行。肿瘤通常看起来非常庞杂，有许多附加囊肿（图1）。由病理学家的肿瘤样本分析显示分化组织所有三个胚层（图2）。 <img alt="图1" src="/files/ftp_upload/3177/3177fig1.jpg" /> 图1。典型HPSC派生畸胎瘤在睾丸胶囊。 所描述的协议之后，一百万WA09细胞注入免疫受损小鼠的睾丸胶囊。六个星期后畸胎瘤进行了观察。一）的畸胎瘤拉鼠标。 b）关闭了畸胎瘤的图片。注意结构的异质性和囊肿。 <img alt="图2" srC =“/ files/ftp_upload/3177/3177fig2.jpg的”/&gt; 图2。苏木精和曙红染色切片从畸胎瘤显示每个胚层组织。 固定之后，畸胎瘤切片和苏木精伊红染色。由病理学家的分析显示，从每3个胚层细胞的存在。

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	<li>Bradley, A., Evans, M., Kaufman, M. H., Robertson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+germ-line+chimaeras+from+embryo-derived+teratocarcinoma+cell+lines.">Formation of germ-line chimaeras from embryo-derived teratocarcinoma cell lines.</a> Nature. 309, 255-255 (1984).</li><li>Evans, M. J., Kaufman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+in+culture+of+pluripotential+cells+from+mouse+embryos.">Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos.</a> Nature. 292, 154 (1981).</li><li>Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+pluripotent+cell+line+from+early+mouse+embryos+cultured+in+medium+conditioned+by+teratocarcinoma+stem+cells.">Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 78, 7634-7634 (1981).</li><li>Downing, G. J., Battey, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technical+assessment+of+the+first+20+years+of+research+using+mouse+embryonic+stem+cell+lines.">Technical assessment of the first 20 years of research using mouse embryonic stem cell lines.</a> Stem Cells. 22, 1168-1168 (2004).</li><li>Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1145 (1998).</li><li>Reubinoff, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+from+human+blastocysts:+somatic+differentiation+in+vitro.">Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro.</a> Nat Biotechnol. 18, (2000).</li><li>Muller, F. J., Goldmann, J., Loser, P., Loring, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+call+to+standardize+teratoma+assays+used+to+define+human+pluripotent+cell+lines.">A call to standardize teratoma assays used to define human pluripotent cell lines.</a> Cell Stem Cell. 6, 412-412 (2010).</li><li>Brivanlou, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells.+Setting+standards+for+human+embryonic+stem+cells.">Stem cells. Setting standards for human embryonic stem cells.</a> Science. 300, 913-913 (2003).</li><li>Lensch, M. W., Schlaeger, T. M., Zon, L. I., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Teratoma+formation+assays+with+human+embryonic+stem+cells:+a+rationale+for+one+type+of+human-animal+chimera.">Teratoma formation assays with human embryonic stem cells: a rationale for one type of human-animal chimera.</a> Cell Stem Cell. 1, 253-25 (2007).</li><li>Gertow, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organized+development+from+human+embryonic+stem+cells+after+injection+into+immunodeficient+mice.">Organized development from human embryonic stem cells after injection into immunodeficient mice.</a> Stem. Cells. Dev. 13, 421-421 (2004).</li><li>Gertow, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+human+embryonic+stem+cell-derived+teratomas+for+the+assessment+of+pluripotency.">Isolation of human embryonic stem cell-derived teratomas for the assessment of pluripotency.</a> Curr Protoc Stem Cell Biol. Chapter 1, Unit1B 4-Unit1B 4 (2007).</li></ol>

没有利益冲突的声明。

这里介绍的方法，提供一个高度可靠的，从在睾丸胶囊hPSCs产生畸胎瘤直截了当的方法。这项技术有几个关键参数。特别是，它是重要的注入HPSC细胞线，被称为是多能干细胞作为对照。其他重要参数包括注射液和肿瘤的观察之间的时间间隔。对于像WA09细胞株，畸胎瘤应观察6-8周。为IPSC的新线，我们发现，往往需要10个星期。另一个值得关注的是注入细胞的数量。我们注入一百万个细胞，但可以很容易地用较少的细胞进行检测。此外，注入介质是非常重要的。我们发现，我们得到最好的结果，当细胞被注入在基底膜和DMEM/F-12的1:1混合，PBS或DMEM/F-12反对。

<table border="1"><tbody><tr><td> 试剂名称 </td><td> 公司 </td><td> 目录编号 </td></tr><tr><td> accutase </td><td> Invitrogen公司</td><td> A1110501 </td></tr><tr><td> DMEM/F-12 </td><td> Invitrogen公司</td><td> 113300-032 </td></tr><tr><td>基底膜</td><td> BD公司</td><td> 354277 </td></tr></tbody></table>

teratoma generation in the testis capsule

多能干细胞（PSCS）有独特的特点，他们可以分化成所有三个胚层的细胞。这使得他们为许多不同疾病的治疗具有潜在价值的工具。 （胚胎干细胞）与诱导多能干细胞（iPS细胞），并继续与人类胚胎干细胞研究的到来需要有一个实验可以证明，一个特定的细胞是多能干。生殖传输已经证明小鼠胚胎干细胞（MESC）线1,2,3 pluripotence的黄金标准。使用这个实验中，研究人员可以表明，卓制线可以使所有类型的细胞在胚胎生殖细胞4。随着一代人类ESC线5,6，相应的检测来证明这些细胞的pluripotence不清楚，因为人类胚胎干细胞不能为生殖传输测试。作为替代，畸胎瘤法是目前用来展示pluripotency人类多能干细胞（hPSCs）7,8,9。虽然此法最近受到审查，并正在积极探索新技术，畸胎瘤法是目前的黄金标准7。在这个实验中，细胞免疫受损小鼠注入。如果是多能干细胞，最终将发展畸胎瘤和肿瘤的部分，将显示所有3个胚层组织。在畸胎瘤检测，hPSCs可以被注入老鼠的不同领域。最常见的注射部位，包括睾丸胶囊，补肾胶囊，肝，或到腿部皮下或肌肉注射11。在这里，我们描述了一个强大的协议畸胎瘤的肿瘤生长的部位使用睾丸胶囊hPSCs代。

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Teratoma Generation in the Testis Capsule

人类多能干细胞（hPSCs）有无数不同的疾病的潜在治疗。这些细胞的效用在于事实，即他们可以分化成人体任何细胞类型。在这里，我们描述畸胎瘤实验，这用于演示的hPSCs pluripotence的。

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