Name: identifying targets of human micrornas with the lightswitch luciferase assay system using 3'utr-reporter constructs and a microrna mimic in adherent cells
Uploaded: 2011-09-28T13:00:00
Duration: 7 min 19 s
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	<li>Griffiths-Jones, S., Grocock, R. J., van Dongen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRBase:+microRNA+sequences,+targets+and+gene+nomenclature.">miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature.</a> Nucleic Acids Res. 34, D140-D144 (2006).</li><li>Calin, G. A., Croce, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+cancer+connection:+the+beginning+of+a+new+tale.">MicroRNA cancer connection: the beginning of a new tale.</a> Cancer Res. 66, 7390-7394 (2006).</li><li>Chen, J. F., Murchison, E. P., Tang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+deletion+of+Dicer+in+the+heart+leads+to+dilated+cardiomyopathy+and+heart+failure.">Targeted deletion of Dicer in the heart leads to dilated cardiomyopathy and heart failure.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 6-6 (2008).</li><li>Baek, D., Villen, J., Shin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+microRNAs+on+protein+output.">The impact of microRNAs on protein output.</a> Nature. 455, 64-71 (2008).</li><li>Hendrickson, D. G., Hogan, D. J., Herschlag, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+identification+of+mRNAs+recruited+to+argonaute+2+by+specific+microRNAs+and+corresponding+changes+in+transcript+abundance.">Systematic identification of mRNAs recruited to argonaute 2 by specific microRNAs and corresponding changes in transcript abundance.</a> PLoS One. 3, e2126-e2126 (2008).</li><li>Friedman, R. C., Farh, K. K., Burge, C. B., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Most+mammalian+mRNAs+are+conserved+targets+of+microRNAs.">Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs.</a> Genome Res. 19, 92-105 (2009).</li><li>Lall, S., Krek, A., Chen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+map+of+conserved+microRNA+targets+in.">A genome-wide map of conserved microRNA targets in.</a> 16, 460-471 (2006).</li><li>Boutz, D. R., Collins, P. J., Suresh, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-tiered+approach+identifies+a+network+of+cancer+and+liver+disease-related+genes+regulated+by+miR-122.">Two-tiered approach identifies a network of cancer and liver disease-related genes regulated by miR-122.</a> J. Biol. Chem. 286, 18066-18078 (2011).</li><li>Lim, L. P., Lau, N. C., Garrett-Engele, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarray+analysis+shows+that+some+microRNAs+downregulate+large+numbers+of+target+mRNAs.">Microarray analysis shows that some microRNAs downregulate large numbers of target mRNAs.</a> Nature. 433, 769-773 (2005).</li><li>Selbach, M., Schwanhausser, B., Thierfeldner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+changes+in+protein+synthesis+induced+by+microRNAs.">Widespread changes in protein synthesis induced by microRNAs.</a> Nature. 455, 58-63 (2008).</li><li>Hutvagner, G., Simard, M. J., Mello, C. C., Zamore, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence-specific+inhibition+of+small+RNA+function.">Sequence-specific inhibition of small RNA function.</a> PLoS Biol. 2, e98-e98 (2004).</li><li>Meister, G., Landthaler, M., Dorsett, Y., Tuschl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence-specific+inhibition+of+microRNA-+and+siRNA-induced+RNA+silencing.">Sequence-specific inhibition of microRNA- and siRNA-induced RNA silencing.</a> RNA. 10, 544-5450 (2004).</li><li>Liao, J. M., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auto-regulatory+suppression+of+c-Myc+by+miR-185-3p.">Auto-regulatory suppression of c-Myc by miR-185-3p.</a> J. Biol. Chem. Epub. , (2011).</li></ol>

著者はこの記事に登場するツールと試薬を作る開閉ゲノムの従業員です。この記事の生産は、開閉装置のゲノミクスによって後援されています。

私たちは、生きた細胞でのmiRNA - 3&#39;UTRの相互作用の研究を可能にするプリクローニングされたヒト3&#39;UTR -レポーターコンストラクトのゲノムワイドなコレクションを作成している。ここでは、ルシフェラーゼレポーターシステムを用いて3&#39;UTR -記者との共同トランスフェクトするmiRNAを模倣するための再現性とハイスループット法を示している。 このメソッドは、高transfectable細胞株を使用し、過剰発現技術でmiRNA活性を乱す研究者に依存しています。悪いtransfectable細胞株を用いて研究者は、シグマ（ミッション3&#39;UTRレンティGoClones）と連携して作成された私たちのコンパニオンレンチウイルス3&#39;UTR -レポーターのコレクションの使用を検討することができます。 miRNAの細胞を扱うことは過剰発現型の実験で結果を模倣し、そしてそのような研究で、研究者は、これがまたは実際の生理的条件を表していない場合がありますことを考慮する必要があります。過剰発現の懸念に対処するために、研究者は、摂動12-14つの異なるタイプの相互作用を研究するために、模倣に加えて、miRNAの阻害剤を使用することができます。 一回性のmiRNA標的が同定され、研究者は、サイトが機能的な相互作用のために必要であるかどうかを判断するために推定されるmiRNAの結合部位を突然変異を起こさせるためかもしれません。また、さまざまな潜在的なターゲットUTRs（Boutz）数百のテストにスケールアップすることもできます。研究者はmiRNAが転写の安定性や翻訳効率に影響を与えているかどうかは興味があればさらに、、ルシフェラーゼレポーターのデータは、定常状態の転写レベルの対策と比較することができる。転写レベルでの比例変化に関連付けられていないルシフェラーゼシグナルの変化は、翻訳効率に影響をポイントします。最後に、研究者は、レポーターベクターはmiRNAの濃度14の変化に異なるUTRsの相対感度を比較するために用量応答曲線を作成し使用することができます。

