Name: lectin-based isolation and culture of mouse embryonic motoneurons
Uploaded: 2011-09-15T13:00:00
Duration: 9 min 25 s
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हम उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए सैंड्रा Bargen धन्यवाद. इस काम प्रोटीन अनुसंधान विभाग (PRD, A1.2 टी.पी. (आर सी और टीएस), और RUB अनुसंधान शौकीन, Rektoratsprogramme द्वारा समर्थित किया गया था - wissenschaftlicher Nachwuchs (ए) मोनोक्लोनल 39.4D5 और F55A10 एंटीबॉडी विकासात्मक अध्ययन हाइब्रिडोमा से प्राप्त किया गया. बैंक (DSHB, आयोवा शहर, IA).

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	<li>Vallstedt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+levels+of+repressor+activity+assign+redundant+and+specific+roles+to+Nkx6+genes+in+motor+neuron+and+interneuron+specification.">Different levels of repressor activity assign redundant and specific roles to Nkx6 genes in motor neuron and interneuron specification.</a> Neuron. 31, 743-755 (2001).</li><li>Tsuchida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topographic+organization+of+embryonic+motor+neurons+defined+by+expression+of+LIM+homeobox+genes.">Topographic organization of embryonic motor neurons defined by expression of LIM homeobox genes.</a> Cell. 79, 957-970 (1994).</li><li>Lin, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functionally+related+motor+neuron+pool+and+muscle+sensory+afferent+subtypes+defined+by+coordinate+ETS+gene+expression.">Functionally related motor neuron pool and muscle sensory afferent subtypes defined by coordinate ETS gene expression.</a> Cell. 95, 393-407 (1998).</li><li>Wiese, S., Beck, M., Karch, C., Sendtner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signalling+mechanisms+for+survival+of+lesioned+motoneurons.">Signalling mechanisms for survival of lesioned motoneurons.</a> Acta Neurochir. , 21-35 (2004).</li><li>Gavins, F. N., Chatterjee, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+for+the+study+of+mouse+microcirculation+in+anti-inflammatory+drug+research:+focus+on+the+mesentery+and+cremaster+preparations.">Intravital microscopy for the study of mouse microcirculation in anti-inflammatory drug research: focus on the mesentery and cremaster preparations.</a> J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 49, 1-14 (2004).</li><li>Bullen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopic+imaging+techniques+for+drug+discovery.">Microscopic imaging techniques for drug discovery.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 7, 54-67 (2008).</li><li>Hazelwood, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entering+the+Portal:+Understanding+the+Digital+Image+Recorded+Through+a+Microscope.">Entering the Portal: Understanding the Digital Image Recorded Through a Microscope.</a> Imaging Cellular and Molecular Biological Functions. , 3-43 (2007).</li><li>Hickey, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-selectin+facilitates+emigration+and+extravascular+locomotion+of+leukocytes+during+acute+inflammatory+responses+in+vivo.">L-selectin facilitates emigration and extravascular locomotion of leukocytes during acute inflammatory responses in vivo.</a> J. Immunol. 165, 7164-7170 (2000).</li><li>Cara, D. C., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+as+a+tool+for+studying+recruitment+and+chemotaxis.">Intravital microscopy as a tool for studying recruitment and chemotaxis.</a> Methods Mol. Biol. 239, 123-132 (2004).</li><li>Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LSP1+is+an+endothelial+gatekeeper+of+leukocyte+transendothelial+migration.">LSP1 is an endothelial gatekeeper of leukocyte transendothelial migration.</a> J. Exp. Med. 201, 409-418 (2005).</li><li>Heit, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PI3K+accelerates,+but+is+not+required+for,+neutrophil+chemotaxis+to+fMLP.">PI3K accelerates, but is not required for, neutrophil chemotaxis to fMLP.</a> J. Cell Sci. 121, 205-214 (2008).</li></ol>

