Name: monitoring cleaved caspase-3 activity and apoptosis of immortalized oligodendroglial cells using live-cell imaging and cleaveable fluorogenic-dye substrates following potassium-induced membrane depolarization
Uploaded: 2012-01-13T13:00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Cleaved Caspase-3 Activity and Apoptosis of Immortalized Oligodendroglial Cells using Live-cell Imaging and Cleaveable Fluorogenic-dye Substrates F

وقد تم دعم هذا المختبر من قبل المعاهد الكندية لأبحاث الصحة ، والعلوم الطبيعية والهندسة مجلس البحوث وكندا ، وجمعية التصلب المتعدد في كندا (MSSC). وكان GSTS المتلقي لدراسية لدرجة الدكتوراه من MSSC. نحن ممتنون للدكتور جوان بوغز (مستشفى الأطفال المرضى ، وتورونتو) لإجراء مناقشات مفيدة كثيرة وتعليقات على هذه المخطوطة. ونحن ممتنون لBiotium لبيع الهدايا السخية من NucView إضافية 488 كاسباس 3.

<ol>
	<li>Antczak, C., Takagi, T., Ramirez, C. N., Radu, C., Djaballah, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+imaging+of+caspase+activation+for+high-content+screening.">Live-cell imaging of caspase activation for high-content screening.</a> J. Biomol. Screen. 14, 956-969 (2009).</li><li>Cen, H., Mao, F., Aronchik, I., Fuentes, R. J., Firestone, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DEVD-NucView488:+a+novel+class+of+enzyme+substrates+for+real-time+detection+of+caspase-3+activity+in+live+cells.">DEVD-NucView488: a novel class of enzyme substrates for real-time detection of caspase-3 activity in live cells.</a> FASEB. J. 22, 2243-2252 (2008).</li><li>de Calignon, A., Fox, L. M., Pitstick, R., Carlson, G. A., Bacskai, B. J., Spires-Jones, T. L., Hyman, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase+activation+precedes+and+leads+to+tangles.">Caspase activation precedes and leads to tangles.</a> Nature. 464, 1201-1204 (2010).</li><li>Eldadah, B. A., Faden, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase+pathways,+neuronal+apoptosis,+and+CNS+injury.">Caspase pathways, neuronal apoptosis, and CNS injury.</a> J. Neurotrauma. 17, 811-829 (2000).</li><li>Foster, L. M., Phan, T., Verity, A. N., Bredesen, D., Campagnoni, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+analysis+of+normal+and+shiverer+temperature-sensitive+immortalized+cell+lines+exhibiting+phenotypic+characteristics+of+oligodendrocytes+at+several+stages+of+differentiation.">Generation and analysis of normal and shiverer temperature-sensitive immortalized cell lines exhibiting phenotypic characteristics of oligodendrocytes at several stages of differentiation.</a> Dev. Neurosci. 15, 100-109 (1993).</li><li>Fulton, D., Paez, P. M., Fisher, R., Handley, V., Colwell, C. S., Campagnoni, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+L-type+Ca(++)+currents+and+process+morphology+in+white+matter+oligodendrocyte+precursor+cells+by+golli-myelin+proteins.">Regulation of L-type Ca(++) currents and process morphology in white matter oligodendrocyte precursor cells by golli-myelin proteins.</a> Glia. 58, 1292-1303 (2010).</li><li>Hisahara, S., Okano, H., Miura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase-mediated+oligodendrocyte+cell+death+in+the+pathogenesis+of+autoimmune+demyelination.">Caspase-mediated oligodendrocyte cell death in the pathogenesis of autoimmune demyelination.</a> Neurosci. Res. 46, 387-397 (2003).