Name: a simple chelex protocol for dna extraction from anopheles spp.
Uploaded: 2013-01-09T12:00:00
Duration: 7 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp. at JoVE.com

המחברים הם חבים לראשים, מוכתרים והקהילות של Macha לunwaveing ​​לשתף הפעולה במהלך אוספים לדוגמא שדה יתושים. ד&quot;ר דאג נוריס ורבקה קנט הציע מומחיות רבה ערך על פרוטוקול ההמלחה החוצה. עבודה זו מומנה על ידי מערכת ג&#39;ונס הופקינס מלרית מכון מחקר פיילוט המענק. סטנדרטי הטפיל DNA מעבדת יתושים ונתרמו באדיבות על ידי MR4 סוג, אמריקאי ואוספת תרבות.

1. Dissection הכנת דגימות יתושים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יתוש מקום על חיתוך קטן של parafilm והר על ביתור מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכסות בטיפת מי deionized לרכך רקמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חתוך נבלת היתוש בדיוק במפרק בין בית החזה והבטן, ובכך סחבתי את הראש ובית החזה מסעיף הבטן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר כל קטע יתושים גזורים לתוך צינור נקי autoclaved 1.5 מ&quot;ל microcentrifuge prelabeled עם פרטי יתושי ת.ז וכראוי מסומן לציון סעיף גוף (לדוגמה: &quot;מ &#39;&quot; לקטע באמצע בטן; &quot;HT&quot; לראש ובית החזה בסעיף). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השלך parafilm ולנגב במת מיקרוסקופ בזהירות עם 70% אלכוהול טבול Kimwipe לפני עיבוד היתוש הבא. </li></ol> 2. הפקת דנ&quot;א מדוגמאות יתושים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 20 μl פיפטה של ​​מים לתוך צינור deionized מדגם עצת פיפטה שימוש לטחון סעיף היתוש השקוע באו&quot;םהשעית iform. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 100 μl של פתרון סאפונין 1% לhomogenate מדגם ותמהיל ידי vortexing הרגעי העדין autoclaved 1X PBS /. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה בטמפרטורת חדר למשך 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב XG 20000 עבור 2 דקות וזורקים supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה בμl 1X PBS 100. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה שוב ב20000 XG עבור 2 דקות וזורקים supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על ידי vortexing העדין (5 שניות), resuspend גלולה במי deionized סטרילי μl 75 ו 25 μl של 20% השעית w / v Chelex-100 שרף במי deionized. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חור פירס במכסה של צינור מדגם באמצעות מזרק 23 ז סטרילי flamed במבער בונזן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השעית רתיחת מדגם באמבט מים במתקן צף (או בבלוק חימום) למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב XG 20000, עבור פתרון ה-DNA העברה התפתח 1 דקות ולתוך בקבוקון האחסון prelabeled לשימוש כתבנית ביישומי PCR. </li></ol> 3. Plasmodium falciparum genotyping ואנופלסspp. זיהוי מולקולרי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2.5 μl של