Name: teratoma generation in the testis capsule
Uploaded: 2011-11-07T13:00:00
Duration: 5 min 24 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Teratoma Generation in the Testis Capsule at JoVE.com

Dette arbejde blev finansieret af CIRM tilskud # TR-1250, RT1-01.108, og CL1-00.502.

Bemærk: Alle dyreforsøg skal godkendes af IACUC eller tilsvarende. Alt kirurgisk udstyr skal steriliseres forud for operationen. Sterile handsker, forhæng og gaze skal anvendes. 1. Forberedelse forud for operationen <ol><li> Opnåelse af 6 uger gamle Mus musculus CbySmn.CB17-Prkdc SCID / J-hanmus eller andre immunkompromitterede stamme af mus. </li><li> Steriliser alle kirurgiske instrumenter, handsker, og gaze. </li><li> Dissocierer hPSCs skal injiceres med accutase. </li><li> Tæl celler og resuspenderes 1.000.000 celler pr 20-30 ul i Matrigel fortyndet 1:1 i DMEM/F-12. Holde cellerne på is indtil færdig. </li><li> Bemærk, at det ofte er nyttigt at udføre en kørsel gennem af eksperimentet, hvor Trypan Blå injiceres. Dette vil hjælpe med at identificere eventuelle problemer, inden de celler går til spilde. </li><li> I terrariet, bedøver musen i overensstemmelse med accepterede procedurer på din institution. I vores eksperimenter, brugte vi en AnesthESIA maskine med isofluran. Mus blev indledningsvis sat i en induktion kammer med 1L/min oxygen og 3-4% isofluran. Når først bedøvet, blev en næsekonus med 1L/min oxygen og 2-3% isofluran anvendes. </li><li> Barbering maven med trimming og rense den forreste væg af muse maven, startende fra midten af ​​maven og arbejder med uret udad. Første anvendelse Povidon-iod-opløsning og derefter vaskes med 70% ethanol. Gentages 3 gange, ændrer podninger hver gang. Overføre dyret en varmepude til at holde dyret varme inde i en vævskultur eller dissekere hætte. </li><li> Foretag en 1 cm indsnit gennem huden og peritoneum med sterile kirurgiske sakse lige under niveauet af hofteleddet. </li><li> Mens du holder bughinden med pincet, nå ned mod højre hofte med en anden steril forcept og trække det hvide fedtvæv sammen med vedhæftede testikler. </li><li> Placer testiklerne på steril gaze. </li><li> Fyld en tuberkulin eller Hamilton (1ml) sprøjte with de hPSCs skal injiceres. Bemærk, at det er en god idé at inkludere en kontrol hPSC linje, som du ved er pluripotente såsom WA09 (også kendt som H9). På denne måde har du en positiv kontrol, som du kan bruge til at afgøre, om din indsprøjtning eller operation var behæftet med fejl. </li><li> Injicer langsomt hPSCs (20-30 ul) i midten af ​​testis kapslen væk fra større blodkar, standse, hvis testikel kapslen begynder at kvælde. </li><li> Fjern kanylen langsomt for at undgå tilbageløb af cellerne. </li><li> Ved hjælp af pincetter, overfører testiklerne og fedtvæv tilbage til sin oprindelige position i maven. </li><li> Nærbillede peritoneum med 2 eller 3 reabsorberbare suturer og lukke huden med autoclips. </li><li> Musen skal holdes varm, indtil den genindvinder og givet en form for smertestillende (se, hvad der er accepteret i din vivarium) efter operation to gange dagligt i 1-2 dage. Bemærk, at hverken anæstetiske eller analgetiske med interferere med tumorudvikling. </li><li> Overvåg the dyr for tumorvækst i 6-12 uger. Meget sjældent kan tumorer vokser til 5 mm i størrelse forud for 6 uger efter injektion, hvilket er det vigtigt at overvåge dyrene. Hvis dette sker, bør dyrene aflives, og de tumorer behandlet og analyseret som sædvanlig. </li><li> Når tumor er håndgribelig og når ca 5 mm i størrelse, bedøver musen og ofre det i henhold til anerkendte dyreforsøg protokol procedurer. </li><li> Fjern tumor og dokumenter i overensstemmelse hermed - fotografi, foranstaltning størrelse, vejer. </li><li> Skær tumor i små stykker og fastgør i 4% paraformaldehydopløsning. Opbevares i 4% paraformaldehyd, indtil prøverne sendes til en patolog for sektionering, farvning og analyse. </li></ol> 2. Repræsentative resultater: Når denne protokol udføres som beskrevet, og injiceres cellelinien er pluripotente, bør en håndgribelig, visuelt klart, tumor dannelse inden for 12 uger mest. Etablerede hPSC linjer som WA09, typisk vitumorer i 6 uger. For IPSC linjer er det ikke usædvanligt at se tumorer inden for 8-10 uger. Det er meget vigtigt at injicere mus med en linje, der vides at være pluripotente, som en positiv kontrol, for at være sikker på, at proceduren er blevet udført korrekt. Tumorer normalt ser meget heterogen og har mange vedhæftede cyster (figur 1). Analyse af tumorprøver af en patolog bør vise differentierede væv fra alle tre kimlag (figur 2). <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/3177/3177fig1.jpg" /> Figur 1. Typisk hPSC afledt teratom i testiklerne kapslen. Efter den beskrevne protokol blev en million WA09 celler injiceret i testiklerne kapslen af ​​en immunkompromitteret mus. Seks uger senere et teratom blev observeret. A) Teratom trukket fra musen. B) Nærbillede billede af teratom. Bemærk heterogenitet og cyste strukturer. <img alt="Figur 2" src = &quot;/ files/ftp_upload/3177/3177fig2.jpg&quot; /&gt; Figur 2. Hematoxylin og eosin-farvede sektioner fra teratom viser væv fra hver kimlag. Efter fiksering blev teratom snittet og farvet med hematoxylin og eosin. Analyse af en patolog afslørede tilstedeværelsen af ​​celler fra hver af de 3 kimlag.