</li><li>Lau, A., Tymianski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+receptors,+neurotoxicity+and+neurodegeneration.">Glutamate receptors, neurotoxicity and neurodegeneration.</a> Pflugers. Arch. 460, 525-542 (2010).</li><li>Lawrence, M. S., Ho, D. Y., Sun, G. H., Steinberg, G. K., Sapolsky, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+Bcl-2+with+herpes+simplex+virus+vectors+protects+CNS+neurons+against+neurological+insults+in+vitro+and+in+vivo.">Overexpression of Bcl-2 with herpes simplex virus vectors protects CNS neurons against neurological insults in vitro and in vivo.</a> J. Neurosci. 16, 486-496 (1996).</li><li>Paez, P. M., Spreuer, V., Handley, V., Feng, J. M., Campagnoni, C., Campagnoni, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+expression+of+golli+myelin+basic+proteins+enhances+calcium+influx+into+oligodendroglial+cells.">Increased expression of golli myelin basic proteins enhances calcium influx into oligodendroglial cells.</a> J. Neurosci. 27, 12690-12699 (2007).</li><li>Sanchez Mejia, R. O., Friedlander, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspases+in+Huntington's+disease.">Caspases in Huntington's disease.</a> Neuroscientist. 7, 480-489 (2001).</li><li>Smith, G. S. T., De Avila, M., Paez, P., Spreuer, V., Wills, M. K. B., Jones, N., Boggs, J. M., Harauz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proline+substitutions+and+threonine+pseudo-phosphorylation+of+the+SH3-ligand+of+18.5+kDa+myelin+basic+protein+decrease+affinity+for+the+Fyn-SH3-domain+and+alter+process+development+and+protein+localization+in+oligodendrocytes.">Proline substitutions and threonine pseudo-phosphorylation of the SH3-ligand of 18.5 kDa myelin basic protein decrease affinity for the Fyn-SH3-domain and alter process development and protein localization in oligodendrocytes.</a> J. Neurosci. Res. , (2011).</li><li>Smith, G. S. T., Paez, P. M., Spreuer, V., Campagnoni, C. W., Boggs, J. M., Campagnoni, A. T., Harauz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classical+18.5-and+21.5-kDa+isoforms+of+myelin+basic+protein+inhibit+calcium+influx+into+oligodendroglial+cells,+in+contrast+to+golli+isoforms.">Classical 18.5-and 21.5-kDa isoforms of myelin basic protein inhibit calcium influx into oligodendroglial cells, in contrast to golli isoforms.</a> J. Neurosci. Res. 89, 467-480 (2011).</li><li>Springer, J. E., Azbill, R. D., Knapp, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+caspase-3+apoptotic+cascade+in+traumatic+spinal+cord+injury.">Activation of the caspase-3 apoptotic cascade in traumatic spinal cord injury.</a> Nat. Med. 5, 943-946 (1999).</li><li>Verity, A. N., Bredesen, D., Vonderscher, C., Handley, V. W., Campagnoni, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+myelin+protein+genes+and+other+myelin+components+in+an+oligodendrocytic+cell+line+conditionally+immortalized+with+a+temperature-sensitive+retrovirus.">Expression of myelin protein genes and other myelin components in an oligodendrocytic cell line conditionally immortalized with a temperature-sensitive retrovirus.</a> J. Neurochem. 60, 577-587 (1993).</li><li>Yu, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+critical+role+of+potassium+homeostasis+in+apoptosis.">Regulation and critical role of potassium homeostasis in apoptosis.</a> Prog. Neurobiol. 70, 363-386 (2003).</li></ol>

الكتاب ليس لديهم تضارب المصالح في الكشف عنها.

