Name: teratoma generation in the testis capsule
Uploaded: 2011-11-07T13:00:00
Duration: 5 min 24 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Teratoma Generation in the Testis Capsule at JoVE.com

Эта работа финансировалась CIRM гранты # TR-1250, RT1-01108, и CL1-00502.

Примечание: Все животные процедуры должны быть одобрены IACUC или эквивалент. Все хирургические инструменты должны стерилизоваться перед операцией. Стерильные перчатки, марлевые шторы и должны быть использованы. 1. Подготовка перед операцией <ol><li> Получить 6-недельных Муз мышцы CbySmn.CB17-Prkdc SCID / J самцов мышей или других иммунитетом мышах. </li><li> Стерилизовать всех хирургических инструментов, перчаток и марлю. </li><li> Диссоциируют hPSCs, который будет введен с accutase. </li><li> Граф клеток и ресуспендируют 1000000 клеток на 20-30 мкл в матригелем разбавляют 1:1 в DMEM/F-12. Держите клеток на льду пока не закончено. </li><li> Обратите внимание, что часто бывает полезно сделать пробегают эксперимента, где Голубой Трипан вводится. Это поможет определить любые потенциальные проблемы до того, как клетки впустую. </li><li> В виварии, анестезию мыши в соответствии с принятыми процедурами в вашем учреждении. В наших экспериментах мы использовали AnesthОВОСС машины с ИФ. Мыши были изначально заложенных в камере с индукцией 1L/min кислорода и 3-4% в ИФ. После наркоза, носовой конус с 1L/min кислорода и 2-3% ИФ был использован. </li><li> Бритье живота с ножницами, и очистить переднюю стенку брюшной полости мышей, начиная от центра живота и рабочих часовой стрелке наружу. Первое использование повидон-йод раствор затем вымыть с 70% этанола. Повторите 3 раза, меняя тампоны каждый раз. Передача животного грелку держать животное в теплой культуре ткани или рассечения капюшона. </li><li> Сделать 1 см продольный разрез через кожу и брюшину с стерильные хирургические ножницы чуть ниже уровня тазобедренного сустава. </li><li> Удерживая брюшины щипцами, спускаются к правому бедру с другой стерильной forcept и вытащить белую жировую ткань вместе с прикрепленными яичек. </li><li> Поместите яички на стерильную марлю. </li><li> Заполните туберкулин или Гамильтон (1cc) шприц шм hPSCs для инъекций. Обратите внимание, что это хорошая идея включить линию контроля HPSC, что вы знаете, такие, как плюрипотентные WA09 (также известный как H9). Таким образом, у вас есть положительный контроль, который можно использовать для определения вашего места инъекции или операции были допущены нарушения. </li><li> Медленно введите hPSCs (20-30 мкл) в центр капсулы яичка вдали от крупных кровеносных сосудов, остановки, если яичек капсула начинает набухать. </li><li> Вытащите иглу медленно, чтобы избежать рефлюкса клеток. </li><li> Используя щипцы, передает яичек и жирной ткани обратно в исходное положение в области живота. </li><li> Крупным планом брюшины с 2 или 3 reabsorbable швов и закрыть кожу autoclips. </li><li> Мышь должна быть теплой, пока он восстанавливается и с учетом той или иной форме анальгетик (посмотрим, что будет принято в виварии) после операции два раза в день в течение 1-2 дней. Заметим, что ни анестезии, ни обезболивающим с мешают развитию опухоли. </li><li> Монитор-йэлектронной животных для роста опухоли на 6-12 недель. Очень редко, опухоль может вырасти до 5 мм до 6 недель после инъекции, поэтому очень важно следить за животным. Если это произойдет, животные должны быть подвергнуты эвтаназии и опухолей обрабатывается и анализируется, как обычно. </li><li> Как только опухоль ощутима и достигает примерно 5 мм в размерах, анестезию мыши и пожертвовать его в соответствии с принятыми процедурами животных протокола. </li><li> Удаление опухоли и документов соответственно - фотографии, мера размер, вес. </li><li> Вырезать опухоль на мелкие кусочки и зафиксировать в 4% параформальдегид решение. Хранить в 4% параформальдегида до образцы отправляются на патологоанатома для резки, окрашивания и анализа. </li></ol> 2. Представитель Результаты: При этом протоколе делается, как описано, и вводили клетки линии плюрипотентных, ощутимое, визуально очевидно, опухоль должна стать в течение 12 недель, не больше. Для постоянных HPSC линий, как WA09, мы обычно видимопухоли в течение 6 недель. Для линий IPSC это не редкость увидеть опухоль в течение 8-10 недель. Очень важно для введения мышам линии, которая, как известно, плюрипотентные, в качестве положительного контроля, чтобы убедиться, что процедура была выполнена правильно. Опухоль обычно выглядят очень неоднородны и имеют много прилагается кисты (рис. 1). Анализ образцов опухоли на патологоанатом должен показать дифференцированных тканей из всех трех зародышевых листков (рис. 2). <img alt="Рисунок 1" src="/files/ftp_upload/3177/3177fig1.jpg" /> Рисунок 1. Типичная HPSC полученных тератомы в капсуле яичка. После описанного протокола, один миллион WA09 клетки вводили в яичках капсулы иммунодефицитом мыши. Шесть недель спустя тератома не наблюдалось. А) тератомы вытащил из мыши. Б) Закрыть картину тератомы. Обратите внимание на неоднородность и кисты структур. <img alt="Рисунок 2" srс = &quot;/ files/ftp_upload/3177/3177fig2.jpg&quot; /&gt; Рисунок 2. Гематоксилином и эозином срезах, окрашенных в тератома показать тканей каждый росток слоя. После фиксации, тератома была разрезана и окрашивали гематоксилином и эозином. Анализ патолог показал наличие клетки от каждого из 3-х зародышевых листков.

