Name: in vivo electroporation of morpholinos into the regenerating adult zebrafish tail fin
Uploaded: 2012-03-29T12:00:00
Duration: 7 min 22 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin at JoVE.com

Forfatterne ønsker å takke Freimann Life Science Center og Center for sebrafisk forskning personalet for deres pleie og vedlikehold av sebrafisk.

1. Resuspender Morpholino <ol><li> Fortynn 300 nM av fluorescein-merket Morpholino til 100 mL av nukleasefritt vann for å lage en ca 3 mm løsning. Den Morpholino Løsningen er alikvoteres inn flere parafin-forseglede Mikrosentrifugerør og oppbevares ved romtemperatur og vekk fra lyset. </li><li> Å fastslå den eksakte Morpholino konsentrasjonen, fortynne 5 mL av Morpholino løsning (eller vann som en blank) i 95 mL av 0,1 N HCl. Sett en baseline på et spektrofotometer ved 265 nm med vannet blankt og deretter bestemme lesning av den fortynnede Morpholino løsningen. Multipliser Morpholino absorbans ved sin klare konstant og med fortynningsfaktoren for å bestemme konsentrasjonen i ng / mL. Den Morpholino konstant er beregnet som: Morpholino konstant = molekylære vekten av Morpholino X 1000/molar absorbans. Den molekylære vekt og molar absorbans for Morpholino kan bli funnet på &quot;Oligo Properties &quot;ark som følger med produktet. Del Morpholino konsentrasjon, i ng / mL, med molekylvekt å bestemme konsentrasjonen i mm. Fortynn Morpholino, om nødvendig, til en fungerende konsentrasjon, typisk 1,2 mm. </li></ol> 2. Fin Amputasjon <ol><li> Anesthetize voksen sebrafisk i enten Tricaine eller 2-Phenoxyethanol på 1,0 mg / ml i tank vann. </li><li> Amputere fin hjelp av en steril skalpell eller barberblad proksimalt for første lepidotrichial forgreningspunktet. Dette bør gjøres på samme proksimale / distale beliggenhet på hvert dyr (f.eks 7 benete segmenter distale fra FIN hofteholder). VIKTIG: Sørg for å kutte perfekt vinkelrett på fremre / bakre planet av dyret. Vinklet kutt vil resultere i ujevn fin utvekst av dorsal og ventral halvdelene av FIN. </li><li> Tilbake fisken til en tank. Vi vanligvis opprettholde fisken ved 33 ° C for å øke gjenfødelse rate. Avhengig av eksperimentell design, wAIT 0-2 dager etter amputasjon (DPA) for fin regenerering å begynne før innføring av Morpholino. Alternative tilnærminger er omtalt i diskusjonen nedenfor. </li></ol> 3. Morpholino Injection <ol><li> Dagen før de injiserte Morpholino, lage en injeksjon plate (figur 2). Sørg for å klippe ut et hakk i den ene enden av brønnen, som bidrar til å stabilisere fisken for mikroinjeksjon prosedyren. </li><li> På to DPA, forberede mikro-injeksjon apparater og Morpholino løsning. </li><li> Fortynn fluorescein-merket Morpholino til riktig konsentrasjon (anbefaler at du starter med 1,2 mm) og plasser i en 65 ° C vannbad i 5 minutter. </li><li> Trekk glasset nålen for mikro-injeksjon ved hjelp av en nål avtrekker. </li><li> Legg nålen med Morpholino (merk: avhengig av om du back-fill eller foran laste inn nålen vil avgjøre om du legger nålen først, eller kutte spissen først). </li><li> Skjær spissen av nålen på enn vinkel. </li><li> Følg instruksjonene på din mikro-injeksjon system for å injisere en ca 5 nl boble av Morpholino per injeksjon. Større mengder Morpholino kunne forstyrre vev. </li><li> Anesthetize fisken og legg den på injeksjon plate. Fjern all overflødig væske og orientere nålen til riktig sted, rett distalt for benete ray (figur 3). Ved hjelp av et mikroskop og mikroinjeksjon apparat egnet for Morpholino injeksjoner (se tabell over spesifikke reagenser), injiserer den Morpholino inn i finnen fra fremre til bakre, som vist i Figur 3. Injeksjon fra bakre til fremre får fin vev for å rulle opp under injeksjonen og er svært vanskelig. </li><li> Sett nålen forsiktig inn i regenerativ vev, bare distal til hver benete ray (merket &quot;1&quot; i figur 3) og skyv distalt inntil plassert i blastema (merket &quot;2&quot; i figur 3). Vær forsiktig så du ikke skyver nålen gjennom endekk FIN. Når nålen er riktig lokalisert, injisere Morpholino (dvs. klikke én gang). Hos 1,2 mm, vises fluorescein-merket Morpholino løsning gul-grønn, selv i normale lysforhold. Med hver injeksjon, kan en gul &quot;puff&quot; av Morpholino løsning bli visualisert, hjelper som lokalisere injeksjonen til blastema. Omtrent 75 nl (10-15 klikk) av Morpholino Løsningen bør injiseres per benete ray. Pause ~ 1 sek mellom klikkene. Vi bare injisere dorsal side, ved hjelp av ventrale som