Name: in vivo electroporation of morpholinos into the regenerating adult zebrafish tail fin
Uploaded: 2012-03-29T12:00:00
Duration: 7 min 22 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin at JoVE.com

Forfatterne vil gerne takke Freimann Life Science Center og Center for Zebrafisk Forskning personale til deres pleje og vedligeholdelse af zebrafisk.

1. Resuspender Morpholino <ol><li> Fortynd 300 nM fluorescein-mærket morpholino i 100 ul nuklease-frit vand til fremstilling af en tilnærmelsesvis 3 mM opløsning. Den morpholino Opløsningen alikvoteres i flere paraffin-forseglet mikrocentrifugerør og opbevaret ved stuetemperatur og beskyttet mod lys. </li><li> At bestemme den nøjagtige morpholino koncentration, fortyndet 5 ul morpholino opløsning (eller vand som blindprøve) i 95 pi af 0,1 N HCI. Indstil en baseline på et spektrofotometer ved 265 nm med vand tomt, og derefter afgøre, læsning af den fortyndede morpholinogruppe løsning. Multiplicer morpholino absorbansen ved sin bestemt konstant og med fortyndingsfaktoren for at bestemme koncentrationen i ng / ul. Den morpholino konstante beregnes som: Morpholino konstant = molekylvægt af morpholino X 1000/molar absorbans. Molekylvægt og molær absorbans for morpholino kan findes på &quot;Oligo Properties &quot;plade forsynet med produktet. Fordel morpholino koncentrationen i ng / ul af molekylvægten for at bestemme koncentrationen i mM. Fortyndes morpholino, om nødvendigt, til en arbejdskoncentration, typisk 1,2 mM. </li></ol> 2. Fin Amputation <ol><li> Bedøve voksen zebrafisk i enten Tricaine eller 2-phenoxyethanol ved 1,0 mg / ml i tanken vand. </li><li> Amputere finnen hjælp af en steril skalpel eller barberblad proximalt til den første lepidotrichial forgreningspunktet. Dette bør gøres på samme proksimale / distale placering på hvert enkelt dyr (f.eks 7 knoklet segmenter distalt fra finnen bælte). VIGTIGT: sørg for at skære perfekt vinkelret på det forreste / bageste plan dyret. Vinkelsnit vil resultere i ujævn fin udvækst af de dorsale og ventrale halvdele af finne. </li><li> Tilbage fisken til en tank. Vi typisk bibeholde fisken ved 33 ° C for at forøge regenereringen. Afhængig af den eksperimentelle design, wAIT 0-2 dage efter amputation (DPA) for fin regenerering at begynde, før indføre morpholino. Alternative tilgange diskuteres i diskussionen, nedenfor. </li></ol> 3. Morpholino Injection <ol><li> Dagen før injektion af morpholino, at en injektion plade (figur 2). Sørg for at skære en rille i den ene ende af brønden, hvilket hjælper med at stabilisere fisk til mikroinjektion procedure. </li><li> Ved 2 DPA, forberede mikroinjektion apparater og morfolino løsning. </li><li> Fortynd fluorescein-mærkede morpholino til den korrekte koncentration (anbefaler at starte med 1,2 mM) og anbringes i en 65 ° C vandbad i 5 minutter. </li><li> Træk glasset nål til mikro-injektion med en nål aftrækker. </li><li> Læg nålen med morfolino (bemærk: afhængigt af om du back-fill eller front indlæse nålen vil afgøre, om du lægger nålen først, eller klippe spidsen først). </li><li> Skære spidsen af ​​nålen i enn vinkel. </li><li> Følg anvisningerne i din mikro-indsprøjtningssystem til at indsprøjte en ca 5 nl boble af morpholinogruppe per injektion. Større mængder morpholino forstyrre væv. </li><li> Bedøve fisk og sted ved injektion plade. Fjerne alt overskydende væske og orientere nålen til den rette position, lige distalt for knoglens stråle (figur 3). Anvendelse af et mikroskop og mikroinjektion apparat egnet til morpholino injektioner (se tabel af specifikke reagenser), injiceres morpholino i finnen fra anterior til posterior som vist i figur 3. Injektion fra posterior til anterior forårsager finnen vævet til at rulle op under injektion og er meget vanskelig. </li><li> Stik nålen forsigtigt i regenerativ vævet, lige distalt for hver knoklet ray (mærket &quot;1&quot; i figur 3) og skub distalt indtil beliggende i blastema (mærket &quot;2&quot; i figur 3). Vær forsigtig med ikke at presse nålen gennem endæk fin. Når nålen er korrekt lokaliseret, injicere morpholino (dvs. klik på en gang). På 1,2 mM, vises fluorescein-mærkede morpholino opløsning gul-grønt, selv under normale lysforhold. Med hver injektion, kan en gul &quot;pust&quot; af morpholino opløsning visualiseres, som hjælper lokalisere injektion til blastema. Ca. 75 NL (10-15 klik) af morpholinogruppe opløsning skal injiceres pr knoklet ray. Pause ~ 1 sek mellem klik. Vi har kun injicere dorsale side ved hjælp af ventrale som elektroporation-kun kontrol. Alternativt kan man gentage hele denne fremgangsmåde ved hjælp af en styring