Name: lectin-based isolation and culture of mouse embryonic motoneurons
Uploaded: 2011-09-15T13:00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons at JoVE.com

Мы благодарим Сандра Bargen за отличную техническую поддержку. Эта работа была поддержана белка научно-исследовательского отдела (ПДР, Т. П. А1.2 (RC и TS), а рублей исследований Фондом, Rektoratsprogramme -. Wissenschaftlicher Nachwuchs (AK) моноклональные антитела 39.4D5 и F55A10 были получены из Гибридома развитием исследований Банк (DSHB, Iowa City, IA).

<ol>
	<li>Vallstedt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+levels+of+repressor+activity+assign+redundant+and+specific+roles+to+Nkx6+genes+in+motor+neuron+and+interneuron+specification.">Different levels of repressor activity assign redundant and specific roles to Nkx6 genes in motor neuron and interneuron specification.</a> Neuron. 31, 743-755 (2001).</li><li>Tsuchida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topographic+organization+of+embryonic+motor+neurons+defined+by+expression+of+LIM+homeobox+genes.">Topographic organization of embryonic motor neurons defined by expression of LIM homeobox genes.</a> Cell. 79, 957-970 (1994).</li><li>Lin, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functionally+related+motor+neuron+pool+and+muscle+sensory+afferent+subtypes+defined+by+coordinate+ETS+gene+expression.">Functionally related motor neuron pool and muscle sensory afferent subtypes defined by coordinate ETS gene expression.</a> Cell. 95, 393-407 (1998).</li><li>Wiese, S., Beck, M., Karch, C., Sendtner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signalling+mechanisms+for+survival+of+lesioned+motoneurons.">Signalling mechanisms for survival of lesioned motoneurons.</a> Acta Neurochir. , 21-35 (2004).</li><li>Gavins, F. N., Chatterjee, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+for+the+study+of+mouse+microcirculation+in+anti-inflammatory+drug+research:+focus+on+the+mesentery+and+cremaster+preparations.">Intravital microscopy for the study of mouse microcirculation in anti-inflammatory drug research: focus on the mesentery and cremaster preparations.</a> J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 49, 1-14 (2004).</li><li>Bullen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopic+imaging+techniques+for+drug+discovery.">Microscopic imaging techniques for drug discovery.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 7, 54-67 (2008).</li><li>Hazelwood, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entering+the+Portal:+Understanding+the+Digital+Image+Recorded+Through+a+Microscope.">Entering the Portal: Understanding the Digital Image Recorded Through a Microscope.</a> Imaging Cellular and Molecular Biological Functions. , 3-43 (2007).</li><li>Hickey, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-selectin+facilitates+emigration+and+extravascular+locomotion+of+leukocytes+during+acute+inflammatory+responses+in+vivo.">L-selectin facilitates emigration and extravascular locomotion of leukocytes during acute inflammatory responses in vivo.</a> J. Immunol. 165, 7164-7170 (2000).</li><li>Cara, D. C., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+as+a+tool+for+studying+recruitment+and+chemotaxis.">Intravital microscopy as a tool for studying recruitment and chemotaxis.</a> Methods Mol. Biol. 239, 123-132 (2004).</li><li>Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LSP1+is+an+endothelial+gatekeeper+of+leukocyte+transendothelial+migration.">LSP1 is an endothelial gatekeeper of leukocyte transendothelial migration.</a> J. Exp. Med. 201, 409-418 (2005).</li><li>Heit, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PI3K+accelerates,+but+is+not+required+for,+neutrophil+chemotaxis+to+fMLP.">PI3K accelerates, but is not required for, neutrophil chemotaxis to fMLP.</a> J. Cell Sci. 121, 205-214 (2008).</li></ol>

Нет конфликта интересов объявлены.

