Name: teratoma generation in the testis capsule
Uploaded: 2011-11-07T13:00:00
Duration: 5 min 24 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Teratoma Generation in the Testis Capsule at JoVE.com

Dette arbeidet ble finansiert av CIRM tilskudd # TR-1250, RT1-01108, og CL1-00502.

Merk: Alle dyr prosedyrer må godkjennes av IACUC eller tilsvarende. Alt kirurgisk utstyr må steriliseres før operasjonen. Sterile hansker, forheng og gasbind må brukes. 1. Forberedelse før operasjonen <ol><li> Skaff 6 ukers gamle Mus musculus CbySmn.CB17-Prkdc SCID / J hannmus eller annen immunkompromitterte stamme av mus. </li><li> Steriliser alle kirurgiske instrumenter, hansker og gasbind. </li><li> Distansere hPSCs å bli injisert med accutase. </li><li> Telle celler og resuspender 1.000.000 celler per 20-30 mL i matrigel fortynnet 1:1 i DMEM/F-12. Hold celler på is inntil ferdig. </li><li> Merk at ofte er det nyttig å gjøre en gjennomgang av forsøket der Trypan Blå injiseres. Dette vil bidra til å identifisere eventuelle problemer før noen celler blir bortkastet. </li><li> I vivarium, anesthetize musen i henhold til aksepterte prosedyrer ved institusjonen din. I våre forsøk har vi brukt en anesthESIA maskin med isofluran. Musene ble først satt i en induksjon kammer med 1L/min oksygen og 3-4% isofluran. Når bedøvd, ble en nese kjegle med 1L/min oksygen og 2-3% isofluran brukt. </li><li> Barbere magen med clippers, og rengjør fremre vegg av mus magen, fra midten av magen og jobbe klokken utover. Første gangs bruk povidonjodid løsning vask deretter med 70% etanol. Gjenta 3 ganger, endrer vattpinner hver gang. Overfør dyret til en varmepute for å holde dyret varmt inne en vevskultur eller dissekere hette. </li><li> Lag en 1 cm langsgående snitt gjennom huden og peritoneum med sterile kirurgiske saks like under nivået i hofteleddet. </li><li> Mens du holder peritoneum med tang, nå ned mot høyre hofte med en annen steril forcept og trekke ut det hvite fettvevet sammen med vedlagt testiklene. </li><li> Plasser testiklene på steril kompress. </li><li> Fyll en tuberkulinprøve eller Hamilton (1cc) sprøyte with hPSCs skal injiseres. Merk at det er en god idé å inkludere en kontroll hPSC linje som du vet er pluripotent som WA09 (også kjent som H9). På denne måten har du en positiv kontroll som du kan bruke til å finne ut om injeksjon eller operasjon var feil. </li><li> Sakte injiserer de hPSCs (20-30 mL) i midten av testikkel kapselen bort fra noen store blodårer, stoppe hvis testiklene kapselen begynner å svelle. </li><li> Fjern nålen sakte for å unngå refluks av cellene. </li><li> Ved hjelp av pinsett, overføre testiklene og fettvev tilbake til sin opprinnelige posisjon i magen. </li><li> Lukk opp peritoneum med 2 eller 3 reabsorbable suturer og lukke huden med autoclips. </li><li> Musen bør holdes varm før den gjenoppretter og gitt noen form for smertestillende (se hva som er akseptert i vivarium din) etter operasjonen to ganger daglig i 1-2 dager. Vær oppmerksom på at verken bedøvelse eller smertestillende med forstyrre tumor utvikling. </li><li> Overvåk the dyr for tumorvekst i 6-12 uker. Svært sjelden, kan svulstene vokser til 5 mm i størrelse før 6 uker etter injeksjon, derfor er det viktig å overvåke dyrene. Hvis dette skjer, bør dyrene avlives og svulster behandlet og analysert som vanlig. </li><li> Når svulsten er håndgripelig og når ca 5mm i størrelse, anesthetize musen og ofre det i henhold til aksepterte dyr protokoll prosedyrer. </li><li> Fjern tumor og dokument følgelig - fotografi, mål størrelse, veie. </li><li> Skjær svulst i små biter og fikse i 4% paraformaldehyde løsning. Oppbevares i 4% paraformaldehyde inntil prøvene blir sendt til en patolog for seksjonering, farging og analyse. </li></ol> 2. Representative Resultater: Når denne protokollen er gjort som beskrevet og den injiserte cellelinje er pluripotent, bør en håndgripelig, visuelt åpenbar, tumor danne innen 12 uker på det meste. For etablerte hPSC linjer som WA09, vi vanligvis sersvulster innen 6 uker. For iPSC linjer er det ikke uvanlig å se svulster innen 8-10 uker. Det er svært viktig å injisere mus med en linje som er kjent for å være pluripotent, som en positiv kontroll, for å være sikker på at inngrepet ble utført riktig. Svulster vanligvis ser veldig heterogen og har mange festet cyster (figur 1). Analyse av tumorprøver av en patolog bør vise differensierte vev fra alle tre bakterie lag (Figur 2). <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/3177/3177fig1.jpg" /> Figur 1. Typisk hPSC utledet teratom i testis kapselen. Etter beskrevet protokollen, ble én million WA09 celler sprøytes inn i testis kapsel av en immun kompromittert mus. Seks uker senere en teratom ble observert. A) teratom trukket fra musen. B) Lukk opp bilde av teratom. Legg merke til heterogenitet og cyste strukturer. <img alt="Figur 2" src = &quot;/ files/ftp_upload/3177/3177fig2.jpg&quot; /&gt; Figur 2. Hematoxylin og eosin fargete snitt fra teratom viser vev fra hver bakterie lag. Etter fiksering var teratom seksjoneres og beiset med Hematoxylin og eosin. Analyse av en patolog avslørte tilstedeværelsen av celler fra hver av de 3 bakterie lag.