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

इस preplating लेक्टिन आधारित तकनीक का लाभ यह है कि यह कम p75 एनटीआर आधारित panning प्रक्रिया की तुलना में महंगा है, और लेक्टिन अधिक एंटीबॉडी से अधिक स्थिर है. संवर्धन छवि में सूचीबद्ध है. 2 और टैब. 1 से पता चलता है कि प्रक्रिया कोशिकाओं के समान संख्या की शुद्धि के लिए अनुमति देता है और इन कोशिकाओं के बहुमत है कि motoneuron मार्कर आइलेट - 1 / 2 व्यक्त करते हैं. सबसे महत्वपूर्ण कदम काठ का रीढ़ की हड्डी के लिए अलग प्रक्रिया है. Meninges और DRGs (छवि 2) निकालना लेक्टिन आधारित preplating द्वारा निम्नलिखित शोधन प्रक्रिया के लिए आवश्यक है. यदि यह सही ढंग से प्रबंधित किया गया है, लगभग सभी कोशिकाओं p75 एनटीआर व्यक्त है (प्रतिनिधि तस्वीर के लिए चित्र देखें 3a. ). आइलेट-1 / 2 की अभिव्यक्ति और p75 एनटीआर सबसे शायद के बीच अंतर के लिए कारण है क्योंकि काठ motoneurons विभिन्न 10 आइलेट - 1 / 2 के उच्च और निम्न स्तर व्यक्त. Immuncytochemical धुंधला हो जाना और बाद में गिनती में आइलेट-1 अभिव्यक्ति / 2 के निम्न स्तर के मामले में यह हमारे ध्यान में बच सकता है के रूप में हम सकारात्मक बनाम नकारात्मक कोशिकाओं (1 Tab.) के लिए सम्मान के साथ कड़े थे. इसके अतिरिक्त, तालिका 1 स्पष्ट रूप से पता चलता है कि एक स्वस्थ हालत में अलग कक्षों प्रक्रिया जीवित रहने के रूप में वहाँ केवल कुछ trypan नीले सकारात्मक कोशिकाओं है कि संकेत मिलता है कि कोशिकाओं अचल क्षतिग्रस्त हो रहे हैं. इस alterative प्रक्रिया भी एकल और इसलिए भ्रूण भ्रूण चूहों से मिश्रित जीनोटाइप litters से motoneurons के अलगाव की अनुमति देता है. अंत में, p75 एनटीआर 6 एंटीबॉडी के साथ panning प्रक्रिया के लिए इस विकल्प के समान है नहीं तो संभव आवेदन पर्वतमाला के मामले में समान क्षमता और माउस भ्रूणीय motoneurons के लिए एक सस्ता और कुशल वैकल्पिक शुद्धि विधि प्रदान करता है.

<table border="1"><tbody><tr><td> अभिकर्मक के नाम </td><td> कंपनी </td><td> सूचीपत्र संख्या </td><td> टिप्पणियाँ </td></tr><tr><td> पाली - डीएल-ओर्निथिन hydrobromide </td><td> सिग्मा </td><td> P8638 </td><td></td></tr><tr><td> Laminin </td><td> Invitrogen </td><td> 23017-015 </td><td></td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Gibco </td><td> 14170 </td><td></td></tr><tr><td> ग्लास coverslips </td><td> थर्मो </td><td></td><td> ँ 10 या 14mm </td></tr><tr><td> Lectin </td><td> सिग्मा </td><td> L5142 </td><td></td></tr><tr><td> सेल संस्कृति डिश </td><td> Nunc </td><td> 150350 </td><td> Nunclon डेल्टा सतह </td></tr><tr><td> हार्स सीरम </td><td> Linaris </td><td> SHD3250ZK </td><td> प्रत्येक बैच के लिए MN संस्कृति के लिए परीक्षण किया गया है </td></tr><tr><td> B27 अनुपूरक </td><td> Gibco </td><td> 17504-044 </td><td></td></tr><tr><td> Glutamax </td><td> Gibco </td><td> 35050-038 </td><td></td></tr><tr><td> CNTF </td><td> सिग्मा </td><td> N0513 </td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td> Applichem </td><td> A1391 </td><td></td></tr><tr><td> Neurobasal </td><td> Gibco </td><td> 21103-041 </td><td></td></tr><tr><td> संदंश </td><td></td><td></td><td> स्टेनलेस स्टील, आकार 4 या 5 </td></tr><tr><td> क्लोम - रस </td><td> वर्थिंगटन </td><td> LS003707 </td><td></td></tr><tr><td> Trypsin अवरोध करनेवाला </td><td> सिग्मा </td><td> T6522 </td><td></td></tr><tr><td> विरोधी आइलेट-1 </td><td> DSHB </td><td> 39.4D5 </td><td> सेल संस्कृति सतह पर तैरनेवाला </td></tr><tr><td> विरोधी Nkx6.1 </td><td> DSHB </td><td> F55A10 </td><td> सेल संस्कृति सतह पर तैरनेवाला </td></tr><tr><td> एंटी - p75 एनटीआर </td><td> Abcam </td><td> Ab8874 </td><td></td></tr></tbody></table> तालिका 3 विशिष्ट अभिकर्मकों और उपकरणों की तालिका.

