Name: monitoring cleaved caspase-3 activity and apoptosis of immortalized oligodendroglial cells using live-cell imaging and cleaveable fluorogenic-dye substrates following potassium-induced membrane depolarization
Uploaded: 2012-01-13T13:00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Cleaved Caspase-3 Activity and Apoptosis of Immortalized Oligodendroglial Cells using Live-cell Imaging and Cleaveable Fluorogenic-dye Substrates F

מעבדה זה כבר נתמך על ידי מכוני המחקר הקנדי הבריאות, מדעי הטבע וההנדסה מועצת המחקר של קנדה, האגודה לטרשת נפוצה בקנדה (MSSC). GSTS היה מקבל תעודת סטודנט לדוקטורט מ MSSC. אנו מודים ד&quot;ר ג&#39;ואן בוגס (בית החולים לילדים חולים, טורונטו) לדיונים מועילים הערות רבות על כתב היד הזה. אנו אסירי תודה על המתנה הנדיבה Biotium שלהם NucView נוסף 488 caspase-3.

1. מפשיר תאים culturing <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג מלאי קפוא N19-oligodendroglial תאים הנציח מן ארוך טווח חנויות חנקן נוזלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקבוקון המכיל תאים לטבול ב 37 ° C אמבט מים עד ההשעיה התא מופשר לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 7 מ&quot;ל של DMEM (שינוי של Dulbecco בינוני Eagle), עם גלוקוז גבוהה בתוספת 10% FBS (בסרום שור עוברית) ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין על צלחת 10 ס&quot;מ תרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את התא ההשעיה ירידה מבחינת הצלחת, בעדינות להתסיס הסלע צלחת פטרי לפזר את התאים באופן שווה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התרבות התאים ב 34 ° C / 5% CO 2 באינקובטור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 4 שעות, מדיה לשאוב מתוך צלחות להסיר כל DMSO הנותרים (sulphoxide דימתיל) כי שימש cryoprotectant, ולהחליף עם התקשורת טרי (7 מ&quot;ל DMEM גלוקוז גבוהה מדיה בתוספת 10% FBS ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין) . </li></ol> 2. Passaging תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב 70-80%מפגש (4-7 צמיחה ימים), לשאוב מדיה מן התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ&quot;ל של 0.25% טריפסין לצלחת. פיפטה טריפסין לנתק את התאים (בערך 5 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את דילולים מתאים תנאי הניסוי ומעבר צלחת תוספת של 10 ס&quot;מ עבור ניסויים בעתיד על צפיפות התאים לא פחות 0.1 x 10 6 תאים / מ&quot;ל. </li></ol> הערה: אתה צריך מעבר התאים שלך לפחות פעמיים לאחר ההפשרה לפני השימוש בהם ניסויים. 3. ספירת תאים ו ציפוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי תאים צלחת הדמיה לחיות תאים, trypsinize כפי שתואר לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרה של כ -30 μL של תאים לספור באמצעות haemocytometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצב coverslip זכוכית ללא ציפוי בצלחת 6 היטב. הוסף התאים לבאר בצפיפות של 0.1 x 10 6 תאים / מ&quot;ל 2 מ&quot;ל פנול ללא DMEM גלוקוז גבוהה בתקשורת, בתוספת 10% FBS ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין, בשעה 34 ° C / 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתירהתאים לגדול בין לילה (16-20 שעות) בשעה 34 ° C / 5% CO 2 לפני transfection. </li></ol> 4. Transfection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 100 μL בסרום ללא מדיה, 0.5-4 מיקרוגרם מטוהרים DNA פלסמיד, ו 4 μL FuGENE HD (Roche). וורטקס בעדינות לתערובת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> וורטקס שוב בקצרה לאפשר את הדנ&quot;א מורכב 5 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן להוסיף את תערובת FuGENE HD ישירות אל ה-DNA בתאים בתרבית. הטה את הצלחת בעדינות לתערובת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התרבות תאים עבור 48 שעות נוספות על 34 ° C / 5% CO 2 לפני הטיפול או ניסויים. </li></ol> 5. תאים הכנה הדמיה Live-Cell (LCI) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את תיבת Chamlide LCI לחיות תאים בקרת מכשיר לפחות 1 שעה לפני שאתה רוצה להתחיל את הניסוי שלך. קופסת הבקרה גם מסדיר את הטמפרטורה והלחות בתוך Chamlide LCI, מווסת את זרימת 5% מעורבבים מראש CO 2. </li></ol> הערה: רצוילהפעיל את קופסת השליטה עד 3 שעות לפני תחילת הניסויים כדי להבטיח את הבמה כולה מגיע 34 ° C. צעד זה יקטין להיסחף מוקד, אשר נגרמת על ידי fluxulation ואת התפשטות תרמית של השלב מתכת כפי שהיא מחממת, במהלך ההדמיה. <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבודה במנדף זרימה, לרסס את החדר Chamlide מגנטי מסוג התרבות, פינצטה, עם אתנול 70% ולאפשר להם להתייבש במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת תאים החממה לאשר כי הם בריאים. הם צריכים להופיע חסיד היטב להתפשט על coverslip הזכוכית עם תהליכים ממברנה רבים. תאים לחוצים מן transfection אינם מתאימים לניסויים, ויהיה מספר מופחת של תהליך שלוחות, ולעיתים קרובות יש גרעין סדיר בצורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הטה את צלחת 6-היטב ולהסיר את coverslip עם פינצטה. במהירות למקום בצד התא coverslip לתוך צלחת התחתון של החדר תרבות. אל תאפשר coverslip להתייבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף הראשי מגנטיהגוף של חדר התרבות להוסיף 500 μL של התקשורת מהצלחת 6-היטב המקורי על החלק העליון של coverslip. מחדש באמצעות מדיה זו תקטין את כמות הלחץ המוטל על התאים הנגרם על ידי שינויים סביבתיים, יכולה להיות שימושית גם להערכת גורמים המופרשים תאיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את הכיסוי על זכוכית חדר תרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש KimWipe ריססו עם אתנול 70% כדי להסיר כל חומר שיורית מתחתית coverslip, אשר יפריע במיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את חדר התרבות של 34 ° C / 5% CO 2 באינקובטור למשך 30 דקות. צעד זה יבטיח כי החדר עצמו מחמם עד 34 מעלות צלזיוס כדי להפחית הסטה של ​​coverslip כמו מתכת מתחמם. </li></ol> 6. מיקרוסקופ הגדרות תמונות נרכשו כאן באמצעות מיקרוסקופ DMIRE2 לייקה הפוכה עם עדשה ממסר מותאם אישית פליטת לסנן גלגל דיור עבור טעינת מחסנית של גלגלים מרובים (Quorum טכנולוגיות בע&quot;מ, Guelph, ב). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Brightfield - מנורה מוגדר V 2.5 וחשיפה זמן עד 240 ms. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלבון האדום פלורסנט (RFP) - רווח נקבע על 140 עבור 200 ms. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלבון הפלואורסצנט הירוק (GFP) - רווח נקבע על 140 עבור 500 ms. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיקרוסקופ שלנו יש מנורה dimmable ולא דיסק מסתובב כדי לשלוט על כמות האור זמין לתאים. אנחנו רצים בניסויים שלנו עם האור ב 90% של עוצמת מנורה מקסימלית. </li></ol> 7. טיפול של תאים עם מעוררים אפופטוזיס ו NucView 488 caspase-3 המצע <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשוב להכין מלאי גדול של אפופטוזיס מעוררים מראש ולהקפיא אותם aliquots, כך ריכוזי יהיה עקבי בין הניסויים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המצע 488 NucView רגיש לאור. הכן aliquots של 15 μL להפחית צינורות הקפאה / הפשרה, ולאחסן ב -20 מעלות מכוסה בנייר אלומיניום. עבודה עם תאורה בחדר הסביבה נמוך ככל האפשר כדי להקטין את החשיפה של NucV488 המצע iew לאור, לפני השימוש בו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחזר את החדר במהירות תרבות האינקובטור כך התאים אינם חשופים לירידה בטמפרטורה. מניחים את חדר תרבות על החדר הסביבה של המיקרוסקופ, ולהשתמש מהדק כדי לשמור על תא התרבות לנוע. בנקודה זו כדאי גם לעמעם את האורות בחדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את הטנק 5% CO 2 מעורבבים מראש עם הרגולטור כפול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש המטרה 10x, המיקוד למצוא תאים על צג המחשב באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר. הערה: אתה רוצה להשתמש את הצמצם המספרי הגדול ביותר על המטרה עם ההגדלה הרצוי כדי לצמצם את זמן החשיפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעוררים ספק של אפופטוזיס של תאים (במקרה שלנו אשלגן 80 מ&quot;מ, או 100 גלוטמט מ&quot;מ), באחת השיטות הבאות ניתן להשתמש. נשתמש משלוח של אשלגן 80 מ&quot;מ כדוגמה, באמצעות KCl מומס כמו להתרכז 10x בתקשורת אופייני לתרבות שלנו. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדיה חילופי בy איטי המקומית זלוף: - השתמש משאבה peristaltic התקשורת חילופי בתא תרבות עם מדיה חדשה המכילה 80 mM אשלגן. - קצה אחד של הצינור יעביר 10 מ&quot;ל מלאי של 80 mM אשלגן מומס פנול ללא DMEM, ואת הקצה השני של צינור יסיר התקשורת מהאולם. - אתה רוצה להחליף לפחות 10x של התקשורת על מנת להבטיח כי התקשורת שמאל בחדר יש את הריכוז הנכון של אשלגן. - אחרי התקשורת הוא החליף, להוסיף 3 μL של המצע 488 NucView לתקשורת בחדר. פיפטה לערבב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בנוסף ישיר של 80 mM K + ו - 488 NucView המצע התקשורת בחדר תרבות: - הכן פתרון מניות 10x של אשלגן 80 מ&quot;מ מומס פנול ללא DMEM. - להוסיף 3 μL של המצע 488 NucView כדי μL 50 של אשלגן 80 10x מ&quot;מ. פיפטה לערבב. הוסף 500 μL פנול ללא DMEM בחדר התרבות. הערה: שיטה זו הואהעדיפו אם אתה מעוניין בשמירה או הערכת גדילה או גורמים המופרשים אחרים שעשויים להיות נוכחים בתקשורת המקורי. מצאנו כי המצע 488 NucView יציב בתרבות תא ניסויים קיימא כל עוד 36 ח </li></ol></li></ol> 8. Live-תא הדמיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על ערוץ אדום כדי להציג תאים transfected. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר ולשמור סביב מסגרות עשרות שבו יש מספר תאים transfected, ולשמור אותם &quot;נקודות XY הבמה&quot;. בהתאם לכמות של זיכרון המחשב, אתה עלול להיות מוגבל במספר נקודות בשלב הזה תוכל לרכוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האם את לכידת תמונות מיקרוסקופ (בערוץ, בהיר שדה אדום, ערוץ ירוק) בשלב אלה הציל נקודות כל 6 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כל מכתים ירוק כי הוא גלוי בשלבים הראשונים של הניסויים סביר מצביע על תאים העוברים אפופטוזיס כבר, בדרך כלל עקב transfection ו / או סטרס סביבתי. Apoptosis בשל טיפולים ניסיוניים יזוהו על timepoint מאוחר יותר בניסוי. </li></ol> 9. ניתוח סטטיסטי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצורך ניסוי זה, אנו התוכנית מיקרוסקופ כדי לרכוש נקודות XY רבים לאסוף נתונים גדול להגדיר ביעילות. כל ניסוי מתבצע לשכפל או בשלושה עותקים, ונתונים שנאספו מתוך ניסויים נפרדים שבוצעו בימים שונים. מתוך כל ערכת נתונים, אנו מנתחים עד 15 בתחומי להציג ולהשוות את היחס של caspase-שלילי התאים caspase-חיובי תאים (המספר הכולל של תאים בתוך שדה הראיה / המספר הכולל של caspase-חיובי תאים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המדידות מוקלט מתוך ערכת נתונים בכל מקובצים לקבוע מדגם גדול יותר, והם השוו אחד לשני באמצעות שולחן ANOVA (p = 0.05). אנחנו מראים את שגיאות תקן של הממוצע (SEM) של כל ניסוי, ולאחר מכן להשוות את ההבדל אמצעי ידי ביצוע השוואה אמצעי טיוקי בדיקה (p = 0.05) כדי לקבוע WHich טיפולים שונים מהותית אחד מהשני. </li></ol> 10. נציג תוצאות תיארנו ניסוי כדי להמחיש כיצד את המצע 488 NucView יכול להצביע על שיעור מוגבר של אפופטוזיס של N19-OLG בתרביות תאים בעקבות הטיפול עם ריכוז אשלגן גבוה תאית. N19-תאים היו transfected עם RFP, וטופלו גם עם 3 המצע μL 488 NucView (שליטה), או 3 μL NucView 488 המצע 80 מ&quot;מ [K +] (טיפול). תאים נוטרו ותמונות נרכשו במהלך 12 שעות זמן, וזה מתאים מחקרים שכללו עלבונות נוירולוגיות (איור 1A). בתנאים שליטה, אנחנו לא רואים כמויות משמעותיות של אפופטוזיס לעומת 80 מ&quot;מ [K +] תרבויות מטופלים (תיבת מרוסקים), שהראה כ 45% התא למוות לאחר 12 שעות (איור 1B). אות ירוק רקע לצפותד בתנאים בקרה מציין את התאים עוברים אפופטוזיס ללא תוספת של אשלגן תאיים. כמעט אף אחד התאים של אפופטוזיס הניסוי התערוכה שליטה על ידי נקודת זמן 12 שעות, אם כי במצבים אחרים הניסויים עשויים להידרש לרוץ יותר. תמונות שנרכשו באמצעות אובייקטיבי 10x. בר = 100 מיקרומטר. <img alt="איור 1a" src="/files/ftp_upload/3422/3422fig1.jpg" /> <img alt="איור 1b" src="/files/ftp_upload/3422/3422fig1b.jpg" /> באיור 1. (א) 12 שעות כמובן זמן הניסוי של N19 תרבויות OLG 48 שעות שלאחר transfection להביע RFP-MBP (ערוץ אדום) יחד עם μL 3 של המצע 488 NucView (ערוץ ירוק). תרבויות טופלו או עם ריכוז סופי של 80 מ&quot;מ [K +] (פאנלים משמאל), או ללא טיפול כביקורת (לוחות מימין). תמונות שנרכשו ב 6 דקות במרווחים, והפעלה משמעותית של ביקע caspase-3 (סימן ירוק) ניתן לצפותד בתרבויות שטופלו 80 מ&quot;מ [K +] בתוך גרעין התא (תיבת מרוסקים) לעומת הניסוי שליטה. (B) אחוז caspase-3 תאים ביקע (מחושב על ידי חלוקת המספר הכולל של תאים בתחום התצוגה על ידי המספר הכולל של caspase-חיובי תאים). לשם השוואה לשלוט בתנאים, צפינו סביב מוות של תאים 45% בעקבות K + טיפול על ידי 12 ח sVideo 1. קורס 12 שעות זמן הניסוי של N19-OLG תרבויות 48 שעות שלאחר transfection להביע RFP-MBP (אדום ערוץ) עם μL 3 של המצע 488 NucView (ערוץ ירוק), יחד עם זוהר שדה הדימויים דרך שלושה התמונה הממוזגת, לאחר הטיפול עם 80 מ&quot;מ [K +]. sVideo 2. קורס 12 שעות זמן הניסוי של N19-OLG תרבויות 48 שעות שלאחר transfection להביע RFP-MBP (אדום ערוץ) עם μL 3 של המצע 488 NucView (ערוץ ירוק), יחד עם מתאר לעצמי בהירה שדהes ותמונה משולשת הממוזג. אין טיפול יושמה על תרבויות N19-OLGs ניתן לראות נודדות דרך שדה מיקרוסקופ לעומת בתרביות תאים שטופלו 80 מ&quot;מ [K +] (השוו עם sVideo 1).