<ol>
	<li>Bradley, A., Evans, M., Kaufman, M. H., Robertson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+germ-line+chimaeras+from+embryo-derived+teratocarcinoma+cell+lines.">Formation of germ-line chimaeras from embryo-derived teratocarcinoma cell lines.</a> Nature. 309, 255-255 (1984).</li><li>Evans, M. J., Kaufman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+in+culture+of+pluripotential+cells+from+mouse+embryos.">Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos.</a> Nature. 292, 154 (1981).</li><li>Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+pluripotent+cell+line+from+early+mouse+embryos+cultured+in+medium+conditioned+by+teratocarcinoma+stem+cells.">Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 78, 7634-7634 (1981).</li><li>Downing, G. J., Battey, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technical+assessment+of+the+first+20+years+of+research+using+mouse+embryonic+stem+cell+lines.">Technical assessment of the first 20 years of research using mouse embryonic stem cell lines.</a> Stem Cells. 22, 1168-1168 (2004).</li><li>Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1145 (1998).</li><li>Reubinoff, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+from+human+blastocysts:+somatic+differentiation+in+vitro.">Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro.</a> Nat Biotechnol. 18, (2000).</li><li>Muller, F. J., Goldmann, J., Loser, P., Loring, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+call+to+standardize+teratoma+assays+used+to+define+human+pluripotent+cell+lines.">A call to standardize teratoma assays used to define human pluripotent cell lines.</a> Cell Stem Cell. 6, 412-412 (2010).</li><li>Brivanlou, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells.+Setting+standards+for+human+embryonic+stem+cells.">Stem cells. Setting standards for human embryonic stem cells.</a> Science. 300, 913-913 (2003).</li><li>Lensch, M. W., Schlaeger, T. M., Zon, L. I., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Teratoma+formation+assays+with+human+embryonic+stem+cells:+a+rationale+for+one+type+of+human-animal+chimera.">Teratoma formation assays with human embryonic stem cells: a rationale for one type of human-animal chimera.</a> Cell Stem Cell. 1, 253-25 (2007).</li><li>Gertow, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organized+development+from+human+embryonic+stem+cells+after+injection+into+immunodeficient+mice.">Organized development from human embryonic stem cells after injection into immunodeficient mice.</a> Stem. Cells. Dev. 13, 421-421 (2004).</li><li>Gertow, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+human+embryonic+stem+cell-derived+teratomas+for+the+assessment+of+pluripotency.">Isolation of human embryonic stem cell-derived teratomas for the assessment of pluripotency.</a> Curr Protoc Stem Cell Biol. Chapter 1, Unit1B 4-Unit1B 4 (2007).</li></ol>