<ol>
	<li>Bradley, A., Evans, M., Kaufman, M. H., Robertson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+germ-line+chimaeras+from+embryo-derived+teratocarcinoma+cell+lines.">Formation of germ-line chimaeras from embryo-derived teratocarcinoma cell lines.</a> Nature. 309, 255-255 (1984).</li><li>Evans, M. J., Kaufman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+in+culture+of+pluripotential+cells+from+mouse+embryos.">Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos.</a> Nature. 292, 154 (1981).</li><li>Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+pluripotent+cell+line+from+early+mouse+embryos+cultured+in+medium+conditioned+by+teratocarcinoma+stem+cells.">Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 78, 7634-7634 (1981).</li><li>Downing, G. J., Battey, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technical+assessment+of+the+first+20+years+of+research+using+mouse+embryonic+stem+cell+lines.">Technical assessment of the first 20 years of research using mouse embryonic stem cell lines.</a> Stem Cells. 22, 1168-1168 (2004).</li><li>Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1145 (1998).</li><li>Reubinoff, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+from+human+blastocysts:+somatic+differentiation+in+vitro.">Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro.</a> Nat Biotechnol. 18, (2000).</li><li>Muller, F. J., Goldmann, J., Loser, P., Loring, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+call+to+standardize+teratoma+assays+used+to+define+human+pluripotent+cell+lines.">A call to standardize teratoma assays used to define human pluripotent cell lines.</a> Cell Stem Cell. 6, 412-412 (2010).</li><li>Brivanlou, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells.+Setting+standards+for+human+embryonic+stem+cells.">Stem cells. Setting standards for human embryonic stem cells.</a> Science. 300, 913-913 (2003).</li><li>Lensch, M. W., Schlaeger, T. M., Zon, L. I., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Teratoma+formation+assays+with+human+embryonic+stem+cells:+a+rationale+for+one+type+of+human-animal+chimera.">Teratoma formation assays with human embryonic stem cells: a rationale for one type of human-animal chimera.</a> Cell Stem Cell. 1, 253-25 (2007).</li><li>Gertow, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organized+development+from+human+embryonic+stem+cells+after+injection+into+immunodeficient+mice.">Organized development from human embryonic stem cells after injection into immunodeficient mice.</a> Stem. Cells. Dev. 13, 421-421 (2004).</li><li>Gertow, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+human+embryonic+stem+cell-derived+teratomas+for+the+assessment+of+pluripotency.">Isolation of human embryonic stem cell-derived teratomas for the assessment of pluripotency.</a> Curr Protoc Stem Cell Biol. Chapter 1, Unit1B 4-Unit1B 4 (2007).</li></ol>

Нет конфликта интересов объявлены.