<ol>
	<li>Antczak, C., Takagi, T., Ramirez, C. N., Radu, C., Djaballah, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+imaging+of+caspase+activation+for+high-content+screening.">Live-cell imaging of caspase activation for high-content screening.</a> J. Biomol. Screen. 14, 956-969 (2009).</li><li>Cen, H., Mao, F., Aronchik, I., Fuentes, R. J., Firestone, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DEVD-NucView488:+a+novel+class+of+enzyme+substrates+for+real-time+detection+of+caspase-3+activity+in+live+cells.">DEVD-NucView488: a novel class of enzyme substrates for real-time detection of caspase-3 activity in live cells.</a> FASEB. J. 22, 2243-2252 (2008).</li><li>de Calignon, A., Fox, L. M., Pitstick, R., Carlson, G. A., Bacskai, B. J., Spires-Jones, T. L., Hyman, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase+activation+precedes+and+leads+to+tangles.">Caspase activation precedes and leads to tangles.</a> Nature. 464, 1201-1204 (2010).</li><li>Eldadah, B. A., Faden, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase+pathways,+neuronal+apoptosis,+and+CNS+injury.">Caspase pathways, neuronal apoptosis, and CNS injury.</a> J. Neurotrauma. 17, 811-829 (2000).</li><li>Foster, L. M., Phan, T., Verity, A. N., Bredesen, D., Campagnoni, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+analysis+of+normal+and+shiverer+temperature-sensitive+immortalized+cell+lines+exhibiting+phenotypic+characteristics+of+oligodendrocytes+at+several+stages+of+differentiation.">Generation and analysis of normal and shiverer temperature-sensitive immortalized cell lines exhibiting phenotypic characteristics of oligodendrocytes at several stages of differentiation.</a> Dev. Neurosci. 15, 100-109 (1993).</li><li>Fulton, D., Paez, P. M., Fisher, R., Handley, V., Colwell, C. S., Campagnoni, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+L-type+Ca(++)+currents+and+process+morphology+in+white+matter+oligodendrocyte+precursor+cells+by+golli-myelin+proteins.">Regulation of L-type Ca(++) currents and process morphology in white matter oligodendrocyte precursor cells by golli-myelin proteins.</a> Glia. 58, 1292-1303 (2010).</li><li>Hisahara, S., Okano, H., Miura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase-mediated+oligodendrocyte+cell+death+in+the+pathogenesis+of+autoimmune+demyelination.">Caspase-mediated oligodendrocyte cell death in the pathogenesis of autoimmune demyelination.</a> Neurosci. Res. 46, 387-397 (2003).</li><li>Lau, A., Tymianski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+receptors,+neurotoxicity+and+neurodegeneration.">Glutamate receptors, neurotoxicity and neurodegeneration.</a> Pflugers. Arch. 460, 525-542 (2010).</li><li>Lawrence, M. S., Ho, D. Y., Sun, G. H., Steinberg, G. K., Sapolsky, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+Bcl-2+with+herpes+simplex+virus+vectors+protects+CNS+neurons+against+neurological+insults+in+vitro+and+in+vivo.">Overexpression of Bcl-2 with herpes simplex virus vectors protects CNS neurons against neurological insults in vitro and in vivo.</a> J. Neurosci. 16, 486-496 (1996).</li><li>Paez, P. M., Spreuer, V., Handley, V., Feng, J. M., Campagnoni, C., Campagnoni, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+expression+of+golli+myelin+basic+proteins+enhances+calcium+influx+into+oligodendroglial+cells.">Increased expression of golli myelin basic proteins enhances calcium influx into oligodendroglial cells.</a> J. Neurosci. 27, 12690-12699 (2007).</li><li>Sanchez Mejia, R. O., Friedlander, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspases+in+Huntington's+disease.">Caspases in Huntington's disease.</a> Neuroscientist. 7, 480-489 (2001).</li><li>Smith, G. S. T., De Avila, M., Paez, P., Spreuer, V., Wills, M. K. B., Jones, N., Boggs, J. M., Harauz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proline+substitutions+and+threonine+pseudo-phosphorylation+of+the+SH3-ligand+of+18.5+kDa+myelin+basic+protein+decrease+affinity+for+the+Fyn-SH3-domain+and+alter+process+development+and+protein+localization+in+oligodendrocytes.">Proline substitutions and threonine pseudo-phosphorylation of the SH3-ligand of 18.5 kDa myelin basic protein decrease affinity for the Fyn-SH3-domain and alter process development and protein localization in oligodendrocytes.</a> J. Neurosci. Res. , (2011).</li><li>Smith, G. S. T., Paez, P. M., Spreuer, V., Campagnoni, C. W., Boggs, J. M., Campagnoni, A. T., Harauz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classical+18.5-and+21.5-kDa+isoforms+of+myelin+basic+protein+inhibit+calcium+influx+into+oligodendroglial+cells,+in+contrast+to+golli+isoforms.">Classical 18.5-and 21.5-kDa isoforms of myelin basic protein inhibit calcium influx into oligodendroglial cells, in contrast to golli isoforms.</a> J. Neurosci. Res. 89, 467-480 (2011).</li><li>Springer, J. E., Azbill, R. D., Knapp, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+caspase-3+apoptotic+cascade+in+traumatic+spinal+cord+injury.">Activation of the caspase-3 apoptotic cascade in traumatic spinal cord injury.</a> Nat. Med. 5, 943-946 (1999).</li><li>Verity, A. N., Bredesen, D., Vonderscher, C., Handley, V. W., Campagnoni, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+myelin+protein+genes+and+other+myelin+components+in+an+oligodendrocytic+cell+line+conditionally+immortalized+with+a+temperature-sensitive+retrovirus.">Expression of myelin protein genes and other myelin components in an oligodendrocytic cell line conditionally immortalized with a temperature-sensitive retrovirus.</a> J. Neurochem. 60, 577-587 (1993).</li><li>Yu, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+critical+role+of+potassium+homeostasis+in+apoptosis.">Regulation and critical role of potassium homeostasis in apoptosis.</a> Prog. Neurobiol. 70, 363-386 (2003).</li></ol>