morpholino på den ventrale halvdel af finnen. </li></ol> 4. Elektroporering af Morpholino <ol><li> Umiddelbart efter injektion af morpholino, fjernes injektionen pladen fra mikro-injektionsapparatet. Fyld injektion pladen godt med anæstesi opløsningen indtil fisken er neddykket. Den elektroporering udføres under vandlinien. </li> &lt;li&gt; En 3 mm diameter platinplade pincetten elektrode (CUY 650-P3 pincet, Protech International) lokaliserer impulserne til omtrent halvdelen af ​​finnen. Pas på ikke at røre ved de elektroder til fin vævet. For at sikre, at elektroderne ikke rører fin vævet, rotere fisken på rygsiden og kigge lige ned midterlinjen for elektroporation. </li><li> Elektroporere både dorsale og ventrale (kontrol for en ikke-specifik elektroporation virkninger) sider af finnen ved hjælp af en CUY21 firkantbølge elektroporator (Protech International, Inc.). Tør elektroderne med en fugtig Kimwipe efter hver elektroporering for at fjerne eventuelle bobler, der kan være dannet. Hvis de ikke fjernes, en mini-afgift bygger op, hvilket vil tiltrække vævet mod elektroden. De elektroporation parametre skal indstilles til ti på hinanden følgende 50 msek impulser, ved 15 V med en 1 sekund pause mellem impulserne. </li><li> Læg fisken på et objektglas eller en petriskål og hurtigt billede finnen, og sørg for at nOTE den dorsale / ventrale orientering. Dette billede vil blive brugt til genvækst analyse den følgende dag. Retur fiskene til tanken. </li></ol> 5. Analyse <ol><li> Hvis målrettet protein, blev slået ned i ekspression er nødvendig for korrekt finner regenerering, bør en dramatisk forskel mellem de dorsale og ventrale halvdele af finnen være indlysende 1 dag efter elektroporering (figur 5B). </li><li> Ved 3 DPA, tage et billede af fin for hver fisk, og matche op dette billede med den tilsvarende 2 DPA billede (fig. 5B). Den naturlige variation i fin pigmentering mønster mellem dyr vil give dig mulighed for korrekt at identificere de enkelte fisk. </li><li> Ved hjælp af NIH Image spore 2 DPA og 3 dPa områder af både dorsale og ventrale halvdele (figur 5B). </li><li> For at bestemme% areal af dorsal versus ventral brug af følgende formel: (Dorsal 3dpa - Dorsal 2dpa) / (Ventral 3dpa -<html> Ventrale 2dpa) X 100 =% areal </li></ol> 6. Repræsentative resultater <ol><li> Vi har altid analyse for fin udvækst på 3 DPA, eller 24 HPE (timer efter elektroporation). På dette tidspunkt bør fluorescein-mærkede morpholino være til stede i den dorsale halvdel af finnen (Supplerende figur 1 og figur 6A). Det er normalt at se nogle slør ned til niveauet for amputation. </li><li> Der bør ikke være nogen forskel mellem de dorsale og ventrale sider i finnens injiceres og elektroporeret med kontrollen morpholinos (figur 6B). </li><li> Hvis den eksperimentelle morpholino målretter et essentielt protein for finner udvækst, bør en dramatisk forskel mellem de dorsale og ventrale side observeres (figur 6C). </li><li> Hvis elektroden rørt finnen under elektroporering, vil vævet vises brune (næsten brændt i udseende) og nekrotisk. </li></ol>&quot;Src =&quot; / files/ftp_upload/3632/3632fig1.jpg &quot;/&gt; Figur 1. Skematisk af de forskellige begivenheder, der opstår under fin regenerering. De underliggende gange for hver hændelse er angivet i timer efter amputation (hPa), og svarer til en tank temperatur på 33 ° C. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/3632/3632fig2.jpg" /> Figur 2. A. Skematisk af injektionen plade, som er fremstillet af agarose og indeholder en lille brønd til at holde fiskene i mikroinjektion af morpholino. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/3632/3632fig3.jpg" /> Figur 3. Skematisk af morpholinogruppe mikroinjektion. A. Læg fisken i skålen med hovedet af fisken i hak klippet ud af brønden, som vil hjælpe fiskene forbliver stabile. B. Ved lav forstørrelse, arrangere nålen, således at det er tæt på den regenererende væv af finnen. C. </strong&gt; Ved højere forstørrelse, injicere morfolino distale til hver knoklede fin stråle (dvs. i hvert blastema). Nålen bør træde vævet lige distalt for knoklede ray (1), og derefter fortsætte med at placeringen af ​​blastema (2). Bemærk: de grønne cirkler i diagrammet er kun beregnet til at vise placeringen af ​​injektionen. Den morpholino kan kort kan visualiseres som en grøn / gul &quot;pust&quot; efter hver injektion, men dette ikke fortsætter som vist i diagrammet. <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/3632/3632fig4.jpg" /> Figur 4. Skematisk af fin elektroporation. A. Efter mikroinjektion, skal du placere fisk i en petriskål fuld af