Ingen interessekonflikter erklært.

Metoden som presenteres her gir en svært pålitelig og ukomplisert måte å generere teratomer fra hPSCs i testikkelen kapselen. Det er flere kritiske parametere i denne teknikken. Spesielt er det viktig å injisere hPSC cellelinjer som er kjent for å være pluripotent som en kontroll. Andre viktige parametre er tidsintervallet mellom injeksjon og tumor observasjon. For cellelinjer som WA09, bør teratomer observeres i 6-8 uker. For nye iPSC linjer finner vi at ofte 10 uker er nødvendig. En annen bekymring er antall celler injisert. Vi injiserer en million celler, men analysen kan enkelt gjøres med færre celler. I tillegg er injeksjon middels viktig. Vi finner at vi får de beste resultatene når cellene blir injisert i en 1:1 blanding av matrigel og DMEM/F-12, i motsetning til PBS eller DMEM/F-12.

<table border="1"><tbody><tr><td> Navn på reagensen </td><td> Firma </td><td> Katalognummer </td></tr><tr><td> Accutase </td><td> Invitrogen </td><td> A1110501 </td></tr><tr><td> DMEM/F-12 </td><td> Invitrogen </td><td> 113300-032 </td></tr><tr><td> Matrigel </td><td> BD Biosciences </td><td> 354277 </td></tr></tbody></table>

teratoma generation in the testis capsule

Pluripotent stamceller (PSCs) har den unike egenskap at de kan differensiere i celler fra alle tre bakterie lag. Dette gjør dem en potensielt verdifullt verktøy for behandling av mange forskjellige sykdommer. Med bruk av induserte pluripotent stamceller (iPSCs) og videre forskning med humane embryonale stamceller (hESCs) er det behov for analyser som kan påvise at en bestemt cellelinje er pluripotent. Germline overføring har vært gullstandarden for å demonstrere pluripotence av musen embryonale stamceller (mESC) linjer 1,2,3. Ved hjelp av denne analysen, kan forskerne viser at en mESC linje kan gjøre alle celletyper i embryoet inkludert kjønnsceller 4. Med generasjon av menneskelig ESC linjer 5,6, var den aktuelle analysen å bevise pluripotence av disse cellene uklar ettersom menneskelige ESCs ikke kan testes for germline overføring. Som en surrogat, blir teratom analysen dag brukes til å demonstrere pluripotsering av humane pluripotent stamceller (hPSCs) 7,8,9. Selv om denne analysen har nylig kommet i søkelyset, og nye teknologier blir aktivt utforsket, er det teratom analysen dagens gullstandard 7. I denne analysen, blir cellene aktuelle sprøytet inn en immun kompromittert mus. Hvis cellene er pluripotent, vil en teratom etter hvert utvikle og deler av svulsten vil vise vev fra alle 3 spiren lag 10. I teratom analysen, kan hPSCs injiseres i ulike områder av musen. De vanligste injeksjonssteder inkluderer testis kapselen, nyrene kapsel, leveren, eller i benet enten subkutant eller intramuskulært 11. Her beskriver vi en robust protokoll for generering av teratomer fra hPSCs bruker testis kapsel som sted for tumorvekst.

Watch this Scientific Journal Video about Teratoma Generation in the Testis Capsule at JoVE.com

Teratoma Generation in the Testis Capsule

Humane pluripotent stamceller (hPSCs) har potensial til å behandle en myriade av ulike sykdommer. Nytten av disse cellene ligger i det faktum at de kan differensiere i hvilken som helst celletype i kroppen. Her beskriver vi teratom analysen, som brukes til å demonstrere pluripotence av hPSCs.