<ol>
	<li>Bradley, A., Evans, M., Kaufman, M. H., Robertson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+germ-line+chimaeras+from+embryo-derived+teratocarcinoma+cell+lines.">Formation of germ-line chimaeras from embryo-derived teratocarcinoma cell lines.</a> Nature. 309, 255-255 (1984).</li><li>Evans, M. J., Kaufman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+in+culture+of+pluripotential+cells+from+mouse+embryos.">Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos.</a> Nature. 292, 154 (1981).</li><li>Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+pluripotent+cell+line+from+early+mouse+embryos+cultured+in+medium+conditioned+by+teratocarcinoma+stem+cells.">Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 78, 7634-7634 (1981).</li><li>Downing, G. J., Battey, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technical+assessment+of+the+first+20+years+of+research+using+mouse+embryonic+stem+cell+lines.">Technical assessment of the first 20 years of research using mouse embryonic stem cell lines.</a> Stem Cells. 22, 1168-1168 (2004).</li><li>Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1145 (1998).</li><li>Reubinoff, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+from+human+blastocysts:+somatic+differentiation+in+vitro.">Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro.</a> Nat Biotechnol. 18, (2000).</li><li>Muller, F. J., Goldmann, J., Loser, P., Loring, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+call+to+standardize+teratoma+assays+used+to+define+human+pluripotent+cell+lines.">A call to standardize teratoma assays used to define human pluripotent cell lines.</a> Cell Stem Cell. 6, 412-412 (2010).</li><li>Brivanlou, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells.+Setting+standards+for+human+embryonic+stem+cells.">Stem cells. Setting standards for human embryonic stem cells.</a> Science. 300, 913-913 (2003).</li><li>Lensch, M. W., Schlaeger, T. M., Zon, L. I., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Teratoma+formation+assays+with+human+embryonic+stem+cells:+a+rationale+for+one+type+of+human-animal+chimera.">Teratoma formation assays with human embryonic stem cells: a rationale for one type of human-animal chimera.</a> Cell Stem Cell. 1, 253-25 (2007).</li><li>Gertow, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organized+development+from+human+embryonic+stem+cells+after+injection+into+immunodeficient+mice.">Organized development from human embryonic stem cells after injection into immunodeficient mice.</a> Stem. Cells. Dev. 13, 421-421 (2004).</li><li>Gertow, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+human+embryonic+stem+cell-derived+teratomas+for+the+assessment+of+pluripotency.">Isolation of human embryonic stem cell-derived teratomas for the assessment of pluripotency.</a> Curr Protoc Stem Cell Biol. Chapter 1, Unit1B 4-Unit1B 4 (2007).</li></ol>

