Name: in vivo electroporation of morpholinos into the regenerating adult zebrafish tail fin
Uploaded: 2012-03-29T12:00:00
Duration: 7 min 22 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin at JoVE.com

De auteurs willen graag de Freimann Life Science Center en Center bedanken voor Zebravissen Onderzoek personeel voor hun verzorging en het onderhoud van de zebravis.

1. Resuspendeer morfolino <ol><li> Verdun 300 nM van fluoresceïne-gelabeld morfolino in 100 ul nuclease-vrij water tot een ongeveer 3 mM oplossing. De morfolino oplossing wordt in hoeveelheden verdeeld in meerdere paraffine-verzegelde microcentrifugebuizen en bewaard bij kamertemperatuur en weg van het licht. </li><li> Om de exacte morfolino concentratie te bepalen, verdunnen 5 ul morfolino oplossing (of water als blanco) in 95 pi 0,1 N HCl. Stel een basislijn op een spectrofotometer bij 265 nm met het water leeg en dan bepalen de lezing van de verdunde morfolino oplossing. Vermenigvuldigen van de morfolino absorptie door de bepaald constant en de verdunningsfactor de concentratie in ng / ul bepalen. De morfolino constant wordt als volgt berekend: Morfolino constant = moleculair gewicht van de morfolino X 1000/molar absorptie. De moleculaire gewicht en de molaire extinctie voor de morfolino is te vinden op de &quot;Oligo Properties &quot;plaat voorzien product. Verdeel de morfolino concentratie in ng / ul door het molecuulgewicht van de concentratie in mM bepalen. Verdunnen morfolino eventueel een werkende concentratie gewoonlijk 1,2 mM. </li></ol> 2. Fin Amputatie <ol><li> Verdoof volwassen zebravis in een van beide tricaïne of 2-fenoxyethanol bij 1,0 mg / ml in de tank water. </li><li> Amputeren de vin met een steriele scalpel of scheermesje proximaal van de eerste lepidotrichial vertakkingspunt. Dit moet worden gedaan op hetzelfde proximale / distale locatie op elk dier (bijv. 7 benige segmenten distaal van de vin gordel). BELANGRIJK: zorg ervoor dat perfect loodrecht op de voorste / achterste vlak van het dier. Hoekzaagsnedes zal resulteren in een ongelijke fin uitgroei van de dorsale en ventrale helften van de vin. </li><li> Breng de vis op een tank. We meestal de vis te handhaven op 33 ° C om de regeneratie te verhogen. Afhankelijk van de opzet van het experiment, wait 0-2 dagen na de amputatie (dpa) voor fin regeneratie kan beginnen vóór de invoering van het morfolino. Alternatieve benaderingen worden besproken in de Discussie, hieronder. </li></ol> 3. Morfolino Injectie <ol><li> De dag voorafgaand aan het injecteren van de morfolino, maak dan een injectie plaat (figuur 2). Zorg ervoor dat uit te snijden een inkeping aan de ene kant van de put, die helpt bij het stabiliseren van de vis voor de micro-injectie procedure. </li><li> Op 2 dpa, de voorbereiding van de micro-injectie apparatuur en morfolino oplossing. </li><li> Verdun de fluoresceïne-gelabeld morfolino om de juiste concentratie (raden te beginnen met 1,2 mm) en doe dit in een 65 ° C waterbad gedurende 5 minuten. </li><li> Trek de glazen naald voor de micro-injectie met een naald trekker. </li><li> Plaats de naald met de morfolino (let op: afhankelijk van of u een back-fill of front-laad je de naald zal bepalen of het laden van de naald eerst of knip het uiteinde eerst). </li><li> Snijd de punt van de naald op eenn hoek. </li><li> Volg de aanwijzingen van uw micro-injectie-systeem met een ongeveer 5 nl bel van morfolino per injectie injecteren. Grotere volumes van morfolino zouden kunnen verstoren het weefsel. </li><li> Verdoof de vis en leg ze op injectie plaat. Verwijder alle overtollige vloeistof en oriënteren de naald naar de juiste locatie, net distaal van de benige straal (figuur 3). Microscopisch en microinjectie inrichting geschikt voor morfolino injectie (zie tabel specifieke reagentia), spuit de morfolino in de vin van anterior posterior, zoals weergegeven in figuur 3. Het injecteren van posterior naar anterior zorgt ervoor dat de fin weefsel op te rollen tijdens de injectie en is zeer moeilijk. </li><li> Steek de naald in de regeneratief weefsel, net distaal van elk bot ray (gemarkeerd met &quot;1&quot; in figuur 3) en druk distaal tot in de blastema (gemarkeerd met &quot;2&quot; in Figuur 3). Zorg ervoor dat u de naald duwen door de nlband fin. Als de naald correct is gelokaliseerd, injecteer de morfolino (dat wil zeggen klik een keer). Op 1,2 mm, de fluoresceïne-gelabeld morfolino oplossing lijkt geel-groen, zelfs in normale lichtomstandigheden. Bij elke injectie, een gele &quot;pufje&quot; van morfolino oplossing kan worden gevisualiseerd, dat helpt lokaliseren op de injectie om de blastema. Ongeveer 75 nl (10-15 klikken) van morfolino oplossing moet worden geïnjecteerd per benige ray. Pauze ~ 1 sec tussen klikken. We hebben alleen injecteren de dorsale zijde, met behulp van de ventrale als elektroporatie alleen-controle. Als