Name: identifying targets of human micrornas with the lightswitch luciferase assay system using 3'utr-reporter constructs and a microrna mimic in adherent cells
Uploaded: 2011-09-28T13:00:00
Duration: 7 min 19 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identifying Targets of Human microRNAs with the LightSwitch Luciferase Assay System using 3'UTR-reporter Constructs and a microRNA Mimic in Adherent Cells at

<ol>
	<li>Griffiths-Jones, S., Grocock, R. J., van Dongen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRBase:+microRNA+sequences,+targets+and+gene+nomenclature.">miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature.</a> Nucleic Acids Res. 34, D140-D144 (2006).</li><li>Calin, G. A., Croce, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+cancer+connection:+the+beginning+of+a+new+tale.">MicroRNA cancer connection: the beginning of a new tale.</a> Cancer Res. 66, 7390-7394 (2006).</li><li>Chen, J. F., Murchison, E. P., Tang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+deletion+of+Dicer+in+the+heart+leads+to+dilated+cardiomyopathy+and+heart+failure.">Targeted deletion of Dicer in the heart leads to dilated cardiomyopathy and heart failure.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 6-6 (2008).</li><li>Baek, D., Villen, J., Shin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+microRNAs+on+protein+output.">The impact of microRNAs on protein output.</a> Nature. 455, 64-71 (2008).</li><li>Hendrickson, D. G., Hogan, D. J., Herschlag, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+identification+of+mRNAs+recruited+to+argonaute+2+by+specific+microRNAs+and+corresponding+changes+in+transcript+abundance.">Systematic identification of mRNAs recruited to argonaute 2 by specific microRNAs and corresponding changes in transcript abundance.</a> PLoS One. 3, e2126-e2126 (2008).</li><li>Friedman, R. C., Farh, K. K., Burge, C. B., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Most+mammalian+mRNAs+are+conserved+targets+of+microRNAs.">Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs.</a> Genome Res. 19, 92-105 (2009).</li><li>Lall, S., Krek, A., Chen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+map+of+conserved+microRNA+targets+in.">A genome-wide map of conserved microRNA targets in.</a> 16, 460-471 (2006).</li><li>Boutz, D. R., Collins, P. J., Suresh, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-tiered+approach+identifies+a+network+of+cancer+and+liver+disease-related+genes+regulated+by+miR-122.">Two-tiered approach identifies a network of cancer and liver disease-related genes regulated by miR-122.</a> J. Biol. Chem. 286, 18066-18078 (2011).</li><li>Lim, L. P., Lau, N. C., Garrett-Engele, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarray+analysis+shows+that+some+microRNAs+downregulate+large+numbers+of+target+mRNAs.">Microarray analysis shows that some microRNAs downregulate large numbers of target mRNAs.</a> Nature. 433, 769-773 (2005).</li><li>Selbach, M., Schwanhausser, B., Thierfeldner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+changes+in+protein+synthesis+induced+by+microRNAs.">Widespread changes in protein synthesis induced by microRNAs.</a> Nature. 455, 58-63 (2008).</li><li>Hutvagner, G., Simard, M. J., Mello, C. C., Zamore, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence-specific+inhibition+of+small+RNA+function.">Sequence-specific inhibition of small RNA function.</a> PLoS Biol. 2, e98-e98 (2004).</li><li>Meister, G., Landthaler, M., Dorsett, Y., Tuschl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence-specific+inhibition+of+microRNA-+and+siRNA-induced+RNA+silencing.">Sequence-specific inhibition of microRNA- and siRNA-induced RNA silencing.</a> RNA. 10, 544-5450 (2004).</li><li>Liao, J. M., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auto-regulatory+suppression+of+c-Myc+by+miR-185-3p.">Auto-regulatory suppression of c-Myc by miR-185-3p.</a> J. Biol. Chem. Epub. , (2011).</li></ol>

הכותבים הם עובדי Genomics switchgear שעושים כלים ריאגנטים המופיעים במאמר זה. הפקה של מאמר זה מומן על ידי Genomics switchgear.