תמצית ה-DNA Chelex ב25 תגובות PCR μl כדי לבדוק את איכות דנ&quot;א 11, לזהות מיני אנופלס 10 ולגנוטיפ פ falciparum 12 דלקות בלוטת אמצע בטן ורוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למקסם את תשואת amplicon, במיוחד לפ איתור falciparum, כולל 1.5x אלבומין בסרום שור (BSA) בבדיקת PCR. הרכב התגובה הבא מומלץ: (2.5 תבנית μl, 0.25 פריימרים מיקרומטר, מגנזיום כלוריד מיקרומטר 1.5, 200 dNTPs מיקרומטר, 1X PCR חיץ, 1.5x BSA וDNA פולימראז 1.0U Taq, ב 25 כרכי μl). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לבדוק לאיכות ה-DNA בתמצית, להגביר אזור דהידרוגנז פרוקי רגלי המיטוכונדריה ניקוטינמיד אדנין dinucleotide (NADH) מקטע 4 (ND4) גן (פריימרים ND4FW [5&#39;-GTD יאט tta TGA TTR CCT ​​AA-3 &#39;] וND4RV [5&#39; CTT-CGD CTT CCW ADW CGT TC-3 &#39;]; מצפה מוצר 400bp) 11,13. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לבדל אנופלס גמביהדואר SL. מיני אחים (An. gambiae ss ו. arabiensis בלבד), להגביר אזור איגוף SNPs באזור spacer intergenic (IGS), (פריימרים האו&quot;ם [5&#39;-GTGTGCCCCTTCCTCGATGT-3 &#39;], GA [5&#39;-CTGGTTTGGTCGGCACGTTT- 3 &#39;], AR [5&#39;-AAGTGTCCTTCTCCATCCTA-3&#39;]; מצפה 390bp המוצר gambiae ss, 315bp arabiensis) 10,11. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור ההקלדה פ פולימורפיזמים סמי התנגדות antifolate falciparum, לבצע PCR המקונן כדי להגביר אזור איגוף קודונים חומצת אמינו 108, 51, 59, 16 ו 164 בטפיל dihydrofolate רדוקטאז (DHFR) גן: עגולי פריימרים עיקריים: M1 [5&#39;-TTTATGATGGAACAAGTCTGC-3 &#39;] וM5 [5&#39;-AGTATATACATCGCTAACAGA-3&#39;] עגולים פריימרים שניים: M3 [5&#39;-TTTATGATGGAACAAGTCTGCGACGTT-3 &#39;] עם F / [5&#39;-AAATTCTTGATAAACAACGGAAACCTTTTA-3&#39;] או F [5&#39;-GAAATGTAATTCCCTAGATATGGAATATT-3] עם M4 [5&#39;-TTAATTTCCCAAGTAAAACTATTAGAGCTTC-3 &#39;]). גם להגביר אזור המכיל חומצת אמינו קודונים 436, 437, 540, 581 אnd 613 בפ synthetase גן falciparum dihydropteroate (DHPS): הסבב הראשוני פריימרים R2 [5&#39;-AACCTAAACGTGCTGTTCAA-3 &#39;] עם R / [5&#39;-AATTGTGTGATTTGTCCACAA3&#39;]; פריימרים עגולים משניים J: [5&#39;-&#39;TGCTAGTGTTATAGATATAGGTGGAGAAAGC-3&#39;] עם K / [5&#39;-CTATAACGAGGTATTGCATTTATTGCAAGAA-3 &#39;] או K: [5&#39;-TGCTAGTGTTATAGATATAGGATGAGCATC-3 &#39;] עם K /, או L [5&#39;-ATAGGATACTATTTGATATTGATATTGGACCAGGATTCG-3 &#39;] עם L / [5&#39;-5TATTACAACATTTTGATCATTCGCGCAACCGG-3&#39;] 12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 4 amplicon μl הכפוף לdigestions אלל הספציפי הגבלה באנזים 30 תגובות μl בעקבות הוראות היצרן, כדי לזהות פולימורפיזמים סמים antifolate התנגדות הקשורים 12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 5 μl הנושא של ה-PCR amplicon (או 15 μl הגבלת התקציר) לכל נתיב של 2% ג&#39;ל ethidium רומיד המוכתם agarose לאלקטרופורזה (100 - 120V) ולדמיין להקות תחת קוף UV. </li></ol>