המחברים אין ניגודי אינטרסים לחשוף.

אמנם זה לא המוצר היחיד fluorogenic זמין לגילוי אפופטוזיס, ישנם מספר יתרונות משמעותיים באמצעות המצע 488 NucView. אחד היתרונות העיקריים הוא היכולת לעקוב אחר אפופטוזיס בתאים חיים בזמן אמת, ואילו מוצרים חלופיים ביותר או לדרוש תמוגה התא או חדירות התא עניים. יתרונות נוספים כוללים רגישות גבוהה להכרה caspase-3, חדירות התא גבוהה, cytotoxicity נמוך, ואין הפרעה להתקדמות של אפופטוזיס. המצע כולל גם הקרינה רקע נמוכה עד שהוא ביקע ונכנס לגרעין, אשר מבטלת הקרינה רקע. רצף caspase-3 הכרה מכיל 3 המטענים השליליים ואת צבען-DNA מחייב אחד יש מטען חיובי 2. DEVD-NucView 488 המולקולה ולכן יש מטען שלילי נטו, אשר מונע את הפעלת ומחייבת של צבע כדי DNA בתאים שבהם caspase אינו פעיל. אמאעקביות intaining בין הניסויים נדרש כדי להיות מסוגל לערוך השוואה משמעותית בין משכפל. אחד הפרמטרים העיקריים כדי לשמור על עקביות היא צפיפות התאים, כפי שהוא משפיע על שיעור transfection. השגת שיעורי transfection גבוה הנציח N19-OLG בתרביות תאים קשה יותר מאשר עם שורות תאים אחרים נפוצים כגון הלה או HEK293, והיא תלויה מאוד בצפיפות, בתוך הניסיון שלנו 12, 13. היעילות הטובה ביותר שלנו transfection עבור תאים אלה הושגו עם Fugene HD (Roche) והם בדרך כלל על 15%, אך יכול להגיע מעל 30%, בהתאם לבנות את. ספירת תאים זהירות תסייע בהשגת שיעורי transfection עקבי. חשוב גם לחשוף תאים טיפולים שונים באותה מידה של לחץ סביבתי, במיוחד כאשר מדידת שיעורי אפופטוזיס. באופן ספציפי, משך הזמן שבו על התאים נחשפים ריאגנטים transfection, או את כמות החשיפה לאור, יש חשיבות סביבתית Variables לשקול, והוא צריך להישאר קבוע על פני ניסויים. עבור היישומים שלנו, מצאנו כי איסוף מספר גדול של שדות של נוף מספק גודל המדגם גדול מספיק כדי לערוך השוואות משמעותי מבחינה סטטיסטית, [שם].