alternatief kan men herhaalt u deze gehele procedure met behulp van een controle morfolino aan de ventrale helft van de vin. </li></ol> 4. Elektroporatie van de morfolino <ol><li> Onmiddellijk na injectie van de morfolino, verwijder de injectie plaat uit de micro-injectie apparaat. Goed Vul de injectie plaat met de anesthesie-oplossing tot de vis onder water. De elektroporatie wordt uitgevoerd onder de waterlijn. </li> &lt;li&gt; Een diameter van 3 mm platina plaat pincet elektrode (CUY 650-P3 pincet, Protech International) lokaliseert de pulsen tot ongeveer de helft van de vin. Zorg ervoor dat u de elektroden aan te raken om de vin weefsel. Om ervoor te zorgen dat de elektroden niet de vin weefsel aan te raken, draai de vis op de rugzijde en kijkt recht naar beneden de middellijn voor de elektroporatie. </li><li> Electroporate zowel de dorsale en ventrale (om te controleren voor een niet-specifieke elektroporatie effecten) zijden van de vin met een CUY21 Square Wave Electroporator (Protech International, Inc.) Veeg de elektroden met een vochtige KimWipe na elke elektroporatie om luchtbelletjes die zich gevormd hebben te verwijderen. Als ze niet verwijderd, een mini-lading opbouwt, wat zal aantrekken van het weefsel in de richting van de elektrode. De elektroporatie parameters moeten worden ingesteld op tien opeenvolgende 50 msec pulsen, op 15 V met een 1 sec pauze tussen de pulsen. </li><li> Leg de vis op een glasplaatje of een petrischaal en snel het imago van de vin, en zorg ervoor dat nOTE de dorsale / ventrale oriëntatie. Deze afbeelding wordt gebruikt voor hergroei analyse op de volgende dag. Zet de vis aan de tank. </li></ol> 5. Analyse <ol><li> Indien gerichte eiwit dat werd vastgesteld ingeslagen expressie noodzakelijk is voor goede fin regeneratie dient een dramatisch verschil tussen de rug en ventrale helften van de vin blijken 1 dag na elektroporatie (figuur 5B). </li><li> Op 3 dpa, neem een foto van de vin van elke vis en matchen dit beeld met de overeenkomstige 2 dpa beeld (figuur 5B). De natuurlijke variatie in het fin pigmentatie patroon tussen de dieren kunt u het correct identificeren van individuele vissen. </li><li> Met behulp van NIH Image, volgen de 2 en 3 DPA DPA gebieden van zowel de dorsale en ventrale helften (figuur 5B). </li><li> Om% oppervlakte van dorsale versus ventrale gebruik van de volgende formule te bepalen: (- Dorsale 2dpa Dorsale 3dpa) / (Ventraal 3dpa -<html> Ventrale 2dpa) X 100 =% gebied </li></ol> 6. Representatieve resultaten <ol><li> We hebben altijd test voor fin uitgroei op 3 dpa, of 24 HPE (uur na elektroporatie). Op dit moment moet de fluoresceïne-gelabeld morfolino aanwezig in de dorsale helft van de vin (aanvullende Figuur 1 en Figuur 6A). Het is normaal om te zien wat achterstand tot op het niveau van de amputatie. </li><li> Er mag geen verschil tussen de dorsale en ventrale zijden in het fin geïnjecteerd en geëlektroporeerd met de controle morpholinos (figuur 6B) zijn. </li><li> Als de experimentele morfolino richt zich op een essentieel eiwit voor fin uitgroei, moet een dramatisch verschil tussen de dorsale en ventrale zijden worden waargenomen (Figuur 6C). </li><li> Als de elektrode raakte de vin tijdens de elektroporatie, wordt het weefsel bruin lijken (bijna verbrand in uiterlijk) en necrotische. </li></ol>&quot;Src =&quot; / files/ftp_upload/3632/3632fig1.jpg &quot;/&gt; Figuur 1. Schematische voorstelling van de verschillende gebeurtenissen die zich voordoen tijdens het fin regeneratie. De onderliggende keer voor elke wedstrijd worden in uur na amputatie (hpa) behoren een tank temperatuur van 33 ° C. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/3632/3632fig2.jpg" /> Figuur 2. A. Schematische weergave van de injectie plaat, die is gemaakt van agarose en bevat een kleine en de vis te houden tijdens micro-injectie van de morfolino. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/3632/3632fig3.jpg" /> Figuur 3. Schematische voorstelling van morfolino micro-injectie. A. Plaats de vis in de schaal met de kop van de vis in de inkeping snijden uit de put, die zal helpen de vis stabiel blijven. B. Bij lage vergroting, regelen van de naald, zodat het is dicht bij het ​​regenereren van weefsel van de vin. C. </strong&gt; Bij hogere vergroting, injecteer de morfolino distaal van elk bot fin ray (dat wil zeggen in elk blastema). De naald moet u het weefsel net distaal van de benige ray (1), en dan verder naar de locatie van de blastema (2). Opmerking: de groene cirkels in het schema zijn slechts bedoeld om de plaats van injectie te geven. De morfolino kan in het kort worden gevisualiseerd als een groen / geel &quot;puff&quot; na elke injectie, maar dit niet blijven bestaan, zoals aangegeven in het schema. <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/3632/3632fig4.jpg" /> Figuur 4. Schematische voorstelling