<ol>
	<li>Bonnet, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+antimalarial+treatment+in+Guinea:+in+vivo+study+of+two+artemisinin+combination+therapies+in+Dabola+and+molecular+markers+of+resistance+to+sulphadoxine-pyrimethamine+in+N'Zerekore.">Efficacy of antimalarial treatment in Guinea: in vivo study of two artemisinin combination therapies in Dabola and molecular markers of resistance to sulphadoxine-pyrimethamine in N'Zerekore.</a> Malar. J. 6, 54 (2007).</li><li>Nsimba, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sulphadoxine/pyrimethamine+versus+amodiaquine+for+treating+uncomplicated+childhood+malaria+in+Gabon:+a+randomized+trial+to+guide+national+policy.">Sulphadoxine/pyrimethamine versus amodiaquine for treating uncomplicated childhood malaria in Gabon: a randomized trial to guide national policy.</a> Malar. J. 7, 31 (2008).</li><li>Oyewole, I. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behaviour+and+population+dynamics+of+the+major+anopheline+vectors+in+a+malaria+endemic+area+in+southern+Nigeria.">Behaviour and population dynamics of the major anopheline vectors in a malaria endemic area in southern Nigeria.</a> J. Vector Borne Dis. 44, 56-64 (2007).</li><li>Harris, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large+proportion+of+asymptomatic+Plasmodium+infections+with+low+and+sub-microscopic+parasite+densities+in+the+low+transmission+setting+of+Temotu+Province,+Solomon+Islands:+challenges+for+malaria+diagnostics+in+an+elimination+setting.">A large proportion of asymptomatic Plasmodium infections with low and sub-microscopic parasite densities in the low transmission setting of Temotu Province, Solomon Islands: challenges for malaria diagnostics in an elimination setting.</a> Malar. J. . 9, 254 (2010).</li><li>Ouedraogo, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substantial+contribution+of+submicroscopical+Plasmodium+falciparum+gametocyte+carriage+to+the+infectious+reservoir+in+an+area+of+seasonal+transmission.">Substantial contribution of submicroscopical Plasmodium falciparum gametocyte carriage to the infectious reservoir in an area of seasonal transmission.</a> PLoS ONE. 4, e8410 (2009).</li><li>Birx, D., de Souza, M., Nkengasong, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+challenges+in+the+scaling+up+of+HIV,+TB,+and+malaria+programs:+The+interaction+of+health+and+laboratory+systems,+clinical+research,+and+service+delivery.">Laboratory challenges in the scaling up of HIV, TB, and malaria programs: The interaction of health and laboratory systems, clinical research, and service delivery.</a> Am. J. Clin. Pathol. 131, 849-851 (2009).</li><li>Ishengoma, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Health+laboratories+in+the+Tanga+region+of+Tanzania:+the+quality+of+diagnostic+services+for+malaria+and+other+communicable+diseases.">Health laboratories in the Tanga region of Tanzania: the quality of diagnostic services for malaria and other communicable diseases.</a> Ann. Trop. Med. Parasitol. 103, 441-453 (2009).</li><li>Alonso, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+research+agenda+for+malaria+eradication:+vector+control.">A research agenda for malaria eradication: vector control.</a> PLoS Med. 8, e1000401 (2011).</li><li>Grimberg, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+efficient+non-organic+procedure+for+the+isolation+of+genomic+DNA+from+blood.">A simple and efficient non-organic procedure for the isolation of genomic DNA from blood.</a> Nucleic Acids Res. 17, 8390 (1989).</li><li>Scott, J. A., Brogdon, W. G., Collins, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Indentification+of+single+specimens+of+the+Anopheles+gambiae+complex+by+polymerase+chain+reaction.">Indentification of single specimens of the Anopheles gambiae complex by polymerase chain reaction.</a> American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 49, 520-529 (1993).</li><li>Kent, R. J., Norris, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+mammalian+blood+meals+in+mosquitoes+by+a+multiplexed+polymerase+chain+reaction+targeting+cytochrome+B.">Identification of mammalian blood meals in mosquitoes by a multiplexed polymerase chain reaction targeting cytochrome B.</a> Am. J. Trop. Med. Hyg. 73, 336-342 (2005).</li><li>Duraisingh, M. T., Curtis, J., Warhurst, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmodium+falciparum:+detection+of+polymorphisms+in+the+dihydrofolate+reductase+and+dihydropteroate+synthetase+genes+by+PCR+and+restriction+digestion.">Plasmodium falciparum: detection of polymorphisms in the dihydrofolate reductase and dihydropteroate synthetase genes by PCR and restriction digestion.</a> Exp. Parasitol. 89, 1-8 (1998).</li><li>Gorrochotegui-Escalante, N., Munoz, M. L., Fernandez-Salas, I., Beaty, B. J., Black, W. C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+isolation+by+distance+among+Aedes+aegypti+populations+along+the+northeastern+coast+of+Mexico.">Genetic isolation by distance among Aedes aegypti populations along the northeastern coast of Mexico.</a> Am. J. Trop. Med. Hyg. 62, 200-209 (2000).</li><li>Kreader, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relief+of+amplification+inhibition+in+PCR+with+bovine+serum+albumin+or+T4+gene+32+protein.">Relief of amplification inhibition in PCR with bovine serum albumin or T4 gene 32 protein.</a> Appl. Environ. Microbiol. 62, 1102-1106 (1996).</li><li>Norris, D. E., Shurtleff, A. C., Toure, Y. T., Lanzaro, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microsatellite+DNA+polymorphism+and+heterozygosity+among+field+and+laboratory+populations+of+Anopheles+gambiae+ss+(Diptera+Culicidae).">Microsatellite DNA polymorphism and heterozygosity among field and laboratory populations of Anopheles gambiae ss (Diptera Culicidae).</a> J. Med. Entomol. 38, 336-340 (2001).</li><li>Schriefer, M. E., Sacci, J. B., Wirtz, R. A., Azad, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+polymerase+chain+reaction-amplified+malarial+DNA+in+infected+blood+and+individual+mosquitoes.">Detection of polymerase chain reaction-amplified malarial DNA in infected blood and individual mosquitoes.</a> Exp. Parasitol. 73 (91), 311-316 (1991).</li><li>Al-Soud, W. A., Radstrom, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+PCR-inhibitory+components+in+blood+cells.">Purification and characterization of PCR-inhibitory components in blood cells.</a> J. Clin. Microbiol. 39, 485-493 (2001).</li><li>Hyun, C., Filippich, L. J., Hughes, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inhibitory+effect+of+pentobarbitone+on+reverse+transcription-PCR.">The inhibitory effect of pentobarbitone on reverse transcription-PCR.</a> J. Biochem. Biophys. Methods. 62, 63-68 (2005).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