Ingen interessekonflikter erklæret.

Metoden præsenteres her giver en yderst pålidelig og enkel måde at generere teratomer fra hPSCs i testiklerne kapslen. Der er adskillige kritiske parametre i denne teknik. I særdeleshed er det vigtigt at injicere hPSC cellelinier, som vides at være pluripotent som en kontrol. Andre vigtige parametre indbefatter tidsintervallet mellem injektion og tumor observation. For cellelinjer, såsom WA09 skal teratomer observeres i 6-8 uger. For nye IPSC linjer, vi finder der ofte 10 uger er påkrævet. En anden bekymring er antallet af injicerede celler. Vi injicere en million celler, men assayet kan let gøres med færre celler. Desuden er injektion medium vigtig. Vi finder, at vi får de bedste resultater, når cellerne injiceres i en 1:1 blanding af matrigel og DMEM/F-12, i modsætning til PBS eller DMEM/F-12.

<table border="1"><tbody><tr><td> Navn på reagenset </td><td> Firma </td><td> Katalog nummer </td></tr><tr><td> Accutase </td><td> Invitrogen </td><td> A1110501 </td></tr><tr><td> DMEM/F-12 </td><td> Invitrogen </td><td> 113300-032 </td></tr><tr><td> Matrigel </td><td> BD Biosciences </td><td> 354277 </td></tr></tbody></table>

teratoma generation in the testis capsule

Pluripotente stamceller (PSC) har den unikke egenskab, at de kan differentiere til celler fra alle tre kimlag. Dette gør dem potentielt værdifuldt redskab til behandling af mange forskellige sygdomme. Med fremkomsten af ​​inducerede pluripotente stamceller (IPSC&#39;er) og fortsatte forskning med menneskelige embryonale stamceller (hESCs) der er behov for analyser, der kan påvise, at en bestemt cellelinje er pluripotente. Kimlinjeoverførsel er guldstandarden for at demonstrere pluripotence af muse embryonale stamceller (mESC) linjer 1,2,3. Ved hjælp af dette assay, kan forskerne viser, at en mESC linje kan gøre alle celletyper i embryoet herunder kimceller 4. Med genereringen af human ESC linier 5,6, var den passende assay for at bevise pluripotence af disse celler uklar, da humane ESC ikke kan testes for kimlinietransmission. Som et surrogat er teratom assayet for tiden anvendes til at påvise pluripottighed af menneskelige pluripotente stamceller (hPSCs) 7,8,9. Selvom denne analyse for nylig er kommet under kontrol, og nye teknologier er ved at blive aktivt udforskes, den teratom analysen er den nuværende guldstandarden 7. I dette assay bliver cellerne pågældende injiceres i et immunkompromitteret mus. Hvis cellerne er pluripotente, vil et teratom tiden udvikle og dele af tumoren vil vise væv fra alle 3 kimlag 10. I teratom assayet, kan hPSCs injiceres i forskellige områder af musen. De mest almindelige injektionssted omfatter testis kapslen, nyrekapslen, leveren eller i benet enten subkutant eller intramuskulært 11. Her beskriver vi en robust protokol for produktion af teratomer fra hPSCs anvender testis kapslen som stedet for tumorvækst.