van fin elektroporatie. A. Naar aanleiding van micro-injectie, plaats de vis in een Petri-schaal vol met verdoving en electroporate zowel de dorsale en ventrale helften. B. Zorg ervoor dat u niet aan de vin weefsel. Elektroden worden geplaatst ~ 1 mm uit het weefsel. <img alt="Figuur 5" src="/files/ftp_upload/3632/3632fig5.jpg" /> <strong&gt; Figuur 5. Schematische voorstelling van de gebruikte methoden om fin uitgroei remming te berekenen. A. Maak een foto van de vin van elke vis op 2 dpa, hetzij onmiddellijk voor of na morfolino injectie en elektroporatie. Teken de regeneratief weefsel van zowel de dorsale (groen) en ventrale (blauw) helften van de vin met NIH Image, (zwarte stippellijnen). B. Op 3 dpa, neem een foto van elke fin en opnieuw op te sporen de dorsale en ventrale gebieden van hergroei met NIH Image. C. Trek het gebied van hergroei op 2 DPA uit de totale hergroei op 3 DPA voor zowel de dorsale en ventrale haves. Het percentage oppervlakte van dorsale versus ventrale hergroei kan worden berekend met de formule: ((D 3dpa - D 2 DPA) / (V 3dpa - V 2dpa)) X 100. Percentage remming = 100 - Procent Area. <img alt="Figuur 6" src="/files/ftp_upload/3632/3632fig6.jpg" /> Figuur 6. Voorbeelden van de verwachteresultaten. A. TL-beeld toont een fluoresceïne-gelabeld controle morfolino in het dorsale helft van de vin, 24 uur na de elektroporatie (HPE). B. Helderveld beeld van een vin die werd geïnjecteerd en geëlektroporeerd met een controle morfolino in de dorsale half . Het beeld toont gelijk hergroei van zowel de dorsale en ventrale helften van een vin, 24 HPE. C. Helderveld beeld van een vin die werd geïnjecteerd en geëlektroporeerd met een experimentele morfolino in de dorsale helft. Het beeld toont de remming van de hergroei op de rug / geïnjecteerde kant. De lijn geeft de hoeveelheid hergroei op 2 dpa, onmiddellijk voorafgaand aan morfolino injectie en elektroporatie. <img alt="Figuur 7" src="/files/ftp_upload/3632/3632fig7.jpg" /> Figuur 7. Schematische voorstelling van een alternatieve injectie en elektroporatie procedure om doelwit eiwitten die betrokken zijn bij wondheling en blastema vorming. A. Injecteer de morfolinotussen de benige fin ray op de dorsale helft van de vin. B. de morfolino Electroporate, zoals u normaal. C. amputeren van de fin direct proximale (~ 1 benige segment) op de injectieplaats. D. De fluoresceïne-gelabeld morfolino kan worden waargenomen in de wond epitheel en blastema bij 24 HPE. <img alt="Figuur 8" src="/files/ftp_upload/3632/3632fig8.jpg" /> Figuur 8. Met behulp van de techniek om wond epitheel en blastema vorming richten. A. Helderveld beeld van een fin van 24 hPa die werd geïnjecteerd en geëlektroporeerd met een controle morfolino onmiddellijk voorafgaand aan amputatie. B. TL-beeld van de fin weergegeven in het paneel A. Opmerking dat de geïnjecteerde dorsale helft van de vin toont een goede opname van de morfolino in de regeneratieve weefsel. C -. C &quot;hogere vergroting van de dorsale helft van de vin getoond in panelen A en B. De injectieplaatsen vaak nog zichtbaar (pijlen), Maar tal van gerichte cellen zijn gemigreerd om deel te nemen in de wond epitheel en blastema vorming (pijl). <img alt="Figuur 9" src="/files/ftp_upload/3632/3632fig9.jpg" /> Figuur 9. Met behulp van de techniek om cellen die migreren naar de blastema. A. TL en helderveld inzet beelden tonen een vin geïnjecteerd en geëlektroporeerd met morfolino op zowel de dorsale en ventrale helften vormen richten. De vin werd vervolgens afgezet op twee vlakken. De dorsale helft werd geknipt direct distaal van de injectieplaats, waar hij als de ventrale helft werd 9-10 benige segmenten distaal van de injectieplaats te snijden. B. Na 24 hPa, de fluorescerende en helderveld inzet beelden laten zien dat morfolino is gemigreerd naar de dorsale regenereren (1), maar niet de ventrale regenereren (2) blijkt dat slechts de cel onmiddellijk proximale de snede plaats deel blastema vorming. De twee witte pijlen geven de graad van elke amputatievliegtuig. Panelen gemarkeerd 1 en 2 aan de rechterkant van het beeld tonen een sterkere vergroting uitzicht op de dorsale en ventrale helften van de vin, respectievelijk. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3632/Suppl_Fig1_JoVE.mov">Aanvullende Figuur 1.</a> een video van een confocale z-stapel een gebied dat overeenkomt met de plaats van een blastema een fin geïnjecteerd en geëlektroporeerd met een controle morfolino. Het beeld werd genomen op 24 HBO. Aangezien een fluoresceïne molecule kan worden gevisualiseerd niet alle morfolino gevisualiseerd of gekwantificeerd. Echter, deze beelden geven een idee van de verschillende mate van opname die kunnen worden gevisualiseerd in de cellen, van individuele punctata punten, om hele cellen vol met fluorescerende morfolino. Op de foto wordt de oriëntatie afgebeeld. Schaal bar: 25 micron.