השיטה הפשוטה Chelex מוצגת כאן מאפשרת מיצוי של האיכות אנופלס spp ופ דנ&quot;א falciparum מדגימות המתאימים ליישומים מגוונים PCR יתושים. טכניקה זו יכולה להיות מועסקת לזיהוי מולקולרי של יתושי מלרית וקטור ומעקב של פ העמיד לתרופות אללים falciparum ביתושים לתוכניות בקרת מלריה לאומיות. יתרונותיה של הטכניקה הפשוטה Chelex כוללים פשטות, ריאגנטים פחות ולכן עלות, בטיחות וזמן עיבוד קצר יותר (37 דקות) מפרוטוקולים סטנדרטיים כגון (47 דקות 2 שעות וצעד לילה, טבלת 1) המלחה את השיטה 10. היתרונות הנ&quot;ל והדרישות מינימאליות מגיבות (3 ריאגנטים) בהשוואה לפרוטוקול הסטנדרטי הנוכחי (10 ריאגנטים, טבלת 1) 11,15, להפיק את פרוטוקול Chelex הפשוט ידידותי במיוחד למעבדות במדינה אנדמית בי מגיבה מתמדתשרשרת אספקה ​​היא לעתים קרובות קשה לתחזוקה. מגבלה של השיטה היא שכמו הפרוטוקול הסטנדרטי, זה היה גם נושא למעכבי PCR הידועים להתרחש בintegument יתושי 16. עם זאת, זו היא קלה בקלות על ידי הוספה של BSA במבחנים. BSA גם הועסק בהצלחה כהגברה משפרת נגד מעכבים ביישומי PCR אחרים 17,18.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם המגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות (אופציונלי) </td></tr><tr><td> Chelex-100, 50-100 רשת יבשה </td><td> BioRad </td><td> # 143-2832 </td><td></td></tr><tr><td> Saponin </td><td> SIGMA </td><td> 142-7425 </td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td> ניו אינגלנד Biolabs </td><td> B9001S </td><td></td></tr></tbody></table>