anæstesi og elektroporere både dorsale og ventrale halvdele. B. Sørg for at ikke røre fin vævet. Elektroder skal placeres ~ 1 mm fra vævet. <img alt="Figur 5" src="/files/ftp_upload/3632/3632fig5.jpg" /> <strong&gt; Figur 5. Skematisk af de metoder, der anvendes til at beregne fin udgroning hæmning. A. Tag et billede af finnen af hver fisk på 2 DPA, enten umiddelbart før eller efter morpholino injektion og elektroporation. Spore regenerative væv af både dorsale (grøn) og ventrale (blå) halvdele af finnen med NIH Image, (sorte stiplede linjer). B. Ved 3 dpa, tage et billede af hver finne og igen spore de dorsale og ventrale områder af genvækst ved hjælp NIH Image. C. Fratræk området genvækst ved 2 DPA fra den totale genvækst på 3 DPA for både dorsale og ventrale haves. Procentdelen området af dorsal versus ventrale genvækst kan beregnes ved hjælp af formlen: ((D 3dpa - D2 DPA) / (V 3dpa - V 2dpa)) X 100. Procent hæmning = 100 - Procent-området. <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/3632/3632fig6.jpg" /> Figur 6. Eksempler på forventesresultater. A. Fluorescerende billede, der viser en fluorescein-mærket kontrol morpholino i den dorsale halvdel af finnen, 24 timer efter elektroporering (HPE). B. brightfield billede af en fin, der blev injiceret, og elektroporeret med en kontrol morpholino i den dorsale halv . Billedet viser ens genvækst af både dorsale og ventrale halvdele af en fin, 24 HPE. C. brightfield billede af en fin, der blev injiceret, og elektroporeret med en eksperimentel morpholino i den dorsale halvdel. Billedet viser inhibering af genvækst på den dorsale / injicerede side. Linien viser mængden af ​​genvækst ved 2 DPA, umiddelbart før morpholino injektion og elektroporation. <img alt="Figur 7" src="/files/ftp_upload/3632/3632fig7.jpg" /> Figur 7. Skematisk af en alternativ injektion og elektroporation procedure til målproteiner er involveret i sårheling og blastema formationen. A. injiceres morpholinomellem hver knogle finne stråle på den dorsale halvdel af finnen. B. elektroporere den morpholino som normalt. C. amputere finnen umiddelbart proximalt (~ 1 benet segment) på injektionsstedet. D. fluorescein-mærkede morpholino kan observeres i såret epitel og blastema ved 24 HPE. <img alt="Figur 8" src="/files/ftp_upload/3632/3632fig8.jpg" /> Figur 8. Anvendelse af teknikken til at målrette såret epitel og blastema formationen. A. brightfield billede af en fin på 24 hPa der blev injiceret, og elektroporeret med en kontrol morpholino umiddelbart før amputation. B. Fluorescerende billede af fin vist i panel A. Bemærk at den injicerede dorsale halvdel af finnen viser god optagelse af morpholinogruppe i regenerativ væv. C -. C &quot;Højere forstørrelse af den dorsale halvdel af finnen er vist i panelerne A og B. De injektionssteder er ofte stadig synlige (pilespidser), Men mange målrettede celler har migreret til at deltage i såret epitel og blastema formation (pil). <img alt="Figur 9" src="/files/ftp_upload/3632/3632fig9.jpg" /> Figur 9. Anvendelse af teknikken til at målrette celler, der migrerer til dannelse af blastema. A. Fluorescerende og brightfield indeniliggende billeder, der viser en fin injiceret og elektroporeret med morpholino på både dorsale og ventrale halvdele. Finnen blev derefter amputeret på to planer. Den dorsale halv blev skåret umiddelbart distalt for injektionsstedet, hvor som den ventrale halv blev skåret 9-10 knoklet segmenter distalt for injektionsstedet. B. Ved 24 hPa, de fluorescerende og lysfelt indeniliggende billeder viser, at morfolino har migreret til det dorsale regenerere (1), men ikke den ventrale regeneratet (2), hvilket indikerer, at kun den celle umiddelbart proximalt til kløvningspunkt deltage i blastema formation. De to sæt hvide pile viser niveauet for hver amputationplan. Paneler mærket 1 og 2 på den yderste højre i billedet viser en højere forstørrelse af de dorsale og ventrale halvdele af finnen, hhv. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3632/Suppl_Fig1_JoVE.mov">Supplerende Figur 1.</a> en video af en konfokal z-stabel af en region, der svarer til placeringen af en blastema i en fin injiceres og elektroporeret med en kontrol morpholino. Billedet blev taget ved 24 HPE. Idet et enkelt fluorescein molekyle ikke kan visualiseres, kan ikke alle morpholino visualiseres eller kvantificeres. Men disse billeder giver et indtryk af de forskellige grader af optagelse, der kan visualiseres i cellerne, fra individuelle punktformig prikker, til hele celler fyldt med fluorescerende morpholino. På stillbillede, er orienteringen vist. Målestokken: 25 mikrometer.