<ol>
	<li>Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+the+heart+of+regeneration+in+zebrafish.">Getting to the heart of regeneration in zebrafish.</a> Semin. Cell Dev. Biol. 18, 36-45 (2007).</li><li>Vihtelic, T. S., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+rod+and+cone+cell+death+and+regeneration+in+the+adult+albino+zebrafish+(Danio+rerio)+retina.">Light-induced rod and cone cell death and regeneration in the adult albino zebrafish (Danio rerio) retina.</a> J. Neurobiol. 44, 289-307 (2000).</li><li>Becker, T., Wullimann, M. F., Becker, C. G., Bernhardt, R. R., Schachner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+regrowth+after+spinal+cord+transection+in+adult+zebrafish.">Axonal regrowth after spinal cord transection in adult zebrafish.</a> J. Comp. Neurol. 377, 577-595 (1997).</li><li>Becker, C. G., Becker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repellent+guidance+of+regenerating+optic+axons+by+chondroitin+sulfate+glycosaminoglycans+in+zebrafish.">Repellent guidance of regenerating optic axons by chondroitin sulfate glycosaminoglycans in zebrafish.</a> J. Neurosci. 22, 842-853 (2002).</li><li>Lopez-Schier, H., Hudspeth, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+two-step+mechanism+underlies+the+planar+polarization+of+regenerating+sensory+hair+cells.">A two-step mechanism underlies the planar polarization of regenerating sensory hair cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 18615-1820 (2006).</li><li>Johnson, S. L., Weston, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature-sensitive+mutations+that+cause+stage-specific+defects+in+Zebrafish+fin+regeneration.">Temperature-sensitive mutations that cause stage-specific defects in Zebrafish fin regeneration.</a> Genetics. 141, 1583-1595 (1995).</li><li>Nechiporuk, A., Poss, K. D., Johnson, S. L., Keating, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positional+cloning+of+a+temperature-sensitive+mutant+emmental+reveals+a+role+for+sly1+during+cell+proliferation+in+zebrafish+fin+regeneration.">Positional cloning of a temperature-sensitive mutant emmental reveals a role for sly1 during cell proliferation in zebrafish fin regeneration.</a> Dev. Biol. 258, 291-306 (2003).</li><li>Tu, S., Johnson, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+restriction+in+the+growing+and+regenerating+zebrafish+fin.">Fate restriction in the growing and regenerating zebrafish fin.</a> Dev. Cell. 20, 725-732 (2011).</li><li>Geraudie, J., Ferretti, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+between+RA-induced+apoptosis+and+patterning+defects+in+regenerating+fins+and+limbs.">Correlation between RA-induced apoptosis and patterning defects in regenerating fins and limbs.</a> Int. J. Dev. Biol. 41, 529-532 (1997).</li><li>Jazwinska, A., Badakov, R., Keating, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activin-betaA+signaling+is+required+for+zebrafish+fin+regeneration.">Activin-betaA signaling is required for zebrafish fin regeneration.</a> Curr. Biol. 17, 1390-1395 (2007).</li><li>Laforest, L., Brown, C. W., Poleo, G., Geraudie, J., Tada, M., Ekker, M., Akimenko, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+the+sonic+hedgehog,+patched+1+and+bmp2+genes+in+patterning+of+the+zebrafish+dermal+fin+rays.">Involvement of the sonic hedgehog, patched 1 and bmp2 genes in patterning of the zebrafish dermal fin rays.</a> Development. 125, 4175-4178 (1998).</li><li>Lee, Y., Grill, S., Sanchez, A., Murphy-Ryan, M., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fgf+signaling+instructs+position-dependent+growth+rate+during+zebrafish+fin+regeneration.">Fgf signaling instructs position-dependent growth rate during zebrafish fin regeneration.</a> Development. 