lectin-based isolation and culture of mouse embryonic motoneurons

Spinal motoneurons develop towards postmitotic stages through early embryonic nervous system development and subsequently grow out dendrites and axons. Neuroepithelial cells of the neural tube that express Nkx6.1 are the unique precursor cells for spinal motoneurons1. Though postmitotic motoneurons move towards their final position and organize themselves into columns along the spinal tract2,3. More than 90% of all these differentiated and positioned motoneurons express the transcription factors Islet 1/2. They innervate the muscles of the limbs as well as those of the body and the inner organs. Among others, motoneurons typically express the high affinity receptors for brain derived neurotrophic factor (BDNF) and Neurotrophin-3 (NT-3), the tropomyosin-related kinase B and C (TrkB, TrkC). They do not express the tropomyosin-related kinase A (TrkA)4. Beside the two high affinity receptors, motoneurons do express the low affinity neurotrophin receptor p75NTR. The p75NTR can bind all neurotrophins with similar but lower affinity to all neurotrophins than the high affinity receptors would bind the mature neurotrophins. Within the embryonic spinal cord, the p75NTR is exclusively expressed by the spinal motoneurons5. This has been used to develop motoneuron isolation techniques to purify the cells from the vast majority of surrounding cells6. Isolating motoneurons with the help of specific antibodies (panning) against the extracellular domains of p75NTR has turned out to be an expensive method as the amount of antibody used for a single experiment is high due to the size of the plate used for panning. A much more economical alternative is the use of lectin. Lectin has been shown to specifically bind to p75NTR as well7. The following method describes an alternative technique using wheat germ agglutinin for a preplating procedure instead of the p75NTR antibody. The lectin is an extremely inexpensive alternative to the p75NTR antibody and the purification grades using lectin are comparable to that of the p75NTR antibody. Motoneurons from the embryonic spinal cord can be isolated by this method, survive and grow out neurites.

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Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons

रीढ़ की हड्डी से अलग माउस भ्रूणीय motoneurons का एक वैकल्पिक तरीका वर्णित है. विधि खाते में तथ्य यह है कि लेक्टिन को कम आत्मीयता तंत्रिका वृद्धि कारक रिसेप्टर p75NTR करने के लिए बाध्य कर सकते हैं लेता है. इस लेक्टिन आधारित preplating p75NTR के खिलाफ एक विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ करने के लिए इसी तरह की शुद्धि की अनुमति देता है.

Lectin आधारित और माउस भ्रूणीय motoneurons के अलगाव संस्कृति

Spinal motoneurons develop towards postmitotic stages through early embryonic nervous system development and subsequently grow out dendrites and axons. ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

विच्छेदन और भ्रूणीय स्पाइनल कॉर्ड से Commissural न्यूरॉन्स की संस्कृति

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Nucleofection और भ्रूण माउस hippocampal और cortical न्यूरॉन्स के प्राथमिक संस्कृति

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay

भ्रूण माउस तंत्रिका स्टेम सेल संस्कृति की स्थापना Neurosphere परख का उपयोग

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life ...

Isolation and Culture of Rat Embryonic Neural Cells: A Quick Protocol

अलगाव और चूहा भ्रूण तंत्रिका कोशिकाओं की संस्कृति: एक त्वरित प्रोटोकॉल

We are describing a quick method to dissociate and culture hippocampal or cortical neurons from E15-17 rat embryos. The procedure can be applied ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

अलगाव और भ्रूण murine तंत्रिका ट्यूब से तंत्रिका शिखा कोशिकाओं की संस्कृति

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

विच्छेदन, संस्कृति, और विश्लेषण<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; भ्रूण ऊतक रेटिना

The process by which  the anterior region of the neural plate gives rise to the vertebrate retina  continues to be a major focus of both clinical and ...

Isolation and Culture of Mouse Cortical Astrocytes

अलगाव और माउस Cortical Astrocytes की संस्कृति

Astrocytes  are an abundant cell type in the mammalian brain, yet much remains to be  learned about their molecular and functional characteristics. In ...

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

भ्रूण अग्रमस्तिष्क से endothelial कोशिकाओं के अलगाव और संस्कृति

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

भ्रूण कृंतक दिमाग से प्राथमिक Mesencephalic डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स के अलगाव, संस्कृति और लंबी अवधि के रखरखाव

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

अलगाव और वयस्क तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं की संस्कृति माउस Subcallosal जोन से

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...