<ol>
	<li>Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+the+heart+of+regeneration+in+zebrafish.">Getting to the heart of regeneration in zebrafish.</a> Semin. Cell Dev. Biol. 18, 36-45 (2007).</li><li>Vihtelic, T. S., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+rod+and+cone+cell+death+and+regeneration+in+the+adult+albino+zebrafish+(Danio+rerio)+retina.">Light-induced rod and cone cell death and regeneration in the adult albino zebrafish (Danio rerio) retina.</a> J. Neurobiol. 44, 289-307 (2000).</li><li>Becker, T., Wullimann, M. F., Becker, C. G., Bernhardt, R. R., Schachner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+regrowth+after+spinal+cord+transection+in+adult+zebrafish.">Axonal regrowth after spinal cord transection in adult zebrafish.</a> J. Comp. Neurol. 377, 577-595 (1997).</li><li>Becker, C. G., Becker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repellent+guidance+of+regenerating+optic+axons+by+chondroitin+sulfate+glycosaminoglycans+in+zebrafish.">Repellent guidance of regenerating optic axons by chondroitin sulfate glycosaminoglycans in zebrafish.</a> J. Neurosci. 22, 842-853 (2002).</li><li>Lopez-Schier, H., Hudspeth, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+two-step+mechanism+underlies+the+planar+polarization+of+regenerating+sensory+hair+cells.">A two-step mechanism underlies the planar polarization of regenerating sensory hair cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 18615-1820 (2006).</li><li>Johnson, S. L., Weston, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature-sensitive+mutations+that+cause+stage-specific+defects+in+Zebrafish+fin+regeneration.">Temperature-sensitive mutations that cause stage-specific defects in Zebrafish fin regeneration.</a> Genetics. 141, 1583-1595 (1995).</li><li>Nechiporuk, A., Poss, K. D., Johnson, S. L., Keating, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positional+cloning+of+a+temperature-sensitive+mutant+emmental+reveals+a+role+for+sly1+during+cell+proliferation+in+zebrafish+fin+regeneration.">Positional cloning of a temperature-sensitive mutant emmental reveals a role for sly1 during cell proliferation in zebrafish fin regeneration.</a> Dev. Biol. 258, 291-306 (2003).</li><li>Tu, S., Johnson, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+restriction+in+the+growing+and+regenerating+zebrafish+fin.">Fate restriction in the growing and regenerating zebrafish fin.</a> Dev. Cell. 20, 725-732 (2011).</li><li>Geraudie, J., Ferretti, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+between+RA-induced+apoptosis+and+patterning+defects+in+regenerating+fins+and+limbs.">Correlation between RA-induced apoptosis and patterning defects in regenerating fins and limbs.</a> Int. J. Dev. Biol. 41, 529-532 (1997).</li><li>Jazwinska, A., Badakov, R., Keating, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activin-betaA+signaling+is+required+for+zebrafish+fin+regeneration.">Activin-betaA signaling is required for zebrafish fin regeneration.</a> Curr. Biol. 17, 1390-1395 (2007).</li><li>Laforest, L., Brown, C. W., Poleo, G., Geraudie, J., Tada, M., Ekker, M., Akimenko, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+the+sonic+hedgehog,+patched+1+and+bmp2+genes+in+patterning+of+the+zebrafish+dermal+fin+rays.">Involvement of the sonic hedgehog, patched 1 and bmp2 genes in patterning of the zebrafish dermal fin rays.</a> Development. 125, 4175-4178 (1998).</li><li>Lee, Y., Grill, S., Sanchez, A., Murphy-Ryan, M., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fgf+signaling+instructs+position-dependent+growth+rate+during+zebrafish+fin+regeneration.">Fgf signaling instructs position-dependent growth rate during zebrafish fin regeneration.</a> Development. 