132, 5173-5183 (2005).</li><li>Poss, K. D., Shen, J., Nechiporuk, A., McMahon, G., Thisse, B., Thisse, C., Keating, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+for+Fgf+signaling+during+zebrafish+fin+regeneration.">Roles for Fgf signaling during zebrafish fin regeneration.</a> Dev. Biol. 222, 347-358 (2000).</li><li>Raya, A., Koth, C. M., Buscher, D., Kawakami, Y., Itoh, T., Raya, R. M., Sternik, G., Tsai, H. J., Rodriguez-Esteban, C., Izpisua-Belmonte, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+Notch+signaling+pathway+precedes+heart+regeneration+in+zebrafish.">Activation of Notch signaling pathway precedes heart regeneration in zebrafish.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 11889-11895 (2003).</li><li>Smith, A., Avaron, F., Guay, D., Padhi, B. K., Akimenko, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+BMP+signaling+during+zebrafish+fin+regeneration+disrupts+fin+growth+and+scleroblasts+differentiation+and+function.">Inhibition of BMP signaling during zebrafish fin regeneration disrupts fin growth and scleroblasts differentiation and function.</a> Dev Biol. 299, 438-454 (2006).</li><li>Thummel, R., Li, L., Tanase, C., Sarras, M. P., Godwin, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+expression+pattern+and+function+between+zebrafish+hoxc13+orthologs:+recruitment+of+Hoxc13b+into+an+early+embryonic+role.">Differences in expression pattern and function between zebrafish hoxc13 orthologs: recruitment of Hoxc13b into an early embryonic role.</a> Dev. Biol. 274, 318-333 (2004).</li><li>Coonrod, S. A., Bolling, L. C., Wright, P. W., Visconti, P. E., Herr, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+morpholino+phenocopy+of+the+mouse+mos+mutation.">A morpholino phenocopy of the mouse mos mutation.</a> Genesis. 30, 198-200 (2001).</li><li>Heasman, J., Kofron, M., Wylie, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta-catenin+signaling+activity+dissected+in+the+early+Xenopus+embryo:+a+novel+antisense+approach.">Beta-catenin signaling activity dissected in the early Xenopus embryo: a novel antisense approach.</a> Dev. Biol. 222, 124-134 (2000).</li><li>Nasevicius, A., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+targeted+gene+knockdown+in+zebrafish.">Effective targeted gene knockdown in zebrafish.</a> Nat. Genet. 26, 216-2120 (2000).</li><li>Hoptak-Solga, A. D., Nielsen, S., Jain, I., Thummel, R., Hyde, D. R., Iovine, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin43+(GJA1)+is+required+in+the+population+of+dividing+cells+during+fin+regeneration.">Connexin43 (GJA1) is required in the population of dividing cells during fin regeneration.</a> Dev. Biol. 317, 541-548 (2008).</li><li>Thummel, R., Bai, S., Sarras, M. P., Song, P., McDermott, J., Brewer, J., Perry, M., Zhang, X., Hyde, D. R., Godwin, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+zebrafish+fin+regeneration+using+in+vivo+electroporation+of+morpholinos+against+fgfr1+and+msxb.">Inhibition of zebrafish fin regeneration using in vivo electroporation of morpholinos against fgfr1 and msxb.</a> Dev. Dyn. 235, 336-346 (2006).</li><li>Yin, V. P., Thomson, J. M., Thummel, R., Hyde, D. R., Hammond, S. M., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fgf-dependent+depletion+of+microRNA-133+promotes+appendage+regeneration+in+zebrafish.">Fgf-dependent depletion of microRNA-133 promotes appendage regeneration in zebrafish.</a> Genes Dev. 22, 728-733 (2008).</li><li>Tawk, M., Tuil, D., Torrente, Y., Vriz, S., Paulin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+gene+transfer+into+adult+fish:+a+new+tool+to+study+fin+regeneration.">High-efficiency gene transfer into adult fish: a new tool to study fin regeneration.</a> Genesis. 32, 27-31 (2002).</li></ol>