a simple chelex protocol for dna extraction from anopheles spp.

מדינות אנדמיות יותר ויותר לאמץ כלים מולקולריים להקלדה יעילה, זיהוי ומעקב נגד טפילי מלריה ויתושי וקטור, כחלק בלתי נפרד מתוכניות בקרת 1,2,3,4,5. להקמת בר קיימא של גישות המדויקות אלה בפעולות מחקר כדי לחזק את שליטת מלריה ומאמצי חיסול, שיטות פשוטות ובמחיר סבירים, עם ריאגנט החסכן ודרישות ציוד חיוני 6,7,8. כאן אנו מציגים טכניקה Chelex מבוססת פשוטה לחילוץ טפיל מלריה ודנ&quot;א מדגימות יתושי וקטור שדה שנאספו. אנו מורפולוגית זיהו 72 אנופלס gambiae sl. מ156 יתושים שנתפסו על ידי Pyrethrum התרסיס תופס בחדרי שינה נפרדת של משקי בית תוך 2 קרבה 2,000 ק&quot;מ של מכון המלריה בMacha. לאחר נתיחה כדי להפריד את הראש ובית החזה מהבטן לכל 72 אנופלס gambiae sl. יתושים, שני הסעיפים הונחו בנפרד ב1.5 צינורות microcentrifuge מ&quot;ל ושקוע ב20 μl מי deionized. באמצעות קצה פיפטה סטרילי, כל מקטע יתוש homogenized בנפרד להשעיה אחידה במי deionized. של homogenate שהתפתח מכל קטע יתוש, 10 μl נשמר תוך 10 μl האחר הועברה לצינור מ&quot;ל נפרד autoclaved 1.5. את aliquots הנפרד נחשפו למיצוי DNA או על ידי Chelex הפשוט או סטנדרטי המלחה החוצה חילוץ פרוטוקול 9,10. פרוטוקול ההמלחה החוצה הוא מה שנקרא ושימוש נרחב משום שהיא מעסיקה ריכוז מלח גבוה במקום בממסים אורגניים מסוכנים (כגון פנול וכלורופורם) לצעד משקעי החלבון במהלך חילוץ דנ&quot;א 9. תמציות שמשו כתבניות להגברת PCR באמצעות פריימרים מיקוד dehydroge פרוקי הרגליים המיטוכונדריה ניקוטינמיד אדנין dinucleotidenase (NADH) 4 גן המקטע (ND4) כדי לבדוק את איכות דנ&quot;א 11, PCR לזיהוי מיני אחי gambiae אנופלס 10 ו PCR מקונן להקלדה של זיהום Plasmodium falciparum 12. PCR השוואה באמצעות איכות ה-DNA (ND4) הראתה רגישות 93% וסגוליים 82% לגישה היחסית לפרוטוקול מבוסס המלחה החוצה Chelex. ערכים מקבילים של רגישות וסגולית היו 100% ו 78%, בהתאמה, באמצעות אח מיני זיהוי PCR ו92% ו 80%, בהתאמה, לפ falciparum האיתור PCR. לא היו הבדלים משמעותיים בשיעור של דגימות נותנות אות amplicon עם Chelex או המלחה מתוך פרוטוקול קבוע בכל השלושה יישומי PCR. גישת Chelex נדרשה שלושה ריאגנטים פשוטים ו37 דקות כדי להשלים, תוך המלחה מתוך הפרוטוקול הכרוך 10 ריאגנטים שונים ו2 זמן העיבוד &quot;47 דקות hr ו, כולל צעד בן לילה. התוצאות שלנו מראות הבשיטת Chelex דומה לחילוץ הקיים המלחה החוצה וניתן להחליף כגישה פשוטה וברת קיימא בהגדרות משאבים מוגבלים שבי שרשרת אספקת מגיב קבועה היא לעתים קרובות קשה לתחזוקה.