على الرغم من أن هذا ليس هو المنتج الوحيد fluorogenic المتاحة للكشف عن موت الخلايا المبرمج ، وهناك العديد من المزايا الهامة لاستخدام 488 NucView الركيزة. واحدة من الفوائد الرئيسية هي القدرة على متابعة موت الخلايا المبرمج في الخلايا الحية في الوقت الحقيقي ، في حين أن معظم المنتجات البديلة تتطلب إما تحلل الخلية أو الفقراء نفاذية الخلية. وتشمل المزايا الأخرى للحساسية عالية كاسباس 3 الاعتراف ، وارتفاع نفاذية الخلية ، السمسة منخفضة ، وعدم التدخل في تطور الخلايا. الركيزة كما منخفضة مضان الخلفية حتى يتم ذلك المشقوق ويدخل النواة ، الذي يلغي مضان الخلفية. تسلسل كاسباس 3 الاعتراف يحتوي على 3 الشحنات السالبة وصبغ الحمض النووي ملزم واحد شحنة موجبة 2. وDEVD - NucView 488 جزيء وبالتالي تهمة صافية سلبية ، مما يحول دون تفعيل وملزمة للصباغة على الحمض النووي في الخلايا حيث caspase غير نشطة. أماهمطلوب التناسق بين intaining التجارب لتكون قادرة على عقد مقارنات ذات مغزى بين مكررات. واحدة من المعالم الرئيسية للحفاظ على كثافة الثابت هو الخلية ، كما أنه يؤثر على معدل ترنسفكأيشن. الحصول على معدلات عالية في خلد ترنسفكأيشن N19 - OLG الثقافات الخلية هي أكثر صعوبة من غيرها مع خطوط الخلايا الشائعة مثل هيلا أو HEK293 ، وتعتمد بدرجة كبيرة على الكثافة ، وتجربتنا في 12 و 13. وقد تم الحصول على الكفاءات وسعنا ترنسفكأيشن لهذه الخلايا مع HD Fugene (روش) ، وعادة ما يقرب من 15 ٪ ، ولكن يمكن أن تصل إلى أكثر من 30 ٪ ، اعتمادا على بناء. سيكون حذرا العد الخلية المساعدات في الحصول على أسعار ترنسفكأيشن متناسقة. من المهم أيضا للكشف عن خلايا من علاجات مختلفة لنفس الدرجة من الإجهاد البيئي ، وبخاصة عندما قياس معدلات موت الخلايا المبرمج. على وجه التحديد ، وطول الفترة الزمنية التي يتعرض لها أكثر من الخلايا لالكواشف ترنسفكأيشن ، أو مقدار التعرض للضوء ، أهمية بيئية فاريABLES للنظر ، وينبغي أن تظل ثابتة عبر التجارب. لتقديم الطلبات ، لدينا وجدت أن جمع عدد كبير من حقول للرؤية يوفر حجم عينة كبيرة بما فيه الكفاية لإجراء مقارنات إحصائية كبيرة ، [المرجع السابق].

جدول محدد الكواشف والمعدات <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tr><th> اسم الكاشف </th><th> شركة </th><th> كتالوج رقم </th></tr><tr><td> NucView 488 كيت كاسباس 3 الفحص عن الخلايا الحية </td><td> Biotium </td><td> 30029 </td></tr><tr><td> FuGENE كاشف HD ترنسفكأيشن </td><td> روش </td><td> 04709705001 </td></tr><tr><td> Dulbecco في التعديل النسر متوسطة </td><td> Gibco </td><td> 31053-028 </td></tr><tr><td> 0.25 ٪ التربسين </td><td> Gibco </td><td> 15050-065 </td></tr><tr><td> المصل البقري الجنين </td><td> Gibco </td><td> 12483-020 </td></tr><tr><td> البنسلين / الستربتومايسين </td><td> Gibco </td><td> 15140122 </td></tr><tr><td> # 1،5-25 مم ساترة زجاجية </td><td> نذير الآلات </td><td> 64-0715 </td></tr><tr><td> Chamlide CMB المغناطيسي غرفة الثقافة لمدة 25 ملم ساترة </td&gt; <td> النصاب القانوني للتكنولوجيا </td><td> CM - B - 40 </td></tr><tr><td> Cellstart زراعة الأنسجة أطباق 10 سم </td><td> VWR </td><td> 82050-576 </td></tr><tr><td> دينار بحريني فالكون زراعة الأنسجة 6 - جيدا الأطباق </td><td> VWR </td><td> CA62406 - 161 </td></tr></table>

monitoring cleaved caspase-3 activity and apoptosis of immortalized oligodendroglial cells using live-cell imaging and cleaveable fluorogenic-dye substrates following potassium-induced membrane depolarization