Wij hebben niets te onthullen.

We beschrijven hier een krachtige verlies-van-functie benadering van de voorwaardelijk knockdown eiwitten van belang tijdens het fin de regeneratie bij volwassen zebravissen. Deze techniek is gebruikt om gap junction genen te bestuderen, signalering receptoren, transcriptiefactoren, en microRNA&#39;s tijdens de regeneratieve fin uitgroei 16, 20-22. We verwachten dat deze techniek ook kan worden gebruikt om genen die vereist zijn voor wondgenezing en blastema vorming door aanpassing van de techniek te bestuderen. Zo hebben wij geïnjecteerd en geëlektroporeerd een controle morfolino in de ruimte tussen het bot vinnen op de rug helft van de vin voor amputatie (Figuur 7). We hebben toen geamputeerd de vin direct distaal van de injectie vlak. 24 hPa, zagen we dat de morfolino gerichte cellen distaal was gemigreerd naar zowel de wond epitheel en blastema (figuur 8) te vormen, wat aangeeft dat cellen tijdens deze vroege stadia van de regeneratie kan ook worden Targeted. De techniek heeft een paar opvallende beperkingen. Bijvoorbeeld, de fluorescentie van de fluorescentie label niet bestaan ​​volgende fixatie en verwerking voor immunohistochemie, waardoor het onmogelijk om een ​​bepaalde cellulaire fenotype (bijv. celproliferatie) correleren met de hoeveelheid morfolino in een cel. Daarnaast hebben wij in staat om de elektroporatie van plasmiden consistent bereiken in de regeneratiezone staartvin, hoewel vorige groep heeft rapporteren succesvolle elektroporatie van DNA in fin weefsel 23. Ten slotte hebben wij opgemerkt dat de morfolino is alleen effectief voor ~ 48 uur na de elektroporatie 21, die verbiedt het gebruik van deze techniek in zijn huidige vorm voor het testen van genen die betrokken zijn bij de differentiatie van nieuwe celtypen. Aanvullend onderzoek en wijziging van de procedure kan het overwinnen van deze huidige beperkingen. Bovendien is het mogelijk dat deze techniek kan worden gebruikteiwitten die zijn betrokken bij celmigratie van het onderliggende weefsel de blastema testen. Zo hebben wij geïnjecteerd en geëlektroporeerd een controle morfolino in beide kanten van de vin (zoals beschreven in figuur 7) voor amputatie. We hebben toen geamputeerd de dorsale helft van de vin direct distaal van de injectie vliegtuig en we geamputeerd de ventrale vinnen veel meer distaal. Na 24 hPa, had de morfolino-positieve cellen aan de dorsale zijde gemigreerd van de plaats van injectie naar de bovenliggende wond epitheel en blastema. Maar dat was niet het geval op de ventrale zijde (Figuur 9). Dit ondersteunt het idee dat alleen de cellen die de amputatie vliegtuig ten grondslag liggen aan deel te nemen aan de regeneratieve respons. Deze gegevens suggereren ook dat eiwitten hypothese te worden die nodig zijn voor celmigratie kan worden getest met behulp van deze techniek.

