Name: monitoring cleaved caspase-3 activity and apoptosis of immortalized oligodendroglial cells using live-cell imaging and cleaveable fluorogenic-dye substrates following potassium-induced membrane depolarization
Uploaded: 2012-01-13T13:00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Cleaved Caspase-3 Activity and Apoptosis of Immortalized Oligodendroglial Cells using Live-cell Imaging and Cleaveable Fluorogenic-dye Substrates F

इस प्रयोगशाला में कनाडा के स्वास्थ्य अनुसंधान संस्थान, प्राकृतिक विज्ञान और कनाडा के इंजीनियरिंग रिसर्च काउंसिल, और कनाडा (MSSC) के मल्टीपल स्केलेरोसिस सोसायटी द्वारा समर्थित किया गया है. GSTS MSSC से डॉक्टरेट छात्रावस्था के प्राप्तकर्ता था. हम इस पांडुलिपि पर कई उपयोगी और चर्चा टिप्पणियों के लिए डॉ. Joan Boggs (अस्पताल बीमार बच्चे, टोरंटो के लिए) के लिए आभारी हैं. हम उनके उदार उपहार के लिए अतिरिक्त 488 NucView कस्पासे-3 Biotium के लिए आभारी हैं .

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	<li>Antczak, C., Takagi, T., Ramirez, C. N., Radu, C., Djaballah, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+imaging+of+caspase+activation+for+high-content+screening.">Live-cell imaging of caspase activation for high-content screening.</a> J. Biomol. Screen. 14, 956-969 (2009).</li><li>Cen, H., Mao, F., Aronchik, I., Fuentes, R. J., Firestone, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DEVD-NucView488:+a+novel+class+of+enzyme+substrates+for+real-time+detection+of+caspase-3+activity+in+live+cells.">DEVD-NucView488: a novel class of enzyme substrates for real-time detection of caspase-3 activity in live cells.</a> FASEB. J. 22, 2243-2252 (2008).</li><li>de Calignon, A., Fox, L. M., Pitstick, R., Carlson, G. A., Bacskai, B. J., Spires-Jones, T. L., Hyman, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase+activation+precedes+and+leads+to+tangles.">Caspase activation precedes and leads to tangles.</a> Nature. 464, 1201-1204 (2010).</li><li>Eldadah, B. A., Faden, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase+pathways,+neuronal+apoptosis,+and+CNS+injury.">Caspase pathways, neuronal apoptosis, and CNS injury.</a> J. Neurotrauma. 17, 811-829 (2000).</li><li>Foster, L. M., Phan, T., Verity, A. N., Bredesen, D., Campagnoni, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+analysis+of+normal+and+shiverer+temperature-sensitive+immortalized+cell+lines+exhibiting+phenotypic+characteristics+of+oligodendrocytes+at+several+stages+of+differentiation.">Generation and analysis of normal and shiverer temperature-sensitive immortalized cell lines exhibiting phenotypic characteristics of oligodendrocytes at several stages of differentiation.</a> Dev. Neurosci. 15, 100-109 (1993).</li><li>Fulton, D., Paez, P. M., Fisher, R., Handley, V., Colwell, C. S., Campagnoni, A. 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Res. 46, 387-397 (2003).</li><li>Lau, A., Tymianski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+receptors,+neurotoxicity+and+neurodegeneration.">Glutamate receptors, neurotoxicity and neurodegeneration.</a> Pflugers. Arch. 460, 525-542 (2010).</li><li>Lawrence, M. S., Ho, D. Y., Sun, G. H., Steinberg, G. K., Sapolsky, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+Bcl-2+with+herpes+simplex+virus+vectors+protects+CNS+neurons+against+neurological+insults+in+vitro+and+in+vivo.">Overexpression of Bcl-2 with herpes simplex virus vectors protects CNS neurons against neurological insults in vitro and in vivo.</a> J. Neurosci. 16, 486-496 (1996).</li><li>Paez, P. M., Spreuer, V., Handley, V., Feng, J. M., Campagnoni, C., Campagnoni, A. 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M., Harauz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proline+substitutions+and+threonine+pseudo-phosphorylation+of+the+SH3-ligand+of+18.5+kDa+myelin+basic+protein+decrease+affinity+for+the+Fyn-SH3-domain+and+alter+process+development+and+protein+localization+in+oligodendrocytes.">Proline substitutions and threonine pseudo-phosphorylation of the SH3-ligand of 18.5 kDa myelin basic protein decrease affinity for the Fyn-SH3-domain and alter process development and protein localization in oligodendrocytes.</a> J. Neurosci. Res. , (2011).</li><li>Smith, G. S. T., Paez, P. M., Spreuer, V., Campagnoni, C. W., Boggs, J. M., Campagnoni, A. T., Harauz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classical+18.5-and+21.5-kDa+isoforms+of+myelin+basic+protein+inhibit+calcium+influx+into+oligodendroglial+cells,+in+contrast+to+golli+isoforms.">Classical 18.5-and 21.5-kDa isoforms of myelin basic protein inhibit calcium influx into oligodendroglial cells, in contrast to golli isoforms.</a> J. Neurosci. Res. 89, 467-480 (2011).</li><li>Springer, J. E., Azbill, R. D., Knapp, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+caspase-3+apoptotic+cascade+in+traumatic+spinal+cord+injury.">Activation of the caspase-3 apoptotic cascade in traumatic spinal cord injury.</a> Nat. Med. 5, 943-946 (1999).</li><li>Verity, A. N., Bredesen, D., Vonderscher, C., Handley, V. W., Campagnoni, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+myelin+protein+genes+and+other+myelin+components+in+an+oligodendrocytic+cell+line+conditionally+immortalized+with+a+temperature-sensitive+retrovirus.">Expression of myelin protein genes and other myelin components in an oligodendrocytic cell line conditionally immortalized with a temperature-sensitive retrovirus.</a> J. Neurochem. 60, 577-587 (1993).</li><li>Yu, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+critical+role+of+potassium+homeostasis+in+apoptosis.">Regulation and critical role of potassium homeostasis in apoptosis.</a> Prog. Neurobiol. 70, 363-386 (2003).</li></ol>