Teratom Generation i testis Capsule

Pluripotent stem cells (PSCs) have the unique characteristic that they can differentiate into cells from all three germ layers.  This makes them a ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Making Sense of Listening: The IMAP Test Battery

The ability to hear is only the first step towards making sense of the range of information contained in an auditory signal. Of equal importance are the ...

A Strategy to Identify de Novo Mutations in Common Disorders such as Autism and Schizophrenia

There are several lines of evidence supporting the role of de novo mutations as a mechanism for common disorders, such as autism and schizophrenia. First, ...

Generation of Alginate Microspheres for Biomedical Applications

Generering av Alginat Mikrokuler for biomedisinske applikasjoner

Alginate-based materials have received considerable attention for biomedical applications because of their hydrophilic nature, biocompatibility, and ...

Technical Aspects of the Mouse Aortocaval Fistula

Tekniske aspekter ved Mouse Aortocaval Fistel

Technical aspects of creating an arteriovenous fistula in the mouse are discussed. Under general anesthesia, an abdominal incision is made, and the aorta ...

Renal Capsule Xenografting and Subcutaneous Pellet Implantation for the Evaluation of Prostate Carcinogenesis and Benign Prostatic Hyperplasia

Nedsatt Capsule Xenografting og Subkutan Pellet Implantasjon for bedømmelse av Prostata Karsinogenese og benign prostatahyperplasi

New therapies for two common prostate diseases,  prostate cancer (PrCa) and benign prostatic hyperplasia (BPH), depend  critically on experiments ...

Generation and 3-Dimensional Quantitation of Arterial Lesions in Mice Using Optical Projection Tomography

Generasjon og 3-dimensjonal Kvantifisering av arteriell lesjoner i Mus Bruke optisk projeksjon tomografi

The generation and analysis of vascular lesions in appropriate animal models is a cornerstone of research into cardiovascular disease, generating ...

Collection and Extraction of Saliva DNA for Next Generation Sequencing

Innsamling og Utvinning av spytt DNA for Next Generation Sequencing

The preferred source of DNA in human genetics research is blood, or cell lines derived from blood, as these sources yield large quantities of high quality ...

An In Vitro Dormancy Model of Estrogen-sensitive Breast Cancer in the Bone Marrow: A Tool for Molecular Mechanism Studies and Hypothesis Generation

An In Vitro Dormancy Model of Estrogen-sensitive Breast Cancer in the Bone Marrow: A Tool for Molecular Mechanism Studies and Hypothesis Generation

En<em&gt; In Vitro</em&gt; Dormancy Modell av østrogen-sensitive brystkreft i benmargen: Et verktøy for molekylære mekanismen Studier og Hypotese Generation

The study of breast cancer dormancy in the bone marrow is an exceptionally difficult undertaking due to the complexity of the interactions of dormant ...

Rapid and Efficient Generation of Recombinant Human Pluripotent Stem Cells by Recombinase-mediated Cassette Exchange in the AAVS1 Locus

Rapid and Efficient Generation of Recombinant Human Pluripotent Stem Cells by Recombinase-mediated Cassette Exchange in the AAVS1 Locus

Rask og effektiv produksjon av rekombinant humant Pluripotent stamceller ved rekombinase-mediert Cassette Exchange i den<em&gt; AAVS1</em&gt; Locus

Even with the revolution of gene-targeting technologies led by CRISPR-Cas9, genetic modification of human pluripotent stem cells&#160;(hPSCs)&#160;is ...

Drug Repurposing Hypothesis Generation Using the "RE:fine Drugs" System

Drug gjenbruk Hypotese Generation Bruke &quot;RE: Fine Drugs&quot; System

The promise of drug repurposing is that existing drugs may be used for new disease indications in order to curb the high costs and time for approval. The ...