electroporation kun kontroll. Alternativt kan en gjenta hele denne prosedyren ved hjelp av en kontroll Morpholino på ventrale halvparten av FIN. </li></ol> 4. Electroporation av Morpholino <ol><li> Umiddelbart etter injeksjon av Morpholino, fjern injeksjon platen fra mikro-injeksjon apparater. Fyll injeksjon platen godt med bedøvelse løsning inntil fisken er under vann. Den electroporation utføres under vannlinjen. </li> &lt;li&gt; A 3 mm diameter platina plate pinsetten elektrode (CUY 650-P3 pinsett, Protech International) lokaliserer pulsene til omtrent halvparten av FIN. Vær forsiktig så du ikke berører elektrodene til fin vev. For å sikre at elektrodene ikke berører fin vev, rotere fisken på dens rygg siden og ser rett ned midtlinjen for electroporation. </li><li> Electroporate både dorsale og ventrale (å kontrollere for en uspesifikk electroporation effekter) sider av finnen med en CUY21 Square Wave Electroporator (Protech International, Inc.). Tørk elektrodene med en fuktig KimWipe etter hvert electroporation for å fjerne eventuelle bobler som kan ha blitt dannet. Hvis de ikke blir fjernet, en mini-avgift bygger opp, noe som vil tiltrekke vevet mot elektroden. De electroporation parametrene bør settes til ti på rad 50 msek pulser, ved 15 V med en 1 sek pause mellom pulser. </li><li> Legg fisken på en glass-slide eller petriskål og raskt bilde av fin, og husk å nOTE dorsal / ventrale orientering. Dette bildet vil bli brukt til gjenvekst analyse på neste dag. Med fisken tilbake til tanken. </li></ol> 5. Analyse <ol><li> Dersom målrettet protein som ble slått ned i uttrykket er nødvendig for riktig fin regenerasjon, bør en dramatisk forskjell mellom rygg og ventral halvdelene av finnen være tydelig en dag etter electroporation (Figur 5B). </li><li> På tre dpa, ta et bilde av fin for hver fisk og matche opp dette bildet med tilsvarende 2 DPA bilde (Figur 5B). Den naturlige variasjonen i fin pigmentering mønsteret mellom dyr vil tillate deg å korrekt identifisere hver enkelt fisk. </li><li> Ved hjelp av NIH Image, spore de 2 DPA og 3 DPA områder av både rygg-og ventral omgangene (Figur 5B). </li><li> For å finne ut% areal av dorsal versus ventral bruk følgende formel: (dorsal 3dpa - dorsal 2dpa) / (Ventral 3dpa -<html> Ventrale 2dpa) x 100 =% areal </li></ol> 6. Representative Resultater <ol><li> Vi har alltid analysen for fin utvekst på tre DPA, eller 24 HPE (timer etter electroporation). På dette tidspunktet bør fluorescein-merket Morpholino være til stede i dorsal halvparten av FIN (Supplemental Figur 1 og Figur 6A). Det er vanlig å se noen etterfølgende ned til nivået for amputasjonen. </li><li> Det bør ikke være forskjell mellom rygg og ventral sider i fin injisert og electroporated med kontroll morpholinos (Figur 6B). </li><li> Hvis den eksperimentelle Morpholino rettet en viktig protein for fin utvekst, bør en dramatisk forskjell mellom rygg og ventral sider følges (figur 6C). </li><li> Hvis elektroden berørt fin under electroporation, vil vevet vises brun (nesten brent i utseende) og nekrotisk. </li></ol>&quot;Src =&quot; / files/ftp_upload/3632/3632fig1.jpg &quot;/&gt; Figur 1. Skjematisk av de ulike hendelsene som oppstår under FIN gjenfødelse. De bakenforliggende ganger for hvert arrangement er gitt i timene etter amputasjon (hPa), og tilsvarer en tank temperatur på 33 ° C. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/3632/3632fig2.jpg" /> Figur 2. A. Skjematisk av injeksjonen plate, som er laget av agarose og inneholder en liten godt å holde fisken under mikroinjeksjon av Morpholino. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/3632/3632fig3.jpg" /> Figur 3. Skjematisk av Morpholino mikroinjeksjon. A. Plasser fisken i fatet med hodet av fisken i hakk skåret ut av brønnen, som vil hjelpe fisken forbli stabil. B. Ved lav forstørrelse, arrangere nålen slik at det er nær regenerere vev av fin. C. </strong&gt; Ved høyere forstørrelse, injisere Morpholino distale til hver benete fin ray (dvs i hver blastema). Nålen skal inn i vevet rett distalt for benete ray (1), og deretter fortsette til plasseringen av den blastema (2). Merk: de grønne sirklene i den skjematiske er kun ment for å vise plasseringen av injeksjonen. Den Morpholino kan kort bli visualisert som en grønn / gul &quot;puff&quot; etter hver injeksjon, men ikke dette vedvare som vist i skjematisk. <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/3632/3632fig4.jpg" /> Figur 4. Skjematisk av fin