טבלה של חומרים כימיים מסוימים וציוד <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th></tr><tr><td> NucView 488 ערכת caspase-3 Assay עבור תאים חיים </td><td> Biotium </td><td> 30029 </td></tr><tr><td> FuGENE HD מגיב transfection </td><td> רוש </td><td> 04709705001 </td></tr><tr><td> Dulbecco של הנשר השתנה בינוני </td><td> Gibco </td><td> 31053-028 </td></tr><tr><td> 0.25% טריפסין </td><td> Gibco </td><td> 15050-065 </td></tr><tr><td> סרום שור עוברית </td><td> Gibco </td><td> 12483-020 </td></tr><tr><td> פניצילין / סטרפטומיצין </td><td> Gibco </td><td> 15140122 </td></tr><tr><td> # 1.5-25 מ&quot;מ זכוכית coverslip </td><td> וורנר מכשירים </td><td> 64-0715 </td></tr><tr><td> Chamlide קרינת הרקע הקוסמית מגנטי תרבות קאמרית 25 מ&quot;מ coverslip </td&gt; <td> Quorum טכנולוגיות </td><td> CM-B-40 </td></tr><tr><td> Cellstart בתרבית רקמה 10 מנות ס&quot;מ </td><td> VWR </td><td> 82050-576 </td></tr><tr><td> פלקון 6-BD גם בתרבית רקמה מנות </td><td> VWR </td><td> CA62406-161 </td></tr></table>