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het serum </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> CUY21-EDIT-of CUY21-SC Blokgolf electroporator </td><td> Protech International </td><td> CUY21EDIT of CUY21SC </td><td> Beide units werken voor dit protocol </td></tr><tr><td> 3-mm diameter peddel elektroden </td><td> Protech International </td><td> CUY 650-P3 </td><td></td></tr><tr><td> Morfolino </td><td> GeneTools, LLC </td><td></td><td> Morfolino moet op maat worden ontworpen om uw eiwit van belang </td></tr><tr><td> 2-fenoxyethanol </td><td> Sigma </td><td> 77861-1L </td><td> Anesthesie, verdunde 1:1000 in vis-systeem water voor de procedure, 1:500 voor euthanasie </td></tr><tr><td> Micro-injectide pomp </td><td> Wereld Precision Instruments </td><td> PV830 Pneumatische PicoPump </td><td> Veel verschillende micro-injectie systemen kunnen worden gebruikt </td></tr><tr><td> Micro-manipulator </td><td> Wereld Precision Instruments </td><td> MMJR </td><td> Rechtshandig (MMJL voor linkshandigen) </td></tr><tr><td> Micro-injectie naalden, 1,0 mm buitendiameter </td><td> Wereld Precision Instruments </td><td> 1B100F-4 </td><td> Dit zijn borosilicaatglas haarvaten, trok in een naald </td></tr><tr><td> Naaldhouder </td><td> Wereld Precision Instruments </td><td> 5430-ALL </td><td> Pico Nozzle Kit, zorg ervoor dat aan inzet van de 1,0 mm pipet pakking </td></tr><tr><td> Naald trekker </td><td> Sutter </td><td> P-97 </td><td> Andere micropipet / naald trekkers zou ook moeten werken </td></tr><tr><td> Microscoop </td><td> Leica, Nikon, Zeiss </td><td> Aantal varieert afhankelijk van de fabrikant </td><td> Elke stereomicroscoop met 20X optische en de mogelijkheid om te werken met micromanipulators </td></tr></tbody></table>