132, 5173-5183 (2005).</li><li>Poss, K. D., Shen, J., Nechiporuk, A., McMahon, G., Thisse, B., Thisse, C., Keating, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+for+Fgf+signaling+during+zebrafish+fin+regeneration.">Roles for Fgf signaling during zebrafish fin regeneration.</a> Dev. Biol. 222, 347-358 (2000).</li><li>Raya, A., Koth, C. M., Buscher, D., Kawakami, Y., Itoh, T., Raya, R. M., Sternik, G., Tsai, H. J., Rodriguez-Esteban, C., Izpisua-Belmonte, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+Notch+signaling+pathway+precedes+heart+regeneration+in+zebrafish.">Activation of Notch signaling pathway precedes heart regeneration in zebrafish.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 11889-11895 (2003).</li><li>Smith, A., Avaron, F., Guay, D., Padhi, B. K., Akimenko, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+BMP+signaling+during+zebrafish+fin+regeneration+disrupts+fin+growth+and+scleroblasts+differentiation+and+function.">Inhibition of BMP signaling during zebrafish fin regeneration disrupts fin growth and scleroblasts differentiation and function.</a> Dev Biol. 299, 438-454 (2006).</li><li>Thummel, R., Li, L., Tanase, C., Sarras, M. P., Godwin, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+expression+pattern+and+function+between+zebrafish+hoxc13+orthologs:+recruitment+of+Hoxc13b+into+an+early+embryonic+role.">Differences in expression pattern and function between zebrafish hoxc13 orthologs: recruitment of Hoxc13b into an early embryonic role.</a> Dev. Biol. 274, 318-333 (2004).</li><li>Coonrod, S. A., Bolling, L. C., Wright, P. W., Visconti, P. E., Herr, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+morpholino+phenocopy+of+the+mouse+mos+mutation.">A morpholino phenocopy of the mouse mos mutation.</a> Genesis. 30, 198-200 (2001).</li><li>Heasman, J., Kofron, M., Wylie, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta-catenin+signaling+activity+dissected+in+the+early+Xenopus+embryo:+a+novel+antisense+approach.">Beta-catenin signaling activity dissected in the early Xenopus embryo: a novel antisense approach.</a> Dev. Biol. 222, 124-134 (2000).</li><li>Nasevicius, A., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+targeted+gene+knockdown+in+zebrafish.">Effective targeted gene knockdown in zebrafish.</a> Nat. Genet. 26, 216-2120 (2000).</li><li>Hoptak-Solga, A. D., Nielsen, S., Jain, I., Thummel, R., Hyde, D. R., Iovine, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin43+(GJA1)+is+required+in+the+population+of+dividing+cells+during+fin+regeneration.">Connexin43 (GJA1) is required in the population of dividing cells during fin regeneration.</a> Dev. Biol. 317, 541-548 (2008).</li><li>Thummel, R., Bai, S., Sarras, M. P., Song, P., McDermott, J., Brewer, J., Perry, M., Zhang, X., Hyde, D. R., Godwin, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+zebrafish+fin+regeneration+using+in+vivo+electroporation+of+morpholinos+against+fgfr1+and+msxb.">Inhibition of zebrafish fin regeneration using in vivo electroporation of morpholinos against fgfr1 and msxb.</a> Dev. Dyn. 235, 336-346 (2006).</li><li>Yin, V. P., Thomson, J. M., Thummel, R., Hyde, D. R., Hammond, S. M., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fgf-dependent+depletion+of+microRNA-133+promotes+appendage+regeneration+in+zebrafish.">Fgf-dependent depletion of microRNA-133 promotes appendage regeneration in zebrafish.</a> Genes Dev. 22, 728-733 (2008).</li><li>Tawk, M., Tuil, D., Torrente, Y., Vriz, S., Paulin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+gene+transfer+into+adult+fish:+a+new+tool+to+study+fin+regeneration.">High-efficiency gene transfer into adult fish: a new tool to study fin regeneration.</a> Genesis. 32, 27-31 (2002).</li></ol>