electroporation. A. Etter mikroinjeksjon, plasser fisken i en petriskål full av anestesi og electroporate både rygg og ventral halvdeler. B. Sørg for å ikke berøre fin vev. Elektroder skal plasseres ~ 1 mm fra vevet. <img alt="Figur 5" src="/files/ftp_upload/3632/3632fig5.jpg" /> <strong&gt; Figur 5. Skjematisk av metodene som brukes for å beregne fin utvekst hemming. A. Ta et bilde av fin for hver fisk ved 2 DPA, enten umiddelbart før eller etter Morpholino injeksjon og electroporation. Tegn regenererende vev av både dorsal (grønn) og ventrale (blå) halvdelene av finnen med NIH Image, (svarte stiplede linjer). B. På 3 DPA, ta et bilde av hver fin og igjen spore dorsal og ventral områder av gjenvekst med NIH Image. C. Trekk området gjenvekst ved 2 DPA fra total gjenvekst på 3 DPA for både rygg og ventral haves. Det prosent området dorsal versus ventral ettervekst kan beregnes med formelen: ((D 3dpa - D 2 DPA) / (V 3dpa - V 2dpa)) X 100. Prosent hemming = 100 - prosent området. <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/3632/3632fig6.jpg" /> Figur 6. Eksempler på forventetutfall. A. Fluoriserende Bildet viser en fluorescein-merket kontroll Morpholino i dorsal halvparten av FIN, 24 timer etter electroporation (HPE). B. lysfelt bilde av en fin som ble injisert, og electroporated med en kontroll Morpholino i dorsal halvdel . Bildet viser lik gjenvekst av både dorsal og ventral halvdelene av en fin, 24 HPE. C. lysfelt bilde av en fin som ble injisert og electroporated med en eksperimentell Morpholino i dorsal halvparten. Bildet viser hemming av gjenvekst på dorsal / injiserte side. Linjen viser mengden av gjenvekst ved 2 DPA, umiddelbart før Morpholino injeksjon og electroporation. <img alt="Figur 7" src="/files/ftp_upload/3632/3632fig7.jpg" /> Figur 7. Skjematisk fremstilling av en alternativ injeksjon og electroporation prosedyre å target proteiner involvert i sårheling og blastema formasjon. A. Injiser Morpholinomellom hver bony fin ray på dorsal halvparten av FIN. B. Electroporate den Morpholino som vanlig. C. amputere fin umiddelbart proksimale (~ 1 benete segment) på injeksjonsstedet. D. fluorescein-merket Morpholino kan observeres i såret epitel og blastema på 24 HPE. <img alt="Figur 8" src="/files/ftp_upload/3632/3632fig8.jpg" /> Figur 8. Hjelp av teknikken til å målrette såret epitel og blastema formasjon. A. lysfelt bilde av en fin på 24 hPa som ble injisert, og electroporated med en kontroll Morpholino umiddelbart før amputasjon. B. Fluoriserende bilde av fin vist i panel A. Merk at den injiserte dorsal halvparten av FIN viser gode opptak av Morpholino i den regenerative vev. C -. C &quot;Høyere forstørrelse av dorsal halvparten av FIN vist i paneler A og B. De injeksjonssteder er ofte fremdeles synlige (pilspisser), Men mange målrettede celler har migrert til å delta i såret epitel og blastema formasjon (pil). <img alt="Figur 9" src="/files/ftp_upload/3632/3632fig9.jpg" /> Figur 9. Hjelp av teknikken for å målrette celler som vandrer for å danne blastema. A. Fluoriserende og lysfelt innfelte bildene viser en fin injisert og electroporated med Morpholino på både rygg og ventral halvdeler. Styrefinnen ble deretter amputert på to plan. Den dorsale halvår var kuttet umiddelbart distalt for injeksjonssteder, hvor som ventrale halvår var kuttet 9-10 benete segmenter distalt for injeksjonssteder. B. På 24 hpa, det fluorescerende og lysfelt innfelte bildene viser at Morpholino har migrert til dorsal regenerere (1), men ikke ventrale regenerere (2), som indikerer at bare cellen umiddelbart proksimalt for kutt nettstedet delta i blastema formasjon. De to settene med hvite pilspisser viser nivået på hver amputasjonplanet. Paneler merket 1 og 2 på helt til høyre på bildet viser en høyere forstørrelse visning av dorsal og ventral halvdelene av fin, henholdsvis. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3632/Suppl_Fig1_JoVE.mov">Supplemental Figur 1.</a> En video av en confocal z-stack av en region som tilsvarer plasseringen av en blastema i en fin injisert og electroporated med en kontroll Morpholino. Bildet ble tatt på 24 HPE. Siden en enkelt fluorescein molekyl ikke kan visualiseres, kan ikke alle Morpholino bli visualisert eller tallfestet. Men disse bildene gi en ide av de varierende grader av opptak som kan sees i cellene, fra individuelle punctate prikker, til hele celler fulle av fluorescerende Morpholino. På stillbildet, er retningen vist. Scale bar: 25 mikron.