in vivo electroporation of morpholinos into the regenerating adult zebrafish tail fin

Bepaalde soorten van urodeles en beenvissen kan regenereren hun weefsels. De zebravis zijn uitgegroeid tot een veel gebruikt model om de spontane regeneratie van volwassen weefsels, zoals het hart 1, 2 netvlies, het ruggenmerg 3, oogzenuw 4, sensorische haarcellen 5, 6 en vinnen te bestuderen. De zebravis vin is een relatief eenvoudig aanhangsel dat gemakkelijk kan worden gemanipuleerd om meerdere stadia te bestuderen in epimorphic regeneratie. Klassiek, werd fin regeneratie gekenmerkt door drie verschillende fasen: wondgenezing, blastema vorming, en gewone uitgroei. Na het amputeren van een deel van de vin, de omliggende epitheel woekert en migreert over de wond. Bij 33 ° C, dit proces plaatsvindt binnen de zes uur na de amputatie (hpa, figuur 1B) 6,7. Vervolgens onderliggende cellen van verschillende geslachten (bv. botten, bloed, glia, fibroblast) opnieuw in te voeren de celcyclus van een proliferatieve blastema, w vormenhile de bovenliggende opperhuid blijft woekeren (figuur 1D) 8. Uitgroei optreedt als cellen proximaal blastema opnieuw differentiëren in hun lijnen nieuwe weefsel (Figuur 1e) 8 vormen. Afhankelijk van het niveau van de amputatie, wordt volledige regeneratie voltooid in een week tot een maand. De expressie van een groot aantal van gen-families, met inbegrip van Wnt, Hox, FGF, MSX, retinoïnezuur, shh, notch, bmp, en activine-bèta A genen, is up-gereguleerd tijdens bepaalde fases van fin regeneratie 9-16. Echter, de rol van deze genen en hun gecodeerde eiwitten tijdens regeneratie moeilijk te evalueren, tenzij een specifieke inhibitor voor het eiwit bestaat 13 een temperatuur-gevoelige mutant bestaat of een transgeen dier (hetzij tot overexpressie het wild-type eiwit of een dominante -negatieve eiwit) werd gegenereerd 7,12. We ontwikped omgekeerde genetische techniek om de functie van elk gen snel en gemakkelijk te testen gedurende fin regeneratie. Morfolino oligonucleotiden worden veel gebruikt om het verlies van specifieke eiwitten te bestuderen tijdens de zebravis, Xenopus, kuiken, en de ontwikkeling van de muis 17-19. Morpholinos basenparen met een complementair RNA sequentie, regel pre-mRNA splicing of mRNA translation. Wij beschrijven een methode om efficiënt fluoresceïne-gelabeld antisense morpholinos voeren in regenereren zebravis vinnen knockdown expressie van het doelwiteiwit. De morfolino is micro-geïnjecteerd in elk blastema van de regeneratie van zebravis staartvin en geëlektroporeerd in de omringende cellen. Fluoresceïne biedt de invoer van de morfolino electroporate en de morfolino visualiseren in de vin weefsel. Dit protocol maakt voorwaardelijke proteïne knockdown om de rol van specifieke eiwitten te onderzoeken tijdens de regeneratieve fin uitgroei. In de Discussion wordt beschreven hoe deze aanpak kan worden aangepast aan het gebruik van specifieke bestuderen tijdens wondgenezing of blastema vorming en een potentiële marker celmigratie tijdens blastema vorming.

Watch this Scientific Journal Video about In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin at JoVE.com

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

We beschrijven een methode om de expressie van een doeleiwit voorwaardelijk knockdown op volwassen zebravissen fin regeneratie. Deze techniek micro-injectie en electroporating antisense oligonucleotide morpholinos in fin weefsel, zodat het testen van het eiwit rol in verschillende stadia van fin regeneratie onder wondgenezing blastema vorming en regeneratieve uitgroei.

In vivo Elektroporatie van Morpholinos in het regenereren van Adult Zebravissen Tail Fin

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration ...

Research

JoVE Journal

Biology

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

Transplantatie van Whole nier Marrow in Adult zebravis

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an ...

Single Cell Electroporation in vivo within the Intact Developing Brain

Single Cell Elektroporatie in vivo binnen de Intact ontwikkeling van de hersenen

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing the delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact ...

Retro-orbital Injection in Adult Zebrafish

Retro-orbitale injectie in Adult zebravis

Drug treatment of whole animals is an essential tool in any model system for pharmacological and chemical genetic studies. Intravenous (IV) injection is ...

Dissection of Organs from the Adult Zebrafish

Dissectie van organen van de Adult zebravis

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental ...

Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish

Intraperitoneale injectie in de Adult zebravis

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, ...

Direct Delivery of MIF Morpholinos Into the Zebrafish Otocyst by Injection and Electroporation Affects Inner Ear Development

Directe levering van MAV Morpholinos Into the zebravis Otocyst door injectie en elektroporatie van invloed op binnenoor Ontwikkeling

In recent years, electroporation has become a popular technique for in vivo transfection of DNA, RNA, and morpholinos into various tissues, including the ...

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

Transplantatie van cellen direct in de nieren van Volwassen zebravis

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

Dissection of the Adult Zebrafish Kidney

Dissectie van de Adult zebravis Kidney

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

In vivo Elektroporatie van Morpholinos in de Adult zebravis Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

Gavaging Adult Zebrafish

Gavaging Adult zebravis

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or ...