Vi har intet at afsløre.

Her beskriver vi en kraftig tab af funktion tilgang til betinget Knockdown proteiner af interesse i fin regenerering hos voksne zebrafisk. Denne teknik er blevet anvendt til at undersøge gap junction gener, signalering receptorer, transkriptionsfaktorer og microRNA&#39;er under regenerativ fin udvækst 16, 20-22. Vi forventer, at denne teknik også kan anvendes til at studere gener, der kræves til sårheling og blastema dannelse ved at tilpasse teknikken. For eksempel injiceres vi og elektroporeret en kontrol morpholino i rummet mellem benet finne stråler på den dorsale halvdel af finnen før amputation (figur 7). Vi så amputerede finnen umiddelbart distalt for injektionen flyet. 24 hPa, observerede vi, at morpholino-målrettede celler havde migreret distalt til dannelse både såret epitel og blastema (figur 8), hvilket indikerer, at cellerne i disse tidlige stadier af regeneration kan også Targeted. Teknikken har et par bemærkelsesværdige begrænsninger. For eksempel giver fluorescens fra fluorescein mærket ikke fortsætter efter fiksering og bearbejdning for immunohistokemi, hvilket gør det umuligt at korrelere et bestemt cellulært fænotype (dvs. celleproliferation) med mængden af ​​morpholino stede i en celle. Derudover har vi været i stand til konsekvent at opnå den elektroporering af plasmider ind regenerering halefinnen, selv om en tidligere gruppe har rapporteret en vellykket elektroporation af DNA i fin væv 23. Endelig har vi bemærket, at morfolino er kun effektiv i ~ 48 timer efter elektroporation 21, der forbyder at bruge denne teknik i sin nuværende form til at teste gener involveret i differentieringen af nye celletyper. Yderligere test og ændring af proceduren kan overvinde disse nuværende begrænsninger. Derudover er det muligt, at denne teknik kan anvendesat teste proteiner involveret i cellemigrering fra det underliggende væv til blastema. For eksempel injiceres vi og elektroporeret en kontrol morpholino i begge sider af finnen (som beskrevet i figur 7) forud for amputation. Vi så amputerede den dorsale halvdel af finnen umiddelbart distalt for injektionen flyet, og vi amputeret den ventrale finnen meget mere distalt. Ved 24 hPa havde morpholino-positive celler på den dorsale side migrerede fra injektionsstedet til det overliggende såret epitel og blastema. Men det var ikke tilfældet på den ventrale side (figur 9). Dette understøtter ideen om, at kun de celler, der ligger til grund for amputation flyet deltage i regenerative respons. Disse data antyder også, at proteiner hypotese at være nødvendig for cellemigrering kan testes ved hjælp af denne teknik.