<ol>
	<li>Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+the+heart+of+regeneration+in+zebrafish.">Getting to the heart of regeneration in zebrafish.</a> Semin. Cell Dev. Biol. 18, 36-45 (2007).</li><li>Vihtelic, T. S., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+rod+and+cone+cell+death+and+regeneration+in+the+adult+albino+zebrafish+(Danio+rerio)+retina.">Light-induced rod and cone cell death and regeneration in the adult albino zebrafish (Danio rerio) retina.</a> J. Neurobiol. 44, 289-307 (2000).</li><li>Becker, T., Wullimann, M. F., Becker, C. G., Bernhardt, R. R., Schachner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+regrowth+after+spinal+cord+transection+in+adult+zebrafish.">Axonal regrowth after spinal cord transection in adult zebrafish.</a> J. Comp. Neurol. 377, 577-595 (1997).</li><li>Becker, C. G., Becker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repellent+guidance+of+regenerating+optic+axons+by+chondroitin+sulfate+glycosaminoglycans+in+zebrafish.">Repellent guidance of regenerating optic axons by chondroitin sulfate glycosaminoglycans in zebrafish.</a> J. Neurosci. 22, 842-853 (2002).</li><li>Lopez-Schier, H., Hudspeth, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+two-step+mechanism+underlies+the+planar+polarization+of+regenerating+sensory+hair+cells.">A two-step mechanism underlies the planar polarization of regenerating sensory hair cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 18615-1820 (2006).</li><li>Johnson, S. L., Weston, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature-sensitive+mutations+that+cause+stage-specific+defects+in+Zebrafish+fin+regeneration.">Temperature-sensitive mutations that cause stage-specific defects in Zebrafish fin regeneration.</a> Genetics. 141, 1583-1595 (1995).</li><li>Nechiporuk, A., Poss, K. D., Johnson, S. L., Keating, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positional+cloning+of+a+temperature-sensitive+mutant+emmental+reveals+a+role+for+sly1+during+cell+proliferation+in+zebrafish+fin+regeneration.">Positional cloning of a temperature-sensitive mutant emmental reveals a role for sly1 during cell proliferation in zebrafish fin regeneration.</a> Dev. Biol. 258, 291-306 (2003).</li><li>Tu, S., Johnson, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+restriction+in+the+growing+and+regenerating+zebrafish+fin.">Fate restriction in the growing and regenerating zebrafish fin.</a> Dev. Cell. 20, 725-732 (2011).</li><li>Geraudie, J., Ferretti, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+between+RA-induced+apoptosis+and+patterning+defects+in+regenerating+fins+and+limbs.">Correlation between RA-induced apoptosis and patterning defects in regenerating fins and limbs.</a> Int. J. Dev. Biol. 41, 529-532 (1997).</li><li>Jazwinska, A., Badakov, R., Keating, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activin-betaA+signaling+is+required+for+zebrafish+fin+regeneration.">Activin-betaA signaling is required for zebrafish fin regeneration.</a> Curr. Biol. 17, 1390-1395 (2007).</li><li>Laforest, L., Brown, C. W., Poleo, G., Geraudie, J., Tada, M., Ekker, M., Akimenko, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+the+sonic+hedgehog,+patched+1+and+bmp2+genes+in+patterning+of+the+zebrafish+dermal+fin+rays.">Involvement of the sonic hedgehog, patched 1 and bmp2 genes in patterning of the zebrafish dermal fin rays.</a> Development. 125, 4175-4178 (1998).</li><li>Lee, Y., Grill, S., Sanchez, A., Murphy-Ryan, M., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fgf+signaling+instructs+position-dependent+growth+rate+during+zebrafish+fin+regeneration.">Fgf signaling instructs position-dependent growth rate during zebrafish fin regeneration.</a> Development. 