יצרנו אוסף גנום רחב של טרום משובטים 3&#39;UTR-הכתב בונה האדם כדי לאפשר מחקרים של מירנה-3&#39;UTR אינטראקציות בתאים חיים. הנה הראינו שיטה לשעתקו תפוקה גבוהה עבור שיתוף transfecting מחקה מירנה עם 3&#39;UTR-לכתבים באמצעות מערכת הכתב בלוציפראז. שיטה זו מסתמכת על החוקרים באמצעות קו הפערים transfectable התא מביך פעילות מירנה עם טכניקה overexpression. חוקרים באמצעות שורות תאים גרוע-transfectable לשקול שימוש lentiviral לוויה שלנו 3&#39;UTR-הכתב אוסף שנוצר בשיתוף עם סיגמא (Mission 3&#39;UTR Lenti GoClones). טיפול בתאי עם מירנה מחקה תוצאות הניסוי overexpression סוג, ועם כל מחקר כזה, החוקרים חייבים לקחת בחשבון כי זה יכול או לא יכול לייצג מצבים פיזיולוגיים בפועל. כדי לענות על חששות overexpression, חוקרים יכולים להשתמש מעכבי מירנה בנוסף מחקה ללמוד את האינטראקציה עם שני סוגים שונים של ההפרעות 12-14. לאחר מטרות מירנה סביר מזוהים, החוקרים עשויים לרצות mutagenize האתרים מירנה המשוערת מחייב לקבוע אם האתרים נחוצים האינטראקציה תפקודית. הם יכולים גם רוצה בהיקף של עד מאות בדיקות שונות UTRs היעד הפוטנציאלי (Boutz). בנוסף, אם החוקרים מעוניינים בשאלה האם מירנה משפיע יציבות תמליל או יעילות התרגום, נתונים הכתב בלוציפראז ניתן להשוות מדדים של מצב יציב ברמות התמליל. כל שינוי אות בלוציפראז שלא קשורה לשינוי יחסי ברמות תמליל יצביע על השפעה על יעילות התרגום. לבסוף, החוקרים עשויים להשתמש וקטורים כתב ליצור עקומת התגובה מנה להשוות את הרגישות היחסית של UTRs שונות שינויים בריכוז מירנה 14.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> מוכר </td><td> מספר קטלוגי </td></tr><tr><td> לבן תרבות רקמות פלטות (96-היטב לתחתית מוצק) </td><td> VWR </td><td> 82050-736 </td></tr><tr><td> נקה בתרבית רקמה פלטות (96-היטב) עם מכסה </td><td> VWR </td><td> 353072 </td></tr><tr><td> LightSwitch מגיב Assay בלוציפראז </td><td> Switchgear </td><td> LS010 </td></tr><tr><td> DharmaFECT Duo מגיב transfection (0.75mL) </td><td> Dharmacon </td><td> T-2010-02 </td></tr><tr><td> פלייט לסכל איטום Tape </td><td> E &amp; K מדעי </td><td> T592100 </td></tr><tr><td> פלייט לנשימה איטום Tape </td><td> E &amp; K מדעי </td><td> T896100-S </td></tr><tr><td> פלייט Luminometer </td><td> מולקולרית התקנים </td><td> SpectraMax L </td></tr></tbody></table>

identifying targets of human micrornas with the lightswitch luciferase assay system using 3'utr-reporter constructs and a microrna mimic in adherent cells