Преимущество этого лектина основе preplating техники является то, что дешевле, чем p75 NTR основе панорамирование процедуры, и лектин более стабилен, чем антитела. Обогащения приведены на рис. 2 и Tab. 1 показывает, что процедура позволяет очистки одинаковое число клеток и что большинство из них клетки экспрессируют маркер мотонейрона Островок-1 / 2. Наиболее важным шагом является изоляция процедура поясничного спинного мозга. Удаление мозговых оболочек и ДРГ (рис. 2) имеет важное значение для следующей процедуры очистки лектина основе preplating. Если бы это было правильно управлять, почти все клетки экспрессируют p75 NTR (для репрезентативную картину см. рис. 3а). Причина разницы между выражением Островок-1 / 2 и p75 NTR, скорее всего, потому что поясничных мотонейронов дифференциально выразить высшие и низшие уровни Островок-1 / 2 10. В случае низкого уровня Островок-1 / 2 выражение это, возможно, избежал нашего внимания в immuncytochemical окрашивания и последующего подсчета, как мы были строгими по отношению к положительным по сравнению с отрицательным клеток (табл. 1). Кроме того, в таблице 1 наглядно показывает, что изолированные клетки выживают процедура в здоровом состоянии, как Есть только несколько трипанового-синих положительных клеток, которые указывают, что клетки необратимо повреждены. Это альтернативой процедура также позволяет изоляции мотонейроны из одного эмбриона и, следовательно, смешанных пометов генотипа из эмбриональных мышей. В заключение, эта альтернатива панорамирование процедуру с p75 NTR антител 6 имеет аналогичные, если не идентичными возможностями с точки зрения возможных областей применения и обеспечивает дешевый и эффективный альтернативный метод очистки для мышиных эмбриональных мотонейронов.

<table border="1"><tbody><tr><td> Название реагента </td><td> Компания </td><td> Номер в каталоге </td><td> Комментарии </td></tr><tr><td> Поли-DL-орнитин гидробромида </td><td> Сигма </td><td> P8638 </td><td></td></tr><tr><td> Ламинин </td><td> Invitrogen </td><td> 23017-015 </td><td></td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Гибко </td><td> 14170 </td><td></td></tr><tr><td> Стекла покровные </td><td> Thermo </td><td></td><td> Ø 10 или 14 мм </td></tr><tr><td> Лектин </td><td> Сигма </td><td> L5142 </td><td></td></tr><tr><td> Блюдо клеточных культур </td><td> Nunc </td><td> 150350 </td><td> Nunclon дельта поверхности </td></tr><tr><td> Лошадиная сыворотка </td><td> Linaris </td><td> SHD3250ZK </td><td> Каждая партия должна быть проверена на MN культуры </td></tr><tr><td> Дополнение B27 </td><td> Гибко </td><td> 17504-044 </td><td></td></tr><tr><td> Glutamax </td><td> Гибко </td><td> 35050-038 </td><td></td></tr><tr><td> CNTF </td><td> Сигма </td><td> N0513 </td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td> AppliChem </td><td> A1391 </td><td></td></tr><tr><td> Neurobasal </td><td> Гибко </td><td> 21103-041 </td><td></td></tr><tr><td> Щипцы </td><td></td><td></td><td> Нержавеющая сталь, размер 4 или 5 </td></tr><tr><td> Трипсин </td><td> Уортингтон </td><td> LS003707 </td><td></td></tr><tr><td> Трипсин-ингибитора </td><td> Сигма </td><td> T6522 </td><td></td></tr><tr><td> Анти-Островок-1 </td><td> DSHB </td><td> 39.4D5 </td><td> Супернатант культуры клеток </td></tr><tr><td> Анти-Nkx6.1 </td><td> DSHB </td><td> F55A10 </td><td> Супернатант культуры клеток </td></tr><tr><td> Анти-p75 NTR </td><td> Abcam </td><td> Ab8874 </td><td></td></tr></tbody></table> Таблица 3. Таблица специфических реагентов и оборудования.