يمكن للنظام العصبي المركزي التجربة عددا من الضغوط العصبية والشتائم ، والذي يمكن أن يكون لها آثار سلبية عديدة تؤدي في نهاية المطاف الى خفض في عدد السكان وظيفة الخلايا العصبية. ويمكن إطلاق الجزيئات التالفة المحاوير مثير بما البوتاسيوم أو الغلوتامات في المصفوفة خارج الخلية ، والتي بدورها ، يمكن أن تنتج المزيد من الاهانة والضرر لخلايا الدبقية النجمية بما في ذلك دعم وoligodendrocytes 8 و 16. إذا استمرت الإساءة ، وسوف تخضع خلايا موت الخلايا المبرمج (موت الخلايا المبرمج) ، الذي ينظم وتفعيلها من خلال عدد من شلالات راسخة نقل الإشارة 14. يمكن أن موت الخلايا المبرمج ونخر الأنسجة تحدث بعد إصابات في الدماغ ، نقص التروية الدماغية ، والنوبات. والمثال الكلاسيكي لتنظيم أفكارك هي السيستين عائلة تعتمد على البروتياز - اسبارتاتي الموجهة ، أو caspases. كما تم تفعيلها بما البروتياز caspases متورطين في موت الخلايا العصبية في استجابة لالمزمنةالأمراض التنكسية بما في ذلك مرض الزهايمر ، وهنتنغتون ، والتصلب المتعدد 4 ، 14 ، 3 ، 11 ، 7. في هذا البروتوكول وصفنا استخدام الركيزة NucView كاسباس 3 488 ​​لقياس نسبة موت الخلايا المبرمج 3 كاسباس توسط في خلد N19 - oligodendrocyte الثقافات الخلية (OLG) 15 ، 5 ، بعد التعرض لضغوط خارج الخلية مختلفة مثل تركيزات عالية من البوتاسيوم أو الغلوتامات. تم الحصول على مشروط ، خلدت خط الخلية N19 - OLG (الذي يمثل السلف O2A) من الدكتور أنتوني Campagnoni (UCLA سيميل معهد العلوم العصبية) 15 ، 5 ، وكان يستخدم في السابق لدراسة الآليات الجزيئية في التعبير الجيني الميلين ونقل الإشارة الرائدة لOLG التمايز (على سبيل المثال 6 ، 10). لقد تم العثور على هذا الخط الخلية لتكون قوية فيما يتعلق ترنسفكأيشن الخارجية مع البروتين الأساسي المايلين (MBP) يبني تنصهر فيها إما لطلب تقديم العروض أو GFP (أحمر أو أخضر بروتين فلوري) 13 ،12. هنا ، تم التعامل مع الثقافات الخلية N19 - OLG إما مع 80 ملم كلوريد البوتاسيوم أو الصوديوم الغلوتامات 100 ملم إلى محاكاة تسرب محواري في المصفوفة خارج الخلية للحث على موت الخلايا المبرمج 9. استخدمنا ثنائية وظيفية كاسباس 3 الركيزة التي تحتوي على (حمض الغلوتاميك - ASP - فال ASP) DEVD كاسباس 3 الوحيدات الاعتراف وصبغة الحمض النووي ملزم 2. الركيزة يدخل بسرعة السيتوبلازم حيث المشقوق من قبل الخلايا 3 caspase. يتم تحرير الصبغة ، NucView 488 و يدخل نواة الخلية حيث يربط الحمض النووي والأخضر في 488 نانومتر تتفلور ، مما يشير إلى موت الخلايا المبرمج. استخدام 488 NucView الركيزة - 3 caspase يسمح للخلية الحية التصوير في الوقت الحقيقي 1 و 10. في هذا الفيديو ، ونحن كذلك أن تصف وزراعة الخلايا ترنسفكأيشن من خلد N19 - OLG ، فضلا عن تقنيات التصوير الحية الخلية.