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td> ベンダ </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td>白色組織培養プレート（96ウェル固体底） </td><td> VWR </td><td> 82050-736 </td></tr><tr><td>ふたが付いている透明な組織培養プレート（96ウェル） </td><td> VWR </td><td> 353072 </td></tr><tr><td> LightSwitchルシフェラーゼアッセイ試薬</td><td>開閉装置</td><td> LS010 </td></tr><tr><td> DharmaFECTデュオトランスフェクション試薬（0.75mL） </td><td> Dharmacon </td><td> T - 2010から02 </td></tr><tr><td>箔のプレートシーリングテープ</td><td> E＆Kサイエンティフィック</td><td> T592100 </td></tr><tr><td>通気性のプレートシーリングテープ</td><td> E＆Kサイエンティフィック</td><td> T896100 - S </td></tr><tr><td>プレートルミノメーター</td><td>分子デバイス</td><td> SpectraMax L </td></tr></tbody></table>

identifying targets of human micrornas with the lightswitch luciferase assay system using 3'utr-reporter constructs and a microrna mimic in adherent cells

マイクロRNA（miRNA）は遺伝子発現の重要な調節因子であり、多くの生物学的プロセスにおいて役割を果たす。 700以上のヒトmiRNAは、それぞれがユニークな標的mRNAの数百にまでなると、これまでに同定されている。計算ツール、表現およびプロテオミクスアッセイ、およびクロマチン免疫沈降法に基づく技術は、特定のmiRNAの直接の標的であるmRNAを同定するための重要な手がかりを提供しています。彼らはのための機能的な証拠を提供し、セルベースの​​システム内の特定のmiRNA - 3&#39;UTRの相互作用の効果を定量化するために加えて、3&#39;UTR -レポーターアッセイでは、徹底したmiRNAのターゲットの研究の重要な要素となっている。活用3&#39;UTR -レポーターアッセイにより多くの研究者を有効にして、スケールアップ高スループットのレベルにこのようなアッセイのをサポートするために、我々は高度に最適化されたLightSwitchのルシフェラーゼでは人間の3&#39;UTRルシフェラーゼレポーターのゲノムワイドなコレクションを作成しているアッセイシステム。システムはまた、ポジティブコントロール、様々な内因性の3&#39;UTRのレポーターコンストラクト、および標準化された実験的な一連のプロトコルとして使用するための合成miRNAのターゲットのレポーターコンストラクトを含みます。 ここでは、miRNA、効率的で再現性、およびハイスループット解析に従順であることを模倣するとともに、個々の3&#39;UTR -レポーターコンストラクトのコトランスフェクションのための方法を説明します。

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Identifying Targets of Human microRNAs with the LightSwitch Luciferase Assay System using 3'UTR-reporter Constructs and a microRNA Mimic in Adherent Cells

マイクロRNA（miRNA）は遺伝子発現の重要な調節因子であり、多くの生物学的プロセスにおいて役割を果たすことが示されている。より良いmiRNAの- UTRの相互作用を理解するために、我々は新たなルシフェラーゼ遺伝子およびアッセイ試薬、LightSwitchのシステムと対になって3 UTRルシフェラーゼレポーターのゲノムワイドなコレクションを作成している。

3&#39;UTR -レポーターコンストラクトとマイクロRNAを使用してLightSwitchルシフェラーゼアッセイシステムによるヒトマイクロRNAの識別対象は付着細胞へのミミック

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression and play a role in many biological processes.  More than 700 human miRNAs have been ...

Research

JoVE Journal

Biology

Studying Membrane Biogenesis with a Luciferase-Based Reporter Gene Assay

ルシフェラーゼベースのレポーター遺伝子アッセイで膜の生合成を研究して

To study the coordination of different lipid synthesis pathways during membrane biogenesis it is useful to work with an experimental system where membrane ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

高効率で初代培養細胞をトランスフェクトするためにジーンパルサーMXcellのエレクトロポレーションシステムの使用

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

接着および非接着性の哺乳動物細胞の in situ細胞下分画で

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, ...

Clonogenic Assay: Adherent Cells

クローン原性アッセイ：付着細胞

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. ...

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

小分子の誘導と多能性ヒト胚性幹細胞からヒト心筋前駆体と心筋細胞の効率的な導出

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

GFPをレトロウイルスベクターを用いた誘導多能性幹細胞（性IPSC）にヒト体細胞を再プログラミングする

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

A Chemical Screening Procedure for Glucocorticoid Signaling with a Zebrafish Larva Luciferase Reporter System

ゼブラフィッシュ幼虫ルシフェラーゼレポーターシステムを用いたグルココルチコイドシグナル伝達のための化学スクリーニング法

Glucocorticoid stress hormones and their artificial derivatives are widely used drugs to treat inflammation, but long-term treatment with glucocorticoids ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

仙台ウイルスのヒト体細胞からの効率的な次世代ヒューマン誘導多能性幹細胞

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

Detection of miRNA Targets in High-throughput Using the 3'LIFE Assay

3&#39;LIFEアッセイを用いた高スループットにおけるmiRNA標的の検出

Luminescent Identification of Functional Elements in 3&#8217;UTRs (3&#8217;LIFE) allows the rapid identification of targets of specific miRNAs within an ...

Transfecting RAW264.7 Cells with a Luciferase Reporter Gene

ルシフェラーゼレポーター遺伝子でRAW264.7細胞をトランスフェクト

Transfection of desired genetic materials into cells is an inevitable procedure in biomedical research studies. While numerous methods have been ...