Watch this Scientific Journal Video about Teratoma Generation in the Testis Capsule at JoVE.com

Teratoma Generation in the Testis Capsule

Humane pluripotente stamceller (hPSCs) har potentialet til at behandle et utal af forskellige sygdomme. Anvendeligheden af ​​disse celler består i det faktum, at de kan differentiere til enhver celletype i legemet. Her beskriver vi teratom assay, som anvendes til at påvise pluripotence af hPSCs.

Teratom Generation i testiklerne Capsule

Pluripotent stem cells (PSCs) have the unique characteristic that they can differentiate into cells from all three germ layers.  This makes them a ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Making Sense of Listening: The IMAP Test Battery

The ability to hear is only the first step towards making sense of the range of information contained in an auditory signal. Of equal importance are the ...

A Strategy to Identify de Novo Mutations in Common Disorders such as Autism and Schizophrenia

There are several lines of evidence supporting the role of de novo mutations as a mechanism for common disorders, such as autism and schizophrenia. First, ...

Generation of Alginate Microspheres for Biomedical Applications

Generering af alginat mikrosfærer til biomedicinske anvendelser

Alginate-based materials have received considerable attention for biomedical applications because of their hydrophilic nature, biocompatibility, and ...

Technical Aspects of the Mouse Aortocaval Fistula

Tekniske aspekter af Mouse Aortocaval Fistula

Technical aspects of creating an arteriovenous fistula in the mouse are discussed. Under general anesthesia, an abdominal incision is made, and the aorta ...

Renal Capsule Xenografting and Subcutaneous Pellet Implantation for the Evaluation of Prostate Carcinogenesis and Benign Prostatic Hyperplasia

Renal Capsule Xenografting og subkutane Pellet Implantation for Vurdering af prostata Carcinogenesis og benign prostatahyperplasi

New therapies for two common prostate diseases,  prostate cancer (PrCa) and benign prostatic hyperplasia (BPH), depend  critically on experiments ...

Generation and 3-Dimensional Quantitation of Arterial Lesions in Mice Using Optical Projection Tomography

Generation og 3-Dimensional Kvantificering af Arteriel Læsioner i mus Brug Optisk Projection Tomography

The generation and analysis of vascular lesions in appropriate animal models is a cornerstone of research into cardiovascular disease, generating ...

Collection and Extraction of Saliva DNA for Next Generation Sequencing

Indsamling og brydning af spyt DNA til Next Generation Sequencing

The preferred source of DNA in human genetics research is blood, or cell lines derived from blood, as these sources yield large quantities of high quality ...

An In Vitro Dormancy Model of Estrogen-sensitive Breast Cancer in the Bone Marrow: A Tool for Molecular Mechanism Studies and Hypothesis Generation

An In Vitro Dormancy Model of Estrogen-sensitive Breast Cancer in the Bone Marrow: A Tool for Molecular Mechanism Studies and Hypothesis Generation

En<em&gt; In vitro</em&gt; Vækstdvale Model af østrogen-følsomme brystkræft i knoglemarven: Et værktøj for molekylære mekanisme Studier og Hypotese Generation

The study of breast cancer dormancy in the bone marrow is an exceptionally difficult undertaking due to the complexity of the interactions of dormant ...

Rapid and Efficient Generation of Recombinant Human Pluripotent Stem Cells by Recombinase-mediated Cassette Exchange in the AAVS1 Locus

Rapid and Efficient Generation of Recombinant Human Pluripotent Stem Cells by Recombinase-mediated Cassette Exchange in the AAVS1 Locus

Hurtig og effektiv Generation af rekombinant human pluripotente stamceller ved rekombinase-medieret Cassette Exchange i<em&gt; AAVS1</em&gt; Locus

Even with the revolution of gene-targeting technologies led by CRISPR-Cas9, genetic modification of human pluripotent stem cells&#160;(hPSCs)&#160;is ...

Drug Repurposing Hypothesis Generation Using the "RE:fine Drugs" System

Drug nyorientering Hypotese Generation Brug af &quot;RE: fine Drugs&quot; System

The promise of drug repurposing is that existing drugs may be used for new disease indications in order to curb the high costs and time for approval. The ...