<table border="1"><tbody><tr><td> Navn på reagenset </td><td> Firma </td><td> Katalog nummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> CUY21-EDIT eller CUY21-SC Square bølge elektroporator </td><td> Protech International </td><td> CUY21EDIT eller CUY21SC </td><td> Begge enheder arbejder for denne protokol </td></tr><tr><td> 3 mm diameter paddle elektroder </td><td> Protech International </td><td> CUY 650-P3 </td><td></td></tr><tr><td> Morpholino </td><td> GeneTools, LLC </td><td></td><td> Morpholino bør være specialdesignet til din protein af interesse </td></tr><tr><td> 2-phenoxyethanol </td><td> Sigma </td><td> 77.861-1L </td><td> Anæstesi, fortyndet 1:1000 i fisk systemet vand til procedure, 1:500 for eutanasi </td></tr><tr><td> Micro-injectipå pumpe </td><td> World Precision Instruments </td><td> PV830 Pneumatisk PicoPump </td><td> Mange forskellige mikroinjektion systemer kan bruges </td></tr><tr><td> Micro-manipulator </td><td> World Precision Instruments </td><td> MMJR </td><td> Højre hånd (MMJL for venstrehåndede) </td></tr><tr><td> Mikro-injektionsnåle, 1,0 mm ydre diameter </td><td> World Precision Instruments </td><td> 1B100F-4 </td><td> Disse er borsilicatglas kapillærer, trukket ind i en nål </td></tr><tr><td> Nåleholder </td><td> World Precision Instruments </td><td> 5430-ALL </td><td> Pico Dyse Kit, sørg for at indsatte på 1,0 mm pipetten pakning </td></tr><tr><td> Needle aftrækker </td><td> Sutter </td><td> P-97 </td><td> Andre Mikropipette / p aftrækkere bør også arbejde </td></tr><tr><td> Mikroskop </td><td> Leica, Nikon, Zeiss </td><td> Antallet varierer afhængig af producenten </td><td> Enhver stereomikroskop med 20x optik og evne til at arbejde med mikromanipulatorer </td></tr></tbody></table>