דוגמאות לתוצאות ממבחני PCR לאיכות תמצית ה-DNA יתוש (איור 1), זיהוי אנופלס arabiensis מולקולרי (איור 2) ופ falciparum זיהוי (איור 3) מראה ששיטת Chelex הפשוטה מניבה תוצאות דומות לרמת המלחה מתוך פרוטוקול 10, למרות צעדים הרבה פחות (טבלה 1). עם איכות DNA דומה בתמציות בהתאמה, אין זה מפתיע כי שיעורים חיוביים לדוגמה ביחס ל. מיני אחי gambiae כמו גם שיעורי זיהום טפיל לא היו סטטיסטי המבוסס על בדיקת צ&#39;י המרובעת של McNemar (איור 3) שונים. רגישות (%) חושבת כTP / (TP + FN) * 100, שם מציין TP החיוביים אמיתית וFN מציין שליליים כוזבת. סגולי (%) נקבע כTN / (TN + FP) * 100, שם מציין TN תשלילים אמיתיים וFP מציין תוצאות חיוביות שגויות. איכות ה-DNA (<html> ND4) PCR הראה רגישות 93% וסגוליים 82% לגישת Chelex השוואה להמלחה הוקם מתוך פרוטוקול כתקן זהב. ערכים מקבילים של רגישות וסגולית היו 100% ו 78%, בהתאמה, באמצעות אח מיני זיהוי PCR ו92% ו 80%, בהתאמה, לפ falciparum האיתור PCR. התוספת של BSA לתערובות תגובה הביאה לעלייה כללית של התוצאות חיוביות PCR (איור 3) בשל הקלה של ה-PCR מעכבי 14, לשניהם Chelex והסדיר פשט המלחה את הפרוטוקול. עם זאת, עלייה זו לא הייתה מובהקת סטטיסטי, פרט לאיכות ה-DNA (ND4 PCR) על תמציות Chelex (p = 0.039). עיכול אנזים הגבלת אלל ספציפי בפ falciparum DHFR (או גן היעד אחר) amplicon מאפשר genotyping של זיהומי מלרית בלוטת אמצע בטן ורוק לאללים סמי התנגדות (איור 4; נתוני בלוטת רוק אינו מוצגים). <table bo</html style=";text-align:right;direction:rtl">rder = &quot;1&quot;&gt; <tbody><tr><td colspan="2"> תהליך פשוט Chelex </td><td colspan="2"> תקן המלחה את הנוהל </td></tr><tr><td> צעדים </td><td> ריאגנטים </td><td> צעדים </td><td> ריאגנטים </td></tr><tr><td><ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף לצינור דגימה microfuge מ&quot;ל 1.5 והומוגני ב100 μl של פתרון Saponin% 1 (2 דקות) 1X PBS /. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאר בטמפרטורת חדר למשך 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין ב20000 XG עבור 2 דקות וזורקים supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 100 μl של 1X PBS ומערבב בעדינות על ידי vortexing רגע (3 שניות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין ב20000 XG עבור 2 דקות וזורקים supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 25 μl של 20% Chelex w / v במי deionized ומי deionized סטרילי μl 75. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חור פירס במכסה של צינור דגימה באמצעות מחט חמה, סטרילי 23 ז מזרק ותכולת שפופרת להרתיח למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין צינור microfuge בשעת 20000 XG לדקות 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת supernatant לפתרון ה-DNA חנות בקבוקון prelabeled סטרילית וב -20 ° C עד לשימוש (2.5 μl בתגובת PCR 25 μl). </li></ol></td><td> PBS Saponin Chelex-100 חרוזים </td><td><ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף לצינור דגימה microfuge מ&quot;ל 1.5 והומוגני ב* חיץ נדר μl 100 עם DEPC% 1 (2 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על 65 מעלות צלזיוס למשך השעות 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף תצטט 15 μl קר ז 8 אשלגן. מערבב בעדינות ולדגור על קרח למשך 45 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין מדגם בצינורות microfuge ב20000 XG למשך 10 דקות והעברה supernatant לצינור מ&quot;ל חדש 1.