लेखक ब्याज की कोई संघर्ष करने के लिए खुलासा किया है.

हालांकि यह केवल fluorogenic apoptosis का पता लगाने के लिए उत्पाद उपलब्ध नहीं है, वहाँ NucView 488 सब्सट्रेट का उपयोग करने के लिए कई महत्वपूर्ण लाभ कर रहे हैं. एक मुख्य लाभ की क्षमता वास्तविक समय में जीवित कोशिकाओं में apoptosis का पालन करें, जबकि सबसे वैकल्पिक उत्पादों या तो सेल lysis की आवश्यकता होती है या गरीब सेल पारगम्यता है है. अन्य लाभों में मान्यता कस्पासे-3, उच्च सेल पारगम्यता, कम cytotoxicity, और apoptosis की प्रगति के साथ कोई हस्तक्षेप के लिए उच्च संवेदनशीलता शामिल हैं. सब्सट्रेट भी कम पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति है जब तक यह cleaved है और नाभिक, जो पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति समाप्त प्रवेश करती है. कस्पासे-3 मान्यता अनुक्रम 3 नकारात्मक आरोप शामिल है और डीएनए बाध्यकारी डाई एक सकारात्मक चार्ज 2 है. DEVD - NucView 488 अणु इस प्रकार एक शुद्ध नकारात्मक चार्ज है, जो कोशिकाओं जहाँ कस्पासे सक्रिय नहीं है में डीएनए के लिए सक्रियण और डाई के बाध्यकारी रोकता है. माप्रयोगों के बीच intaining स्थिरता प्रतिकृति के बीच सार्थक तुलना आकर्षित करने में सक्षम होना आवश्यक है. मुख्य मापदंडों के अनुरूप रखने के एक सेल घनत्व है, क्योंकि यह अभिकर्मक की दर को प्रभावित करता है. में उच्च अभिकर्मक दर प्राप्त करने के अमर N19 सेल संस्कृतियों OLG HeLa या HEK293 जैसे अन्य आम सेल लाइनों के साथ की तुलना में अधिक मुश्किल है, और हमारे अनुभव 12, 13 में उच्च घनत्व पर निर्भर है. इन कोशिकाओं के लिए हमारी सबसे अच्छी अभिकर्मक क्षमता Fugene HD (Roche) के साथ प्राप्त किया गया है और सामान्य रूप के बारे में 15% कर रहे हैं, लेकिन 30% से अधिक का निर्माण पर निर्भर करता है तक पहुँच सकते हैं. सावधानी से सेल गिनती अनुरूप अभिकर्मक दरों प्राप्त करने में सहायता करेगा. यह भी महत्वपूर्ण है पर्यावरण तनाव का एक ही डिग्री करने के लिए विभिन्न उपचार से कोशिकाओं को बेनकाब करने के लिए, खासकर जब apoptosis की दर को मापने. विशेष रूप से, समय की लंबाई, जिस पर कोशिकाओं अभिकर्मक अभिकर्मकों, या प्रकाश जोखिम की राशि को उजागर कर रहे हैं महत्वपूर्ण पर्यावरणीय variables विचार करना है, और प्रयोगों भर में स्थिर रहना चाहिए. हमारे अनुप्रयोगों के लिए, हमने पाया है कि क्षेत्रों के देखने की एक बड़ी संख्या में एकत्रित सांख्यिकीय महत्वपूर्ण तुलना करने के लिए एक पर्याप्त बड़ी नमूना आकार प्रदान करने के लिए [ इबिद]