in vivo electroporation of morpholinos into the regenerating adult zebrafish tail fin

Visse arter af urodeles og benfisk kan regenerere deres væv. Zebrafisk er blevet en meget anvendt model til at studere spontan regenerering af voksent væv, såsom hjerte 1, retina 2, rygmarv 3, synsnerven 4, sansehårceller 5 og finner 6. Zebrafisken finne er en forholdsvis enkel vedhæng, der er let manipuleres til at studere forskellige stadier i epimorphic regenerering. Klassisk, var fin regenerering karakteriseret ved tre forskellige stadier: sårheling, blastema dannelse, og fin udvækst. Efter amputation del af finnen, prolifererer den omgivende epitel og migrerer over såret. Ved 33 ° C, hvilket proces sker inden for seks timer efter amputation (HPA, figur 1B) 6,7. Dernæst underliggende celler fra forskellige slægter (ex. knogle, blod, glia, fibroblast) igen ind i cellecyklus at danne en proliferativ blastema, wganske vist i den overliggende epidermis fortsætter med at proliferere (figur 1D) 8. Udvækst forekommer som celler proksimalt for blastema igen differentiere ind i deres respektive linier til dannelse af nyt væv (fig. 1E) 8. Afhængig af amputation, er fuld regenerering afsluttet i en uge til en måned. Ekspressionen af et stort antal genfamilier, herunder Wnt, HOX, FGF, MSX, retinsyre, Shh, notch, BMP og activin-beta A gener, er opreguleret i specifikke faser af fin regenerering 9-16. Imidlertid har de roller for disse gener og deres kodede proteiner under regenerering været vanskeligt at vurdere, hvis en specifik inhibitor for proteinet eksisterer 13, en temperaturfølsom mutant eksisterer eller et transgent dyr (enten overudtrykker vildtype-protein eller et dominerende -negative protein) blev genereret 7,12. Vi udvikPED en omvendt genetisk teknik til hurtigt og let teste funktionen af ​​ethvert gen under fin regenerering. Morpholino oligonukleotider er almindeligt anvendt til undersøgelse tab af specifikke proteiner under zebrafisk, Xenopus, kylling, og mus udvikling 17-19. Morpholinos basepar med en komplementær RNA-sekvens til hver blok præ-mRNA-splejsning eller mRNA translation. Vi beskriver en fremgangsmåde til effektivt at indføre fluorescein-mærket antisense morpholinos i regenererende zebrafisk finner knockdown ekspression af målproteinet. Den morpholino er mikroinjiceres i hver blastema af regenererende zebrafisk halefinnen og elektroporeret ind i de omgivende celler. Fluorescein giver afgift til elektroporere morpholino og at visualisere morfolino i fin vævet. Denne protokol tillader betinget protein Knockdown at undersøge betydningen af ​​specifikke proteiner under regenerativ fin udgroning. I Discussion, vi beskriver, hvordan denne fremgangsmåde kan tilpasses til at studere rollen af ​​specifikke proteiner under sårheling eller blastema dannelse, såvel som en potentiel markør for cellemigrering under blastema dannelse.

Watch this Scientific Journal Video about In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin at JoVE.com

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

Vi beskriver en fremgangsmåde til konditionelt knockdown ekspressionen af ​​et målprotein i voksne zebrafisk fin regenerering. Denne teknik involverer mikro-injektion, og elektroporering antisense oligonucleotid morpholinos i fin væv, som tillader afprøvning af proteinets rolle i forskellige stadier af fin regenerering, herunder sårheling, blastema dannelse og regenerative udvækst.

In vivo elektroporation af Morpholinos i Regenerating Adult zebrafisk Tail Fin

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration ...

Research

JoVE Journal

Biology

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an ...

Single Cell Electroporation in vivo within the Intact Developing Brain

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing the delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact ...

Retro-orbital Injection in Adult Zebrafish

Drug treatment of whole animals is an essential tool in any model system for pharmacological and chemical genetic studies. Intravenous (IV) injection is ...

Dissection of Organs from the Adult Zebrafish

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental ...

Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, ...

Direct Delivery of MIF Morpholinos Into the Zebrafish Otocyst by Injection and Electroporation Affects Inner Ear Development

In recent years, electroporation has become a popular technique for in vivo transfection of DNA, RNA, and morpholinos into various tissues, including the ...

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

Dissection of the Adult Zebrafish Kidney

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

In vivo Elektroporation af Morpholinos i den voksne zebrafisk Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

Gavaging Adult Zebrafish

Gavaging Voksen Zebrafisk

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or ...