monitoring cleaved caspase-3 activity and apoptosis of immortalized oligodendroglial cells using live-cell imaging and cleaveable fluorogenic-dye substrates following potassium-induced membrane depolarization

מערכת העצבים המרכזית יכולים לחוות מספר מדגיש ועלבונות נוירולוגית, אשר יכולות להיות תופעות לוואי רבות, כי בסופו של דבר להוביל לצמצום האוכלוסייה ואת תפקוד עצבי. אקסונים פגומים יכולים לשחרר מולקולות מעוררות כולל אשלגן או גלוטמט לתוך המטריצה ​​תאיים, אשר בתורו, יכול לייצר פגיעה נוספת לפגיעה בתאי גלייה תמיכה כולל האסטרוציטים ו oligodendrocytes 8, 16. אם עלבון נמשכת, התאים יעברו מות תאים מתוכנת (אפופטוזיס), אשר מוסדר והופעל על ידי מספר ומבוססת התמרה מפלי אות 14. אפופטוזיס ונמק ברקמות יכולה להתרחש לאחר פגיעה מוחית טראומטית, איסכמיה מוחית, והתקפים. דוגמה קלאסית של רגולציה אפופטוטיים היא משפחה של ציסטאין תלויי aspartate מכוונת פרוטאזות, או caspases. פרוטאזות הופעל כולל caspases יש גם היה מעורב מוות של תאים בתגובה נוירו כרוניתמחלות ניווניות, כולל אלצהיימר, הנטינגטון, טרשת נפוצה ו - 4, 14, 3, 11, 7. בפרוטוקול זה אנו מתארים את השימוש של המצע 488 caspase-3 NucView למדוד את קצב של אפופטוזיס caspase-3 מתווך הנציח N19-oligodendrocyte (OLG) בתרביות תאים 15, 5, בעקבות החשיפה מדגיש תאיים שונים כגון ריכוזים גבוהים של אשלגן או גלוטמט. תנאי הנציח-N19-OLG קו תאים (המייצג את אבי O2A) התקבל ד&quot;ר אנתוני Campagnoni (UCLA סמל המכון למדעי המוח) 15, 5, כבר השתמשו בעבר כדי ללמוד המנגנונים המולקולריים של ביטוי גנים המיאלין ואת הולכת אותות המובילים כדי OLG בידול (למשל 6, 10). מצאנו את שורות התאים להיות חזקים ביחס transfection עם חלבון המיאלין הבסיסי אקסוגניים (MBP) בונה התמזגו או RFP או GFP (אדום או חלבון הפלואורסצנט הירוק) 13,12. הנה, תרבויות התא N19-OLG טופלו או אשלגן כלוריד 80 מ&quot;מ או 100 סודיום גלוטמט mM לחקות דליפה axonal לתוך המטריצה ​​תאיים כדי לגרום לאפופטוזיס 9. השתמשנו דו פונקציונלי caspase-3 מצע המכיל (ASP-Glu-Val-ASP) DEVD caspase-3 למקטע הכרה ה-DNA מחייבת לצבוע 2. המצע במהירות נכנס הציטופלסמה שם הוא ביקע ידי תאיים caspase-3. לצבוע, NucView 488 הוא שוחרר ונכנס לגרעין התא שבו הוא נקשר דנ&quot;א מאיר ירוק 488 ננומטר, איתות אפופטוזיס. השימוש המצע 488 NucView caspase-3 מאפשר הדמיה לחיות תאים בזמן אמת 1, 10. בסרטון הזה, אנו גם מתארים את culturing ו transfection של תאים N19-OLG הנציח, כמו גם לחיות תאים שיטות הדמיה.