विशिष्ट अभिकर्मकों और उपकरणों की तालिका <table border="1"><tr><th> अभिकर्मक के नाम </th><th> कंपनी </th><th> सूचीपत्र संख्या </th></tr><tr><td> NucView 488 जीवित कोशिकाओं के लिए कस्पासे-3 परख किट </td><td> Biotium </td><td> 30029 </td></tr><tr><td> FuGENE एच.डी. अभिकर्मक अभिकर्मक </td><td> रॉश </td><td> 04709705001 </td></tr><tr><td> Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम </td><td> Gibco </td><td> 31053-028 </td></tr><tr><td> 0.25% trypsin </td><td> Gibco </td><td> 15050-065 </td></tr><tr><td> भ्रूण गोजातीय सीरम </td><td> Gibco </td><td> 12483-020 </td></tr><tr><td> पेनिसिलीन / स्ट्रेप्टोमाइसिन </td><td> Gibco </td><td> 15140122 </td></tr><tr><td> # मिमी कांच coverslip 1.5-25 </td><td> वार्नर उपकरण </td><td> 64-0715 </td></tr><tr><td> Chamlide CMB चुंबकीय 25 मिमी के लिए संस्कृति कक्ष coverslip </td&gt; <td> कोरम टेक्नोलॉजीज </td><td> मुख्यमंत्री-B-40 </td></tr><tr><td> Cellstart ऊतक 10 सेमी व्यंजन संस्कृति </td><td> VWR </td><td> 82050-576 </td></tr><tr><td> बी.डी. फाल्कन छह अच्छी तरह से टिशू कल्चर व्यंजन </td><td> VWR </td><td> CA62406-161 </td></tr></table>

monitoring cleaved caspase-3 activity and apoptosis of immortalized oligodendroglial cells using live-cell imaging and cleaveable fluorogenic-dye substrates following potassium-induced membrane depolarization

The central nervous system can experience a number of stresses and neurological insults, which can have numerous adverse effects that ultimately lead to a reduction in neuronal population and function. Damaged axons can release excitatory molecules including potassium or glutamate into the extracellular matrix, which in turn, can produce further insult and injury to the supporting glial cells including astrocytes and oligodendrocytes 8, 16. If the insult persists, cells will undergo programmed cell death (apoptosis), which is regulated and activated by a number of well-established signal transduction cascades 14. Apoptosis and tissue necrosis can occur after traumatic brain injury, cerebral ischemia, and seizures. A classical example of apoptotic regulation is the family of cysteine-dependent aspartate-directed proteases, or caspases. Activated proteases including caspases have also been implicated in cell death in response to chronic neurodegenerative diseases including Alzheimer's, Huntington's, and Multiple Sclerosis 4, 14, 3, 11, 7.
In this protocol we describe the use of the NucView 488 caspase-3 substrate to measure the rate of caspase-3 mediated apoptosis in immortalized N19-oligodendrocyte (OLG) cell cultures 15, 5, following exposure to different extracellular stresses such as high concentrations of potassium or glutamate. The conditionally-immortalized N19-OLG cell line (representing the O2A progenitor) was obtained from Dr. Anthony Campagnoni (UCLA Semel Institute for Neuroscience) 15, 5, and has been previously used to study molecular mechanisms of myelin gene expression and signal transduction leading to OLG differentiation (e.g.6, 10). We have found this cell line to be robust with respect to transfection with exogenous myelin basic protein (MBP) constructs fused to either RFP or GFP (red or green fluorescent protein) 13, 12. Here, the N19-OLG cell cultures were treated with either 80 mM potassium chloride or 100 mM sodium glutamate to mimic axonal leakage into the extracellular matrix to induce apoptosis 9. We used a bi-functional caspase-3 substrate containing a DEVD (Asp-Glu-Val-Asp) caspase-3 recognition subunit and a DNA-binding dye 2. The substrate quickly enters the cytoplasm where it is cleaved by intracellular caspase-3. The dye, NucView 488 is released and enters the cell nucleus where it binds DNA and fluoresces green at 488 nm, signaling apoptosis. Use of the NucView 488 caspase-3 substrate allows for live-cell imaging in real-time 1, 10. In this video, we also describe the culturing and transfection of immortalized N19-OLG cells, as well as live-cell imaging techniques.

