Name: spheroid assay to measure tgf-&#946;-induced invasion
Uploaded: 2011-11-16T13:00:00
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Damos las gracias a Ken Iwata (OSI Pharmaceuticals, Nueva York, EE.UU.) para los reactivos y Fred Miller (Barbara Ann Intitute Cáncer Karmanos, en Detroit, EE.UU.) para las líneas celulares.

1. Preparación de la solución Methocel (500 ml) <ol><li> Autoclave de 6 g de metilcelulosa en una botella de 500 ml con agitador magnético. </li><li> Disolver la metilcelulosa en 250 ml de DMEM/F12 sin suero precalentado (60 ° C) durante 20 min. </li><li> Añadir 250 ml de DMEM/F12 (RT), que contiene 10% de suero de caballo. Mezcla durante la noche (4 ° C). </li><li> Clara la solución mediante centrifugación (5000 g, 2 h, 4 ° C). </li><li> Tome la solución clara de alta viscosidad a un nuevo tubo (aproximadam...

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Hemos establecido un modelo esferoide en el que MCF10A1 células y sus derivados malignos invaden en una matriz de colágeno de manera TGF-β-dependiente. En primer lugar, esferoides se forman en 96 pozos de placas de suspensión de fondo redondo, con la presencia de metilcelulosa. Por supuesto, también en forma de U poli-HEMA placas recubiertas se pueden utilizar para este propósito. La metilcelulosa es absolutamente necesario en este paso, ya que las células se mueren en la ausencia de metilcelulosa. TGF-β se aña...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios (opcional) </td></tr><tr><td> Metil celulosa </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M0512 </td><td></td></tr><tr><td> PureCol </td><td> Avanzada Biomatrix </td><td> 5005-B </td><td></td></tr><tr><td> tiras indicadoras del pH </td><td> Merck </td><td> 9533 </td><td></td></tr><tr><td> 96 y la suspensión placas </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 650 185 </td><td></td></tr><tr><td> 96-TC y la adhesión placas </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 655 180 </td><td></td></tr></tbody></table>

spheroid assay to measure tgf-&#946;-induced invasion

TGF-β ha opuesto papel en la progresión del cáncer de mama al actuar como un supresor tumoral en la fase inicial, pero estimulando la invasión y metástasis en 1,2 más adelante. Por otra parte, el TGF-β es frecuentemente sobreexpresado en el cáncer de mama y su expresión se correlaciona con mal pronóstico y la metástasis 3,4. Los mecanismos por los que el TGF-β induce la invasión no se comprenden bien. TGF-β induce la respuesta celular a través del tipo II de TGF-β (TβRII) y el tipo I (TβRI) receptores. TGF-β sobre la inducida por la formación de complejos heteroméricos, TβRII fosforila la TβRI. El TβRI activado inicia su vía de señalización intracelular canónico por la fosforilación de Smads receptor (R-Smads), es decir, Smad2 y Smad3. Estas activa R-Smads formar complejos con heteroméricos Smad4, que se acumulan en el núcleo y regulan la transcripción de genes diana 5. Además de los anteriores described vía Smad, los resultados de la activación del receptor en la activación de varias otras organizaciones no Smad vías de señalización, por ejemplo la proteína quinasa activadas por mitógeno (MAPK) vías 6. Para estudiar el papel del TGF-β en las diferentes etapas del cáncer de mama, hemos hecho uso del sistema de células MCF10A. Este sistema se compone de manera espontánea inmortalizado células de la mama MCF10A1 (M1) del epitelio 7, el H-RAS transformó M1 derivados MCF10AneoT (M2), que produce lesiones premalignas en ratones 8, y el MCF10CA1a M2 derivados (M4), que se estableció a partir xenoinjertos M2 y formas de alta carcinomas de grado con la posibilidad de metástasis en el pulmón 9. Esta serie MCF10A ofrece la posibilidad de estudiar las respuestas de las células con diferentes grados de malignidad que no están sesgados por una base genética diferente. Para el análisis de TGF-β inducida por la invasión, se generó homotípicos MCF10A células esferoide embe culturasñadido en una matriz de colágeno 3D in vitro (Fig. 1). Estos modelos se parecen mucho a los tumores humanos in vivo mediante el establecimiento de un gradiente de oxígeno y nutrientes, lo que resulta en células activas y las operaciones en el exterior y las células en reposo o incluso necrosis en el interior del esferoide 10. Esferoide ensayos basados ​​también han demostrado una mejor resistencia a los medicamentos que recapitular monocapas 11. Este sistema MCF10 modelo 3D nos permitió investigar el impacto de TGF-β señalización en las propiedades de las células de mama invasivo en las diferentes etapas de malignidad.

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Spheroid Assay to Measure TGF-ÃƒÅ½Ã‚Â²-induced Invasion

Un ensayo para medir cuantitativamente el factor transformador del crecimiento (TGF)-β-inducida por invasión en geles de colágeno en 3 dimensiones se describe. Este ensayo se aprovecha de la serie MCF10A de líneas celulares, que representan diferentes etapas de desarrollo de cáncer de mama. Este método puede ser aprobada para su uso con otras líneas celulares y podrían ser utilizados para investigar otras posibles activadores o inhibidores de la invasión.

Ensayo esferoide para medir TGF-β inducida por invasión

TGF-&beta; has opposing roles in breast cancer progression by acting as a tumor suppressor in the initial phase, but stimulating invasion and metastasis ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Spheroid Assay to Measure TGF-&#946;-induced Invasion

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