132, 5173-5183 (2005).</li><li>Poss, K. D., Shen, J., Nechiporuk, A., McMahon, G., Thisse, B., Thisse, C., Keating, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+for+Fgf+signaling+during+zebrafish+fin+regeneration.">Roles for Fgf signaling during zebrafish fin regeneration.</a> Dev. Biol. 222, 347-358 (2000).</li><li>Raya, A., Koth, C. M., Buscher, D., Kawakami, Y., Itoh, T., Raya, R. M., Sternik, G., Tsai, H. J., Rodriguez-Esteban, C., Izpisua-Belmonte, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+Notch+signaling+pathway+precedes+heart+regeneration+in+zebrafish.">Activation of Notch signaling pathway precedes heart regeneration in zebrafish.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 11889-11895 (2003).</li><li>Smith, A., Avaron, F., Guay, D., Padhi, B. K., Akimenko, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+BMP+signaling+during+zebrafish+fin+regeneration+disrupts+fin+growth+and+scleroblasts+differentiation+and+function.">Inhibition of BMP signaling during zebrafish fin regeneration disrupts fin growth and scleroblasts differentiation and function.</a> Dev Biol. 299, 438-454 (2006).</li><li>Thummel, R., Li, L., Tanase, C., Sarras, M. P., Godwin, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+expression+pattern+and+function+between+zebrafish+hoxc13+orthologs:+recruitment+of+Hoxc13b+into+an+early+embryonic+role.">Differences in expression pattern and function between zebrafish hoxc13 orthologs: recruitment of Hoxc13b into an early embryonic role.</a> Dev. Biol. 274, 318-333 (2004).</li><li>Coonrod, S. A., Bolling, L. C., Wright, P. W., Visconti, P. E., Herr, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+morpholino+phenocopy+of+the+mouse+mos+mutation.">A morpholino phenocopy of the mouse mos mutation.</a> Genesis. 30, 198-200 (2001).</li><li>Heasman, J., Kofron, M., Wylie, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta-catenin+signaling+activity+dissected+in+the+early+Xenopus+embryo:+a+novel+antisense+approach.">Beta-catenin signaling activity dissected in the early Xenopus embryo: a novel antisense approach.</a> Dev. Biol. 222, 124-134 (2000).</li><li>Nasevicius, A., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+targeted+gene+knockdown+in+zebrafish.">Effective targeted gene knockdown in zebrafish.</a> Nat. Genet. 26, 216-2120 (2000).</li><li>Hoptak-Solga, A. D., Nielsen, S., Jain, I., Thummel, R., Hyde, D. R., Iovine, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin43+(GJA1)+is+required+in+the+population+of+dividing+cells+during+fin+regeneration.">Connexin43 (GJA1) is required in the population of dividing cells during fin regeneration.</a> Dev. Biol. 317, 541-548 (2008).</li><li>Thummel, R., Bai, S., Sarras, M. P., Song, P., McDermott, J., Brewer, J., Perry, M., Zhang, X., Hyde, D. R., Godwin, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+zebrafish+fin+regeneration+using+in+vivo+electroporation+of+morpholinos+against+fgfr1+and+msxb.">Inhibition of zebrafish fin regeneration using in vivo electroporation of morpholinos against fgfr1 and msxb.</a> Dev. Dyn. 235, 336-346 (2006).</li><li>Yin, V. P., Thomson, J. M., Thummel, R., Hyde, D. R., Hammond, S. M., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fgf-dependent+depletion+of+microRNA-133+promotes+appendage+regeneration+in+zebrafish.">Fgf-dependent depletion of microRNA-133 promotes appendage regeneration in zebrafish.</a> Genes Dev. 22, 728-733 (2008).</li><li>Tawk, M., Tuil, D., Torrente, Y., Vriz, S., Paulin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+gene+transfer+into+adult+fish:+a+new+tool+to+study+fin+regeneration.">High-efficiency gene transfer into adult fish: a new tool to study fin regeneration.</a> Genesis. 32, 27-31 (2002).</li></ol>