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Monitoring Cleaved Caspase-3 Activity and Apoptosis of Immortalized Oligodendroglial Cells using Live-cell Imaging and Cleaveable Fluorogenic-dye Substrates Following Potassium-induced Membrane Depola

कस्पासे-3 अमर N19-oligodendrocyte सेल संस्कृतियों में मध्यस्थता apoptosis की लाइव सेल इमेजिंग का उपयोग<em&gt; NucView</em&gt; 488 कस्पासे 3 सब्सट्रेट. इस तकनीक क्रमादेशित कोशिका मृत्यु assays के लिए वास्तविक समय में सेल प्रकार और ऊतकों की एक किस्म में लागू है.

निगरानी Cleaved गतिविधि कस्पासे 3 और अमर Oligodendroglial पोटेशियम प्रेरित झिल्ली विध्रुवण के बाद लाइव सेल इमेजिंग और Cleaveable Fluorogenic डाई Substrates का उपयोग कर कक्ष के Apoptosis

The central nervous system can experience a number of stresses and neurological insults, which can have numerous adverse effects that ultimately lead to a ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Monitoring Cleaved Caspase-3 Activity and Apoptosis of Immortalized Oligodendroglial Cells using Live-cell Imaging and Cleaveable Fluorogenic-dye Substrates Following Potassium-induced Membrane Depolarization

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

संवेदी अंग अग्रदूत साबित कोशिकाओं के बरकरार में लाइव सेल इमेजिंग ड्रोसोफिला Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

संवर्धित अनुमस्तिष्क ग्रेन्युल न्यूरॉन्स एफएम रंगों का उपयोग करने में Synaptic पुटिका पूल पुनःपूर्ति के मात्रात्मक विश्लेषण

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Caspase-3 Activity in the Rat Amygdala Measured by Spectrofluorometry After Myocardial Infarction

रोधगलन के बाद Spectrofluorometry द्वारा मापा चूहा प्रमस्तिष्कखंड में कस्पासे 3 गतिविधि

Myocardial infarction (MI) has dramatic mid- and long-term consequences at the physiological and behavioral levels, but the mechanisms involved are still ...

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

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की घ्राण बल्ब में कैल्शियम परिवर्तन की निगरानी के माध्यम से रिकॉर्डिंग तापमान प्रेरित neuronal गतिविधि<em&gt; Xenopus laevis</em

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. ...

Live-cell Measurement of Odorant Receptor Activation Using a Real-time cAMP Assay

लाइव-एक वास्तविक समय शिविर परख का उपयोग कर गंध रिसेप्टर सक्रियण के सेल माप

The enormous sizes of the mammalian odorant receptor (OR) families present difficulties to find their cognate ligands among numerous volatile chemicals. ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

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The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

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Reactive oxygen species (ROS) are well-established signaling molecules, which are important in normal development, homeostasis, and physiology. Among the ...

Simultaneous Imaging of Microglial Dynamics and Neuronal Activity in Awake Mice

जागृत चूहों में माइक्रोग्लियल डायनामिक्स और न्यूरोनल गतिविधि की एक साथ इमेजिंग

Since brain functions are under the continuous influence of the signals derived from peripheral tissues, it is critical to elucidate how glial cells in ...

Microfluidics-Assisted Selective Depolarization of Axonal Mitochondria

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Mitochondria are the primary suppliers of ATP (adenosine triphosphate) in neurons. Mitochondrial dysfunction is a common phenotype in many ...