מיקרו RNA (miRNAs) הם הרגולטורים החשובים של ביטוי גנים ממלאים תפקיד בתהליכים ביולוגיים רבים. יותר מ 700 miRNAs אדם זוהו עד כה עם כל כך עד מאות mRNAs יעד ייחודי. כלים חישוביים, מבחני הביטוי proteomics, וכרומטין-immunoprecipitation טכניקות מבוססות לספק רמזים חשובים לזיהוי mRNAs כי הם מטרות ישירה של מירנה מסוים. בנוסף, 3&#39;UTR-כתב מבחני הפכו מרכיב חשוב של מחקרים מטרה יסודית מירנה משום שהם מספקים ראיות פונקציונלי ו לכמת את ההשפעות של מירנה-3&#39;UTR אינטראקציות ספציפיות במערכת מבוססי תאים. כדי לאפשר לחוקרים יותר 3&#39;UTR-כתב מבחני למנף ולתמוך מדרוג כלפי מעלה של מבחני כזו תפוקה גבוהה רמות, יצרנו אוסף גנום רחב של כתבים 3&#39;UTR האדם בלוציפראז ב בלוציפראז LightSwitch הפערים אופטימיזציה Assay מערכת. המערכת כוללת גם סינתטי היעד מירנה כתב בונה לשימוש שולטת חיובית, שונים אנדוגני כתב בונה 3&#39;UTR, וכן סדרה של פרוטוקולי הניסוי סטנדרטית. כאן אנו מתארים שיטה transfection משותפת של 3&#39;UTR-כתב מבנים בודדים, יחד עם מירנה לחקות כי הוא יעיל, לשחזור, והוא מקובל ניתוח תפוקה גבוהה.

Watch this Scientific Journal Video about Identifying Targets of Human microRNAs with the LightSwitch Luciferase Assay System using 3'UTR-reporter Constructs and a microRNA Mimic in Adherent Cells at 

Identifying Targets of Human microRNAs with the LightSwitch Luciferase Assay System using 3'UTR-reporter Constructs and a microRNA Mimic in Adherent Cells

מיקרו RNA (miRNAs) הם הרגולטורים החשובים של ביטוי גנים הוכחו לשחק תפקיד תהליכים ביולוגיים רבים. כדי להבין טוב יותר מירנה-UTR אינטראקציות, יצרנו אוסף גנום רחב של 3 כתבים UTR בלוציפראז יחד עם הגן בלוציפראז הרומן מגיב assay, מערכת LightSwitch.

זיהוי מטרות של רנ&quot;א האדם עם מערכת Assay בלוציפראז LightSwitch באמצעות 3&#39;UTR-הכתב בונה microRNA מחקים בתאים חסיד

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression and play a role in many biological processes.  More than 700 human miRNAs have been ...

Research

JoVE Journal

Biology

Studying Membrane Biogenesis with a Luciferase-Based Reporter Gene Assay

לימוד biogenesis ממברנה עם Assay בלוציפראז מבוסס Gene כתב

To study the coordination of different lipid synthesis pathways during membrane biogenesis it is useful to work with an experimental system where membrane ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

שימוש ג&#39;ין Pulser מערכת MXcell electroporation כדי Transfect תאים ראשוניים עם יעילות גבוהה

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

ב ההיפוך חלוקה subcellular באתרו של בתאי יונקים חסיד שאינן חסיד

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, ...

Clonogenic Assay: Adherent Cells

Assay Clonogenic: תאים חסיד

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. ...

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

גזירת יעיל של מבשרי לב cardiomyocytes האדם מן האדם תאים pluripotent גזע עובריים עם אינדוקציה מולקולה קטנה

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

תכנות מחדש האדם תאים סומטיים תוך המושרה בתאי גזע pluripotent (iPSCs) באמצעות וקטור retroviral עם GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

A Chemical Screening Procedure for Glucocorticoid Signaling with a Zebrafish Larva Luciferase Reporter System

הליך מיון כימי לGlucocorticoid איתות עם מערכת כתב דג הזברה הזחל בלוציפראז

Glucocorticoid stress hormones and their artificial derivatives are widely used drugs to treat inflammation, but long-term treatment with glucocorticoids ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

תאי גזע יעיל דור מושרה אדם פלוריפוטנטיים מתאים הסומטיים של אדם עם סנדאי וירוס

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

Detection of miRNA Targets in High-throughput Using the 3'LIFE Assay

זיהוי של מטרות מירנה בתפוקה גבוהה באמצעות assay 3&#39;LIFE

Luminescent Identification of Functional Elements in 3&#8217;UTRs (3&#8217;LIFE) allows the rapid identification of targets of specific miRNAs within an ...

Transfecting RAW264.7 Cells with a Luciferase Reporter Gene

Transfecting תאי RAW264.7 עם לוציפראז כתב ג&#39;ין

Transfection of desired genetic materials into cells is an inevitable procedure in biomedical research studies. While numerous methods have been ...