Vi har ingenting å avsløre.

Her beskriver vi et kraftig tap-av-funksjon tilnærming til betinget knockdown proteiner av interesse under fin tilvekst i voksen sebrafisk. Denne teknikken har blitt brukt til å studere gap koblingsbokser gener, signaliserer reseptorer, transkripsjonsfaktorer, og microRNAs under regenerativ fin utvekst 16, 20-22. Vi forventer at denne teknikken kan også brukes til å studere gener som kreves for sårheling og blastema formasjon ved å tilpasse teknikken. For eksempel, injisert vi og electroporated en kontroll Morpholino i mellomrommet mellom de beinete fin stråler på dorsal halvparten av fin før amputasjon (figur 7). Vi så amputert finnen umiddelbart distalt for injeksjon flyet. 24 hpa, observerte vi at Morpholino målrettede celler hadde migrert distalt for å danne både såret epitel og blastema (Figur 8), som indikerer at celler i løpet av disse tidlige stadiene av regenerering kan også Targeted. Teknikken har noen få bemerkelsesverdige begrensninger. For eksempel ikke fluorescens fra fluorescein tag ikke vedvare etter fiksering og behandling for immunhistokjemi, som gjør det umulig å korrelere en bestemt cellulær fenotype (dvs. celleproliferasjon) med mengden Morpholino tilstede i en celle. I tillegg har vi vært i stand til å konsekvent oppnå electroporation av plasmider inn i gjenfødelse halefinnen, selv om en tidligere gruppe gjorde rapportere vellykket electroporation av DNA inn i fin vev 23. Endelig har vi registrert at det Morpholino er bare effektivt for ~~~HEAD=NNS 48 timer etter 21 electroporation, som forbyr bruk av denne teknikken i sin nåværende form for testing gener involvert i differensieringen av nye celletyper. Ytterligere testing og modifisering av prosedyren kan overvinne disse dagens begrensninger. I tillegg er det mulig at denne teknikken kan brukeså teste proteiner involvert i celle migrasjon fra det underliggende vevet til blastema. For eksempel, injisert vi og electroporated en kontroll Morpholino inn begge sider av FIN (som beskrevet i figur 7) før amputasjon. Vi så amputert dorsal halvdel av fin umiddelbart distalt for injeksjon flyet og vi amputert den ventrale fin mye mer distalt. På 24 hpa, hadde Morpholino-positive celler på dorsal side migrert fra injeksjonsstedet til overliggende såret epitel og blastema. Men, det var ikke tilfelle på den ventrale siden (figur 9). Dette støtter ideen om at bare de cellene som ligger til grunn amputasjon flyet delta i regenerativ respons. Disse dataene tyder også på at proteiner antatt å være nødvendig for celle migrasjon kan testes ved hjelp av denne teknikken.