lectin-based isolation and culture of mouse embryonic motoneurons

Спинной мотонейронов развиваться в направлении постмитотических стадии, через раннее эмбриональное развитие нервной системы, а затем вырастают из дендритов и аксонов. Нейроэпителиальных клеток нервной трубки, которые выражают Nkx6.1 являются уникальными клеток-предшественников для спинальных мотонейронов 1. Хотя постмитотических мотонейронов продвижения к их окончательное положение и организовать себя в колонны вдоль спинного тракта 2,3. Более 90% всех этих дифференцированных и расположены мотонейроны выразить транскрипционных факторов Островок 1 / 2. Они иннервируют мышцы конечностей, а также тела и внутренних органов. Среди прочего, мотонейроны обычно выражают высокую рецепторов сродством к мозгу нейротрофического фактора (BDNF) и нейротрофина-3 (NT-3), тропомиозин связанных киназы В и С (TrkB, TrkC). Они не выражают тропомиозин связанных киназы (TrkA) 4. Рядом две высокие рецепторы близости, мотонейроны действительно выражают низким сродством нейротрофина рецептор p75 NTR. P75 NTR может связать все нейротрофинов с аналогичными, но более низким сродством ко всем нейротрофинов, чем высокое сродство рецепторов свяжет зрелых нейротрофинов. В течение эмбрионального спинного мозга, p75 NTR исключительно выраженную спинного мотонейронов 5. Это были использованы для разработки методов мотонейрона изоляции, чтобы очистить клетки от подавляющего большинства окружающих клеток 6. Изоляция мотонейронов с помощью специфических антител (панорамирование) против внеклеточные домены p75 NTR имеет оказалась дорогой метод, как количество антител, используемых для одного эксперимента высок из-за размера пластины используются для панорамирования. Гораздо более экономичной альтернативой является использование лектина. Лектин было показано, что специфически связываться с p75 NTR, а 7. Следующий метод описывает альтернативные технологии с использованием агглютинин зародышей пшеницы для preplating процедуру вместо p75 NTR антител. Лектин очень недорогая альтернатива p75 NTR антител и очистки классов использованием лектина сопоставимы, что и p75 NTR антител. Мотонейронов из эмбрионального спинного мозга могут быть изолированы с помощью этого метода, выжить и развиваться из нейритов.

Watch this Scientific Journal Video about Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons at JoVE.com

Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons

Альтернативный способ выделения мышиных эмбриональных мотонейроны от спинного мозга описывается. Метод принимает во внимание тот факт, что лектина может связываться с низким сродством роста нервов p75NTR рецептор фактора. Это лектина основе preplating позволяет очистки аналогичен режиму, специфических антител против p75NTR.

Лектин изоляции, основанные на культуре и мышь мотонейронов Эмбриональные

Spinal motoneurons develop towards postmitotic stages through early embryonic nervous system development and subsequently grow out dendrites and axons. ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Разбор и культуры спаечный Нейроны из эмбриональных спинного мозга

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Nucleofection и первичной культуры эмбриональных Мышь гиппокампа и корковых нейронов

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay

Создание эмбриональных Мышь нейронные культуры стволовых клеток Использование Neurosphere Пробирной

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life ...

Isolation and Culture of Rat Embryonic Neural Cells: A Quick Protocol

Выделение и культуры крысы эмбриональных нервных клеток: Быстрый протокол

We are describing a quick method to dissociate and culture hippocampal or cortical neurons from E15-17 rat embryos. The procedure can be applied ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

Выделение и культуры клеток нервного гребня из эмбриональных мышей нервной трубки

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

Dissection, культуры и анализ<em&gt; Xenopus Хепориз</em&gt; Эмбриональные ткани сетчатки

The process by which  the anterior region of the neural plate gives rise to the vertebrate retina  continues to be a major focus of both clinical and ...

Isolation and Culture of Mouse Cortical Astrocytes

Выделение и культуры мышь кортикальной астроциты

Astrocytes  are an abundant cell type in the mammalian brain, yet much remains to be  learned about their molecular and functional characteristics. In ...

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

Выделение и культуры эндотелиальных клеток из эмбриональных переднего мозга

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Изоляция, культуры и долгосрочного поддержания первичного теменной дофаминергических нейронов из эмбриональных грызунов Brains

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

Выделение и культуры взрослых нервные стволовые клетки от мыши зоны расположенный под мозолистым телом

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...