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 250 μl של אתנול 100% ומערבבים היטב על ידי היפוך הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת מדגם בRT למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין דגימות ב20000 XG במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב ולהשליך supernatant, והשאיר את הכדור לייבוש מלא בצינור (30 מ &#39;ב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלול ב 20 μl של 0.1x SSC + RNAse (10 מיקרוגרם / מ&quot;ל) הלילה ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיף מי 80 μl DEPC ולאחסן ב -20 ° C עד שימוש. </li></ol></td><td> Diethylpyrocarbonate (DEPC) * נדר מאגר: 0.1 מ &#39;NaCl 0.2 סוכרוז M 0.1 מ &#39;טריס-HCL 0.05 M EDTA, pH 9.1 0.5% SDS במי DEPC תצטט ז 8 אשלגן אתנול נתרן ציטראט חיץ מלוח 0.1x (SSC) RNAse (10 מיקרוגרם / מ&quot;ל) </td></tr><tr><td colspan="2"> זמן כולל: 37 דקות </td><td colspan="2"> זמן כולל: 2 47 דקות לשעה, בתוספת הלילה </td></tr></tbody></table> טבלת 1. הצעד אחר צעד השוואה של ריאגנטים ודרישות זמן לפרוטוקול Chelex פשוט ולעמודארד המלחה את השיטה להפקת דנ&quot;א מדגימות יתושים. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3281/3281fig1.jpg" /> איור 1. השוואת ND4 המיטוכונדריה PCR של DNA מאיכות הפשוטה Chelex &quot;C&quot; וסטנדרטי המלחה את התמציות &quot;M&quot; על דגימות שדה arabiensis אנופלס. NC שליטה, שלילית; M1 ו C1, C2 וM2, M3 ו-C3, ו M4 ו-C4 היא לזווג את ההמלחה ותמציות Chelex מאותה. דגימות יתושי arabiensis. L, סולם 100 נ&quot;ב ה-DNA. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3281/3281fig2.jpg" /> איור 2 המולקולרי זיהוי PCR לarabiensis אנופלס C1 ו M1, M2 וC2, C3 ו-M3, C4 ו M4 יסמנו amplicon המתאים מהמלחה החוצה &quot;ז&quot; ופשט תמציות Chelex &quot;C&quot; לאותן דגימות דנ&quot;א יתושים;.. AR, אנופלס arabiensisביקורת חיובית; הליטר, 100 נ&quot;ב סולם הדנ&quot;א. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/3281/3281fig3.jpg" /> איור 3. איתור של תוצאות חיוביות על Chelex והמלחה החוצה תמציות DNA לדגימות שדה יתושים, עם מבחני PCR לזיהוי מולקולרי של אנופלס arabiensis (ע&quot;ר) 10, גן פרוקי רגלי NADH דהידרוגנז 4 (ND4) בדיקת איכות ה-DNA 11, ו-P עמידות לתרופה antifolate . falciparum DHFR 12 genotyping (F-M4). תוצאות מוצגות עבור מבחנים לרוץ עם או בלי BSA בתמהיל התגובה. מבחן צ&#39;י המרובע של McNemar שמש כדי לקבוע אם ההבדלים בין אחוזי PCRs החיובי מהדנ&quot;א שחולצו מן Chelex הפשוט והסטנדרטיים המלחה מתוך פרוטוקולים היו מובהקים סטטיסטי. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/3281/3281fig4.jpg" /> <strong&gt; איור 4. יישום פשוט Chelex הפרוטוקול בgenotyping פ זיהומי falciparum ביתושים (נתוני אמצע הבטן מוצגים) עבור אללים עמידות לתרופה. אני עיכול BstN על amplicon איגוף קודון 108 לפ גן falciparum DHFR 12 תערוכות מוטנטים S108T cycloguanil עמידים בדגימות יתושים (M1-M5; נתוני אמצע הבטן מוצגים). U, לא מעוכל 522 נ&quot;ב amplicon; FCR3, המעבדה הסטנדרטית פ שיבוט falciparum חיובי שליטה נושא S108T; K1, פ falciparum מעבדה סטנדרטית שליטה שלילית שיבוט נושאה S108N cycloguanil רגיש; הליטר, 100 נ&quot;ב סולם הדנ&quot;א.