<table border="1"><tbody><tr><td> Navn på reagensen </td><td> Firma </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> CUY21-EDIT eller CUY21-SC Square wave electroporator </td><td> Protech International </td><td> CUY21EDIT eller CUY21SC </td><td> Begge enhetene fungerer for denne protokollen </td></tr><tr><td> 3 mm i diameter padle elektroder </td><td> Protech International </td><td> CUY 650-P3 </td><td></td></tr><tr><td> Morpholino </td><td> GeneTools, LLC </td><td></td><td> Morpholino bør spesialdesignet til din protein av interesse </td></tr><tr><td> 2-Phenoxyethanol </td><td> Sigma </td><td> 77861-1L </td><td> Anestesi, fortynnet 1:1000 i fisk system vann for prosedyre, 1:500 for aktiv dødshjelp </td></tr><tr><td> Micro-sprøytepå pumpe </td><td> Verden presisjonsinstrumenter </td><td> PV830 Pneumatisk PicoPump </td><td> Mange forskjellige mikroinjeksjon systemer kan brukes </td></tr><tr><td> Micro-manipulator </td><td> Verden presisjonsinstrumenter </td><td> MMJR </td><td> Høyrehendt (MMJL for venstrehendte) </td></tr><tr><td> Micro-injeksjonsnåler, 1,0 mm utvendig diameter </td><td> Verden presisjonsinstrumenter </td><td> 1B100F-4 </td><td> Dette er borsilikatglass kapillærene, trukket inn i en nål </td></tr><tr><td> Needle holder </td><td> Verden presisjonsinstrumenter </td><td> 5430-ALL </td><td> Pico dyser Kit, sørg for å innfelt den 1,0 mm pipetten pakning </td></tr><tr><td> Needle avtrekker </td><td> Sutter </td><td> P-97 </td><td> Andre mikropipette / nål pullers bør også arbeide </td></tr><tr><td> Microscope </td><td> Leica, Nikon, Zeiss ®s </td><td> Tallet varierer avhengig av produsenten </td><td> Enhver stereomikroskop med 20x optikk og evnen til å arbeide med micromanipulators </td></tr></tbody></table>