Метод, представленные здесь обеспечивает высокую надежность, просто средством создания тератомы из hPSCs в яичках капсулы. Есть несколько важных параметров, в этой технике. В частности, важно, чтобы придать HPSC клеточных линий, которые, как известно, плюрипотентные в качестве контроля. Другие важные параметры включают в себя интервал времени между введением и опухолевых наблюдения. Для клеточных линий, как WA09, тератомы следует соблюдать в течение 6-8 недель. Для новых линий IPSC мы находим, что нередко в 10 недель не требуется. Еще одной проблемой является количество клеток вводят. Мы вводить один миллион клеток, но анализ можно легко сделать с меньшим количеством клеток. Кроме того, введение среднего важно. Мы считаем, что мы получим лучшие результаты, когда клетки вводятся в смеси 1:1 матригелем и DMEM/F-12, в отличие от ФСБ или DMEM/F-12.

<table border="1"><tbody><tr><td> Название реагента </td><td> Компания </td><td> Номер по каталогу </td></tr><tr><td> Accutase </td><td> Invitrogen </td><td> A1110501 </td></tr><tr><td> DMEM/F-12 </td><td> Invitrogen </td><td> 113300-032 </td></tr><tr><td> Матригель </td><td> BD Biosciences </td><td> 354277 </td></tr></tbody></table>

teratoma generation in the testis capsule

Плюрипотентных стволовых клеток (ЭСК) имеют уникальные характеристики, что они могут дифференцироваться в клетки всех трех зародышевых листков. Это делает их потенциально ценный инструмент для лечения различных заболеваний. С появлением индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (иПСК) и продолжение исследований с человеческими эмбриональными стволовыми клетками (ЭСК) необходимо для анализов, которые могут продемонстрировать, что определенная линия клеток плюрипотентные. Половые передачи был золотой стандарт для демонстрации pluripotence из мышиных эмбриональных стволовых клеток (мЭСК) линии 1,2,3. С помощью этого анализа, исследователи могут показать, что мЭСК линия может сделать все типы клеток эмбриона в том числе половых клеток 4. При генерации линий ЭСК человека 5,6, соответствующего анализа, чтобы доказать pluripotence этих клеток было неясно, поскольку человеческие эмбриональные клетки не могут быть проверены на передачу зародышевой линии. Как суррогат, тератома анализа в настоящее время используется, чтобы продемонстрировать pluripotпрозрачность в человеческих плюрипотентных стволовых клеток (hPSCs) 7,8,9. Хотя этот анализ в последнее время объектом пристального внимания и новые технологии осваиваются, тератома анализа является текущим золотой стандарт 7. В данном анализе клеток в вопросе вводят в иммунной угрозу мыши. Если плюрипотентные клетки, тератомы, в конечном счете разработать и участки опухоли покажет тканей все 3 зародышевых листков 10. В тератома анализа, hPSCs может быть введен в различных областях мыши. Наиболее распространенные места инъекции включают капсулы яичка, почечную капсулу, печени, или в ногу подкожно или внутримышечно 11. Здесь мы опишем надежный протокол для создания тератомы с использованием hPSCs яичка капсулы в качестве площадки для роста опухоли.

Watch this Scientific Journal Video about Teratoma Generation in the Testis Capsule at JoVE.com

Teratoma Generation in the Testis Capsule

Человека плюрипотентных стволовых клеток (hPSCs) обладают потенциалом для лечения множества различных заболеваний. Полезность этих клеток заключается в том, что они могут дифференцироваться в любой тип клеток в организме. Здесь мы описываем тератома анализа, которые используются для демонстрации pluripotence из hPSCs.