Watch this Scientific Journal Video about A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp. at JoVE.com

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

דרך מהירה ואפשרית כדי לחלץ טפיל מלריה ואיכות ה-DNA וקטור מדגימות יתושים מתוארת. ניצול תכונות chelating של שרף Chelex, השיטה הפשוטה מאפשרת genotyping של טפילי מלריה בשלבי יתושי בלוטת אמצע בטן ורוק, כמו גם זיהוי מולקולרי של<em&gt; אנופלס</em&gt; אח מינים באמצעות PCR.

פשוט פרוטוקול Chelex למיצוי DNA מ<em&gt; אנופלס</em&gt; Spp.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for  efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and  vector ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Immunology and Infection

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

Genetics

DNA Structure and Function

SCIENTISTS IN ACTION

A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

פרוטוקול איסוף מכתים Hemocytes מן יתוש הקדחת הצהובה Aedes aegypti</em

 Mosquitoes are vectors for a number  of disease-causing pathogens such as the yellow fever virus, malaria parasites  and filarial worms. Laboratories are ...

IgY Technology: Extraction of Chicken Antibodies from Egg Yolk by Polyethylene Glycol (PEG) Precipitation

IgY Technology: Extraction of Chicken Antibodies from Egg Yolk by Polyethylene Glycol PEG Precipitation

טכנולוגיה IgY: הפקת נוגדנים מן עוף חלמון ביצה על ידי פוליאתילן גליקול (PEG) רטיבות

Hens can be immunized by means of  i.m. vaccination (Musculus pectoralis, left and right, injection volume  0.5-1.0 ml) or by means of Gene-Gun ...

High and Low Throughput Screens with Root-knot Nematodes Meloidogyne spp.

High and Low Throughput Screens with Root-knot Nematodes Meloidogyne spp.

קצב העברה גבוה ונמוך מסכים עם השורש קושר את נמטודות Meloidogyne spp.</em

Root-knot nematodes (genus Meloidogyne) are obligate plant parasites. They are extremely polyphagous and considered one of the most economically important ...

A Simple Protocol for Platelet-mediated Clumping of Plasmodium falciparum-infected Erythrocytes in a Resource Poor Setting

A Simple Protocol for Platelet-mediated Clumping of Plasmodium falciparum-infected Erythrocytes in a Resource Poor Setting

פרוטוקול פשוט לclumping טסיות דם בתיווך של<em&gt; Plasmodium falciparum</emאריתרוציטים&gt; נגועים בסביבה מסכנה משאבים

P. falciparum causes the majority of severe malarial infections. The pathophysiological mechanisms underlying cerebral malaria (CM) are not fully ...

A Simple and Rapid Protocol to Non-enzymatically Dissociate Fresh Human Tissues for the Analysis of Infiltrating Lymphocytes

פרוטוקול פשוט ומהיר לללא אנזימי רקמות אנושיות טריות לנתק לניתוח להחדרה לימפוציטים

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted ...

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

גישה פשוטה ויעילה לבנות וקטורי וירוס Vaccinia Mutant

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been ...

Extraction of Hemocytes from Drosophila melanogaster Larvae for Microbial Infection and Analysis

Extraction of Hemocytes from Drosophila melanogaster Larvae for Microbial Infection and Analysis

החילוץ של Hemocytes של הזחלים דרוזופילה melanogaster זיהום מיקרוביאלי וניתוח

During the pathogenic infection of Drosophila melanogaster, hemocytes play an important role in the immune response throughout the infection. Thus, the ...

Combining Analysis of DNA in a Crude Virion Extraction with the Analysis of RNA from Infected Leaves to Discover New Virus Genomes

שילוב ניתוח של דנ א ב מיצוי Virion גולמי עם הניתוח של RNA של עלים נגועים לגלות הגנום וירוס חדש

This metagenome approach is used to identify plant viruses with circular DNA genomes and their transcripts. Often plant DNA viruses that occur in low ...

Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

חילוץ מהיר, בטוח, ופשוט ידנית המיטה חומצת גרעין איתור וירוס בדגימות דם מלא

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

פלטפורמה תפוקה גבוהה להקרנה של סלמונלה spp /שיגלה spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...