in vivo electroporation of morpholinos into the regenerating adult zebrafish tail fin

Visse arter av urodeles og teleost fisk kan regenerere sine vev. Sebrafisk har blitt en mye brukt modell for å studere spontan regenerering av voksne vev, for eksempel hjerte 1, netthinnen 2, ryggmarg 3, synsnerven 4, sensoriske hårceller 5, og 6 svømmeføtter. Sebrafisk FIN er en relativt enkel vedheng som er lett manipuleres til å studere flere stadier i epimorphic foryngelse. Klassisk, var fin gjenfødelse preget av tre distinkte stadier: sårtilheling, blastema formasjon, og fin utvekst. Etter amputere en del av fin, proliferates rundt epitel og migrerer over såret. Ved 33 ° C, skjer denne prosessen innen seks timer etter amputasjon (hPa, Figur 1B) 6,7. Deretter underliggende celler fra forskjellige linjene (ex. bein, blod, gliaceller, fibroblast) re-gå inn i cellen syklus å danne en proliferativ blastema, while overliggende epidermis fortsetter å spre seg (figur 1D) 8. Utvekst oppstår som celler proksimalt for blastema re-differensiere i sine respektive linjer for å danne nytt vev (figur 1E) 8. Avhengig av nivå amputasjonen, er full regenerering ferdig i en uke til en måned. Uttrykket av et stort antall gener familier, inkludert Wnt, Hox, FGF, MSX, retinsyre, ssh, hakk, bmp, og activin-beta A gener, er oppregulert under bestemte stadier av FIN regenerering 9-16. Imidlertid har rollene til disse genene og deres kodede proteiner under regenerering vært vanskelig å vurdere, med mindre en spesifikk hemmer for proteinet finnes 13, en temperatur-sensitiv mutant eksisterer eller en transgen dyr (enten overekspresjon villtype protein eller en dominerende -negative protein) ble generert 7,12. Vi utvikledeped en omvendt genetisk teknikk for å raskt og enkelt teste funksjonen av enhver genet under FIN gjenfødelse. Morpholino oligonukleotider er mye brukt til å studere tap av spesifikke proteiner i løpet av sebrafisk, Xenopus, kylling, og mus utvikling 17-19. Morpholinos basepair med en komplementær RNA sekvensen til enten blokk pre-mRNA spleising eller mRNA oversettelse. Vi beskriver en metode for å effektivt introdusere fluorescein-merket antisens morpholinos inn regenererende sebrafisk svømmeføtter til knockdown uttrykk av målet protein. Den Morpholino er mikro-injiseres i hvert blastema av regenererende sebrafisk halefinnen og electroporated i de omkringliggende cellene. Fluorescein gir denne prisen til electroporate den Morpholino og å visualisere Morpholino i fin vev. Denne protokollen tillater betinget protein knockdown å undersøke rollen av spesifikke proteiner under regenerativ fin utvekst. I Discussion, beskriver vi hvordan denne tilnærmingen kan tilpasses å studere rollen av spesifikke proteiner i løpet av sårtilheling eller blastema formasjon, samt en potensiell markør for celle migrasjon under blastema formasjon.

Watch this Scientific Journal Video about In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin at JoVE.com

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

Vi beskriver en metode for å betinget knockdown uttrykk for et mål protein i løpet av voksen sebrafisk fin tilvekst. Denne teknikken innebærer mikro-injisering og electroporating antisens oligonukleotid morpholinos inn fin vev, noe som gjør testing av protein rolle i ulike stadier av fin foryngelse, inkludert sårtilheling, blastema formasjon, og regenerativ utvekst.

In vivo electroporation av Morpholinos i Regenerating Adult sebrafisk Halefinner

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration ...

Research

JoVE Journal

Biology

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an ...

Single Cell Electroporation in vivo within the Intact Developing Brain

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing the delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact ...

Retro-orbital Injection in Adult Zebrafish

Drug treatment of whole animals is an essential tool in any model system for pharmacological and chemical genetic studies. Intravenous (IV) injection is ...

Dissection of Organs from the Adult Zebrafish

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental ...

Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, ...

Direct Delivery of MIF Morpholinos Into the Zebrafish Otocyst by Injection and Electroporation Affects Inner Ear Development

In recent years, electroporation has become a popular technique for in vivo transfection of DNA, RNA, and morpholinos into various tissues, including the ...

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

Dissection of the Adult Zebrafish Kidney

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

In vivo electroporation av Morpholinos til Adult sebrafisk Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

Gavaging Adult Zebrafish

Gavaging Adult Sebrafisk

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or ...