Тератомы поколения в капсулу яичка

Pluripotent stem cells (PSCs) have the unique characteristic that they can differentiate into cells from all three germ layers.  This makes them a ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Making Sense of Listening: The IMAP Test Battery

Оправдание Аудирование: Аккумулятор IMAP испытаний

The ability to hear is only the first step towards making sense of the range of information contained in an auditory signal. Of equal importance are the ...

A Strategy to Identify de Novo Mutations in Common Disorders such as Autism and Schizophrenia

Стратегии для определения де Ново Мутации в общих расстройств, таких как аутизм и шизофрения

There are several lines of evidence supporting the role of de novo mutations as a mechanism for common disorders, such as autism and schizophrenia. First, ...

Generation of Alginate Microspheres for Biomedical Applications

Генерация альгинат микросфер для биомедицинских применений

Alginate-based materials have received considerable attention for biomedical applications because of their hydrophilic nature, biocompatibility, and ...

Technical Aspects of the Mouse Aortocaval Fistula

Технические аспекты свища аортокавальной мышь

Technical aspects of creating an arteriovenous fistula in the mouse are discussed. Under general anesthesia, an abdominal incision is made, and the aorta ...

Renal Capsule Xenografting and Subcutaneous Pellet Implantation for the Evaluation of Prostate Carcinogenesis and Benign Prostatic Hyperplasia

Почечная капсула ксенотрансплантации и подкожной гранулы Имплантация по оценке простаты канцерогенеза и доброкачественной гиперплазии предстательной железы

New therapies for two common prostate diseases,  prostate cancer (PrCa) and benign prostatic hyperplasia (BPH), depend  critically on experiments ...

Generation and 3-Dimensional Quantitation of Arterial Lesions in Mice Using Optical Projection Tomography

Генерация и 3-мерная Количественное поражений артерий у мышей, используя оптической проекционной томографии

The generation and analysis of vascular lesions in appropriate animal models is a cornerstone of research into cardiovascular disease, generating ...

Collection and Extraction of Saliva DNA for Next Generation Sequencing

Сбор и Добыча слюны ДНК к следующей последовательности поколения

The preferred source of DNA in human genetics research is blood, or cell lines derived from blood, as these sources yield large quantities of high quality ...

An In Vitro Dormancy Model of Estrogen-sensitive Breast Cancer in the Bone Marrow: A Tool for Molecular Mechanism Studies and Hypothesis Generation

An In Vitro Dormancy Model of Estrogen-sensitive Breast Cancer in the Bone Marrow: A Tool for Molecular Mechanism Studies and Hypothesis Generation

<em&gt; In Vitro</em&gt; Покой Модель Эстроген-чувствительной рака молочной железы в костном мозге: Инструмент для молекулярный механизм исследований и гипотез поколения

The study of breast cancer dormancy in the bone marrow is an exceptionally difficult undertaking due to the complexity of the interactions of dormant ...

Rapid and Efficient Generation of Recombinant Human Pluripotent Stem Cells by Recombinase-mediated Cassette Exchange in the AAVS1 Locus

Rapid and Efficient Generation of Recombinant Human Pluripotent Stem Cells by Recombinase-mediated Cassette Exchange in the AAVS1 Locus

Быстрое и эффективное создание рекомбинантного человеческого плюрипотентных стволовых клеток с помощью рекомбинантному-опосредованной кассетные бирже в<em&gt; AAVS1</em&gt; Locus

Even with the revolution of gene-targeting technologies led by CRISPR-Cas9, genetic modification of human pluripotent stem cells&#160;(hPSCs)&#160;is ...

Drug Repurposing Hypothesis Generation Using the "RE:fine Drugs" System

Drug перепрофилирования Гипотезы Generation Использование &quot;RE: тонкие наркотики&quot; Система

The promise of drug repurposing is that existing drugs may be used for new disease indications in order to curb the high costs and time for approval. The ...