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Cleaved Caspase-3 Activity and Apoptosis of Immortalized Oligodendroglial Cells using Live-cell Imaging and Cleaveable Fluorogenic-dye Substrates F

Monitoring Cleaved Caspase-3 Activity and Apoptosis of Immortalized Oligodendroglial Cells using Live-cell Imaging and Cleaveable Fluorogenic-dye Substrates Following Potassium-induced Membrane Depola

تعيش خلية من الخلايا بوساطة التصوير كاسباس 3 في خلد الثقافات الخلية N19 - oligodendrocyte باستخدام<em&gt; NucView</em&gt; 488 كاسباس 3 الركيزة. هذا الأسلوب ينطبق على موت الخلايا المبرمج المقايسات في الوقت الحقيقي في مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا والأنسجة.

رصد المشقوق كاسباس 3 النشاط وموت الخلايا المبرمج للخلايا Oligodendroglial مخلد باستخدام خلايا حية التصوير وCleaveable ركائز Fluorogenic صباغة وبعد زوال الاستقطاب الناجم عن غشاء البوتاسيوم

The central nervous system can experience a number of stresses and neurological insults, which can have numerous adverse effects that ultimately lead to a ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Monitoring Cleaved Caspase-3 Activity and Apoptosis of Immortalized Oligodendroglial Cells using Live-cell Imaging and Cleaveable Fluorogenic-dye Substrates Following Potassium-induced Membrane Depolarization

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

تعيش خلية التصوير الحسي للخلايا السليمة في الجهاز السلائف ذبابة الفاكهة شرانق

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

تحليل كمي متشابك الحويصلة التجديد حمام سباحة في الخلايا العصبية مثقف الحبيبية للدماغ باستخدام الأصباغ FM

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Caspase-3 Activity in the Rat Amygdala Measured by Spectrofluorometry After Myocardial Infarction

كاسباس 3 النشاط في الفئران اللوزة تقاس Spectrofluorometry بعد احتشاء عضلة القلب

Myocardial infarction (MI) has dramatic mid- and long-term consequences at the physiological and behavioral levels, but the mechanisms involved are still ...

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

تسجيل درجة الحرارة التي يسببها العصبية آخر من خلال مراقبة التغيرات الكالسيوم في البصلة الشمية من<em&gt; القيطم المورق</em

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. ...

Live-cell Measurement of Odorant Receptor Activation Using a Real-time cAMP Assay

خلية يعيش "قياس الرائحة مستقبلات التنشيط باستخدام" مقايسة مخيم في الوقت الحقيقي

The enormous sizes of the mammalian odorant receptor (OR) families present difficulties to find their cognate ligands among numerous volatile chemicals. ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

التصوير النشاط العصبي في القشرة الأولية Somatosensory باستخدام Thy1-GCaMP6s الفئران المحورة وراثيا

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Analyzing Neural Activity and Connectivity Using Intracranial EEG Data with SPM Software

تحليل النشاط العصبي والاتصال باستخدام بيانات التخطيط الدماغي داخل الجمجمة مع برنامج الحركة الوطنية الصومالية

Measuring neural activity and connectivity associated with cognitive functions at high spatial and temporal resolutions is an important goal in cognitive ...

ROS Live Cell Imaging During Neuronal Development

ROS تصوير الخلايا الحية أثناء تطوير الخلايا العصبية

Reactive oxygen species (ROS) are well-established signaling molecules, which are important in normal development, homeostasis, and physiology. Among the ...

Simultaneous Imaging of Microglial Dynamics and Neuronal Activity in Awake Mice

التصوير المتزامن لديناميات الخلايا الدبقية الصغيرة والنشاط العصبي في الفئران المستيقظة

Since brain functions are under the continuous influence of the signals derived from peripheral tissues, it is critical to elucidate how glial cells in ...

Microfluidics-Assisted Selective Depolarization of Axonal Mitochondria

إزالة الاستقطاب الانتقائي بمساعدة الموائع الدقيقة للميتوكوندريا المحورية

Mitochondria are the primary suppliers of ATP (adenosine triphosphate) in neurons. Mitochondrial dysfunction is a common phenotype in many ...