Name: spheroid assay to measure tgf-&#946;-induced invasion
Uploaded: 2011-11-16T13:00:00
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Nous sommes reconnaissants à Ken Iwata (OSI Pharmaceuticals, New York, Etats-Unis) pour les réactifs et Fred Miller (Barbara Ann Intitute cancer Karmanos, Detroit, Etats-Unis) pour les lignées cellulaires.

1. Préparation de la solution méthocel (500 ml) <ol><li> Autoclave 6 g de méthylcellulose dans une bouteille de 500 ml contenant un agitateur magnétique. </li><li> Dissoudre la méthylcellulose dans 250 ml de DMEM/F12 sans sérum préchauffé (60 ° C) pendant 20 min. </li><li> Ajouter 250 ml de DMEM/F12 (RT) contenant du sérum de cheval à 10%. Mélanger la nuit (4 ° C). </li><li> Effacer la solution par centrifugation (5000g, 2h, 4 ° C). </li><li> Prenez la solution claire très visqueux dans un nouveau tube ...

<ol>
	<li>Akhurst, R. J., Derynck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-&#946;+signaling+in+cancer--a+double-edged+sword.">TGF-&#946; signaling in cancer--a double-edged sword.</a> Trends. Cell. Biol. 11, S44-S51 (2001).</li><li>Massagu&#233;, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-&#946;+in+Cancer.">TGF-&#946; in Cancer.</a> Cell. 134, 215-215 (2008).</li><li>Ghellal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+significance+of+TGF-&#946;1+and+TGF-&#946;+in+human+breast+carcinoma.">Prognostic significance of TGF-&#946;1 and TGF-&#946; in human breast carcinoma.</a> Anticancer. Res. 20, 4413-4413 (2000).</li><li>Sheen-Chen, S. 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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+overlay+culture+models+of+human+breast+cancer+reveal+a+critical+sensitivity+to+mitogen-activated+protein+kinase+kinase+inhibitors.">Three-dimensional overlay culture models of human breast cancer reveal a critical sensitivity to mitogen-activated protein kinase kinase inhibitors.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 332, 821-821 (2010).</li></ol>

Nous avons établi un modèle dans lequel sphéroïde MCF10A1 cellules malignes et de ses dérivés envahissent dans une matrice de collagène de manière TGF-β-dépendante. Tout d&#39;abord, sphéroïdes sont formés dans les plaques rondes de 96 puits de suspension en bas, en présence de méthylcellulose. Bien sûr, aussi en forme de U en poly-HEMA plaques revêtues peuvent être utilisés à cette fin. La méthylcellulose est absolument nécessaire dans cette étape, puisque les cellules vont mourir en l&#39;absenc...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Société </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires (optionnel) </td></tr><tr><td> Méthyl-cellulose </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M0512 </td><td></td></tr><tr><td> PureCol </td><td> Avancé Biomatrix </td><td> 5005-B </td><td></td></tr><tr><td> bandes indicatrices de pH </td><td> Merck </td><td> 9533 </td><td></td></tr><tr><td> 96 puits de suspension plaques </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 650 185 </td><td></td></tr><tr><td> 96 puits d&#39;adhésion TC plaques </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 655 180 </td><td></td></tr></tbody></table>

spheroid assay to measure tgf-&#946;-induced invasion

Le TGF-β a opposés rôles dans la progression du cancer du sein en agissant comme un suppresseur de tumeur dans la phase initiale, mais stimulant l&#39;invasion et les métastases à 1,2 ultérieurement. Par ailleurs, le TGF-β est fréquemment surexprimé dans le cancer du sein et son expression est corrélée à un mauvais pronostic et les métastases 3,4. Les mécanismes par lesquels le TGF-β induit l&#39;invasion ne sont pas bien comprises. Le TGF-β provoque ses réponses cellulaires via le TGF-β de type II (TβRII) et de type I (TβRI) récepteurs. Sur le TGF-β induit la formation de complexes hétéromériques, TβRII phosphoryle la TβRI. Le TβRI activé initie sa voie de signalisation intracellulaire canonique par Smad récepteurs phosphorylant (R-Smad), c&#39;est à dire Smad2 et Smad3. Ces activé R-Smad former des complexes avec les hétéromériques Smad4, qui s&#39;accumulent dans le noyau et régulent la transcription des 5 gènes cibles. En plus des déjà described voie Smad, les résultats activation du récepteur dans l&#39;activation de plusieurs autres non-Smad voies de signalisation, par exemple Mitogen protéine kinase activée (MAPK) voies 6. Pour étudier le rôle du TGF-β dans les différents stades du cancer du sein, nous avons fait usage du système de pile à MCF10A. Ce système est constitué de cellules MCF10A1 spontanément immortalisé sein (M1) épithéliales 7, le H-Ras transformée M1 dérivés MCF10AneoT (M2), qui produit des lésions précancéreuses chez les souris 8, et le M2 MCF10CA1a dérivés (M4), qui a été établi à partir xénogreffes M2 et les formes de haute qualité avec des carcinomes de la capacité à métastaser au poumon 9. Cette série offre MCF10A la possibilité d&#39;étudier les réponses des cellules avec différents grades de malignité qui ne sont pas biaisées par un fond génétique différent. Pour l&#39;analyse du TGF-β induite par l&#39;invasion, nous avons généré homotypique MCF10A cellules sphéroïdes embe culturesdded dans une matrice de collagène 3D in vitro (figure 1). Ces modèles ressemblent tumeurs humaines in vivo par l&#39;établissement d&#39;un gradient d&#39;oxygène et de nutriments, résultant en cellules actives et invasives sur les cellules à l&#39;extérieur et de repos ou même nécrotiques dans l&#39;intérieur du 10 sphéroïde. Sphéroïde tests basés ont également été montré pour une meilleure résistance aux médicaments que récapituler cultures en monocouche 11. Ce système MCF10 modèle 3D nous a permis d&#39;étudier l&#39;impact du TGF-β de signalisation sur les propriétés invasives des cellules mammaires à différents stades de malignité.

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Spheroid Assay to Measure TGF-ÃƒÅ½Ã‚Â²-induced Invasion

Un test pour mesurer quantitativement Transforming Growth Factor (TGF)-β-induite invasion dans des gels de collagène en 3 dimensions est décrite. Ce test prend avantage de la série MCF10A de lignées cellulaires, qui représentent les différentes étapes du développement du cancer du sein. Cette méthode peut être adoptée pour être utilisé avec d&#39;autres lignées cellulaires et pourraient être utilisées pour étudier d&#39;autres activateurs ou des inhibiteurs potentiels de l&#39;invasion.

Assay Sphéroïde pour mesurer le TGF-β induit Invasion

TGF-&beta; has opposing roles in breast cancer progression by acting as a tumor suppressor in the initial phase, but stimulating invasion and metastasis ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Spheroid Assay to Measure TGF-&#946;-induced Invasion

A Real-time Electrical Impedance Based Technique to Measure Invasion of Endothelial Cell Monolayer by Cancer Cells

Une technique basée Impédance électrique en temps réel pour mesurer Invasion de monocouche de cellules endothéliales par les cellules cancéreuses

Metastatic dissemination of malignant cells requires degradation of basement membrane, attachment of tumor cells to vascular endothelium, retraction of ...

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