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Cleaved Caspase-3 Activity and Apoptosis of Immortalized Oligodendroglial Cells using Live-cell Imaging and Cleaveable Fluorogenic-dye Substrates F

Monitoring Cleaved Caspase-3 Activity and Apoptosis of Immortalized Oligodendroglial Cells using Live-cell Imaging and Cleaveable Fluorogenic-dye Substrates Following Potassium-induced Membrane Depola

Live-תא הדמיה של אפופטוזיס caspase-3 בתיווך ב-N19 oligodendrocyte תרבויות הנציח התא באמצעות<em&gt; NucView</em&gt; 488 caspase-3 המצע. טכניקה זו חלה על מבחני מוות מתוכנת של תאים בזמן אמת במגוון רחב של סוגי תאים ורקמות.

ביקע ניטור caspase-3 פעילות אפופטוזיס של תאים Oligodendroglial הונצח באמצעות Live-תא הדמיה Cleaveable Fluorogenic-צבע מצעים בעקבות שלילת קוטביות אשלגן-Induced ממברנה

The central nervous system can experience a number of stresses and neurological insults, which can have numerous adverse effects that ultimately lead to a ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Monitoring Cleaved Caspase-3 Activity and Apoptosis of Immortalized Oligodendroglial Cells using Live-cell Imaging and Cleaveable Fluorogenic-dye Substrates Following Potassium-induced Membrane Depolarization

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-תא הדמיה של תאים מבשר חושי האיברים אינטקט תסיסנית גלמים

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

ניתוח כמותי של רענון שלפוחיות Synaptic בריכת ב Cultured נוירונים גרגיר cerebellar באמצעות צבעים FM

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Caspase-3 Activity in the Rat Amygdala Measured by Spectrofluorometry After Myocardial Infarction

Caspase-3 פעילות באמיגדלה העכברוש נמדד על ידי Spectrofluorometry לאחר אוטם שריר הלב

Myocardial infarction (MI) has dramatic mid- and long-term consequences at the physiological and behavioral levels, but the mechanisms involved are still ...

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

הקלטת פעילות עצבית הנגרמת טמפרטורה באמצעות ניטור שינויי סידן נורה חוש הריח של<em&gt; Laevis Xenopus</em

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. ...

Live-cell Measurement of Odorant Receptor Activation Using a Real-time cAMP Assay

לחיות תאים מדידה של Odorant קולטן הפעלה באמצעות Assay המחנה בזמן אמת

The enormous sizes of the mammalian odorant receptor (OR) families present difficulties to find their cognate ligands among numerous volatile chemicals. ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

הדמיה פעילות עצבית בתוך קליפת המגע הראשי באמצעות Thy1-העכברים הטרנסגניים GCaMP6s

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Analyzing Neural Activity and Connectivity Using Intracranial EEG Data with SPM Software

ניתוח פעילות עצבית וקישוריות באמצעות נתוני EEG תוך-גולגולתי בתוכנה SPM

Measuring neural activity and connectivity associated with cognitive functions at high spatial and temporal resolutions is an important goal in cognitive ...

ROS Live Cell Imaging During Neuronal Development

ROS הדמיית תאים חיים במהלך התפתחות עצבית

Reactive oxygen species (ROS) are well-established signaling molecules, which are important in normal development, homeostasis, and physiology. Among the ...

Simultaneous Imaging of Microglial Dynamics and Neuronal Activity in Awake Mice

הדמיה סימולטנית של דינמיקה מיקרוגליאלית ופעילות עצבית בעכברים ערים

Since brain functions are under the continuous influence of the signals derived from peripheral tissues, it is critical to elucidate how glial cells in ...

Microfluidics-Assisted Selective Depolarization of Axonal Mitochondria

דה-פולריזציה סלקטיבית בסיוע מיקרופלואידיקה של מיטוכונדריה אקסונאלית

Mitochondria are the primary suppliers of ATP (adenosine triphosphate) in neurons. Mitochondrial dysfunction is a common phenotype in many ...