Name: monitoring the reductive and oxidative half-reactions of a flavin-dependent monooxygenase using stopped-flow spectrophotometry
Uploaded: 2012-03-18T14:00:00
Duration: 12 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Monitoring the Reductive and Oxidative Half-Reactions of a Flavin-Dependent Monooxygenase using Stopped-Flow Spectrophotometry at JoVE.com

البحثية التي تدعمها جائزة جبهة الخلاص الوطني MCB-1021384.

<ol>
	<li>Hissen, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Aspergillus+fumigatus+siderophore+biosynthetic+gene+sidA,+encoding+L&#45;ornithine+N5&#45;oxygenase,+is+required+for+virulence.">The Aspergillus fumigatus siderophore biosynthetic gene sidA, encoding L&#45;ornithine N5&#45;oxygenase, is required for virulence.</a> Infect. Immun. 73 (9), 5493-5503 (2005).</li><li>Chocklett, S. W., Sobrado, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspergillus+fumigatus+SidA+is+a+highly+specific+ornithine+hydroxylase+with+bound+flavin+cofactor.">Aspergillus fumigatus SidA is a highly specific ornithine hydroxylase with bound flavin cofactor.</a> Biochemistry. 49 (31), 6777-6783 (2010).</li><li>Mayfield, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+spectroscopic,+steady+state,+and+transient+kinetic+studies+of+a+representative+siderophore&#45;associated+flavin+monooxygenase.">Comprehensive spectroscopic, steady state, and transient kinetic studies of a representative siderophore&#45;associated flavin monooxygenase.</a> J. Biol. Chem. 285 (40), 30375-30388 (2010).</li><li>Fierke, C. A., Hammes, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+kinetic+approaches+to+enzyme+mechanisms.">Transient kinetic approaches to enzyme mechanisms.</a> Contemporary enzyme kinetics and mechanism. , (2009).</li><li>Palfey, B. A., McDonald, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+catalysis+in+flavin-dependent+monooxygenases.">Control of catalysis in flavin-dependent monooxygenases.</a> Arch. Biochem. Biophys. 493 (1), 26-26 (2010).</li><li>van Berkel, W. J. H., Kamerbeek, N. M., Fraaije, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flavoprotein+monooxygenases,+a+diverse+class+of+oxidative+biocatalysts.">Flavoprotein monooxygenases, a diverse class of oxidative biocatalysts.</a> J. Biotechnol. 124 (4), 670-689 (2006).</li><li>Chapman, S. K., Reid, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Flavoprotein Protocols. , (1999).</li><li>Sobrado, P., Fitzpatrick, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solvent+and+primary+deuterium+isotope+effects+show+that+lactate+CH+and+OH+bond+cleavage+are+concerted+in+Y254F+flavocytochrome+b2,+consistent+with+a+hydride+transfer+mechanism.">Solvent and primary deuterium isotope effects show that lactate CH and OH bond cleavage are concerted in Y254F flavocytochrome b2, consistent with a hydride transfer mechanism.</a> Biochemistry. 42, 15208-15214 (2003).</li><li>Kumar, S., Gawandi, V. B., Capito, N., Phillips, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substituent+effects+on+the+reaction+of+Î²-benzoylalanines+with+Pseudomonas+fluorescens+kynureninase.">Substituent effects on the reaction of Î²-benzoylalanines with Pseudomonas fluorescens kynureninase.</a> Biochemistry. 49 (36), 7909-7913 (2010).</li><li>Yun, D., Garc&#237;a-Serres, R., Chicalese, B. M., An, Y. H., Huynh, B. H., Bollinger, J. M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=(&#956;-1,2-Peroxo)diiron(III/III)+complex+as+a+precursor+to+the+diiron(III/IV)+intermediate+X+in+the+assembly+of+the+iron&#45;radical+cofactor+of+ribonucleotide+reductase+from+mouse.">(&#956;-1,2-Peroxo)diiron(III/III) complex as a precursor to the diiron(III/IV) intermediate X in the assembly of the iron&#45;radical cofactor of ribonucleotide reductase from mouse.</a> Biochemistry. 46 (7), 1925-1932 (2007).</li><li>Pennati, A., Zanetti, G., Aliverti, A., Gadda, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+salt+and+pH+on+the+reductive+half-reaction+of+Mycobacterium+tuberculosis+FprA+with+NADPH+Biochemistry.">Effect of salt and pH on the reductive half-reaction of Mycobacterium tuberculosis FprA with NADPH Biochemistry.</a> Biochemistry. 47 (11), 3418-3425 (2008).</li><li>Patil, P. V., Allou, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+protocatechuate+dioxygenase+for+maintaining+anaerobic+conditions+in+biochemical+experiments.">The use of protocatechuate dioxygenase for maintaining anaerobic conditions in biochemical experiments.</a> Analytical Biochemistry. 286 (2), 187-192 (2000).</li></ol>

ليس لدينا ما يكشف.

الإنزيمات التي تحفز تفاعلات الأكسدة والاختزال عادة ما تحتوي على العوامل المساعدة مثل وhemes flavins أن تخضع لتغييرات كبيرة خلال الامتصاصية دورة الحفاز. شكل المؤكسد للفلافين يقدم ماكسيما الامتصاصية في ~ 360 و 450 نانومتر، وعادة ما يتم رصد الحد من قبل بعد انخفاض الامتصاصية في 450 نانومتر 7. بشكل عام، وبعض السلع الوسيطة عابر موجودة ولكن شكل والاضمحلال بسرعة جدا بحيث لا يمكن قياسها في مطياف العادية. باستخدام Photophysics التطبيقية SX20 توقف تدفق طيفي (أو أدوات مماثلة)، فمن الممكن لقياس التغيرات الامتصاصية في مقياس الوقت ميلي ثانية واحدة (ميت مرة، 2 مللي ثانية). درس هنا نحن في الاختزالية والاكسدة نصف ردود فعل monooxygenase فلافين التي تعتمد على وسيدا و، نموذجا يحتذى. وتم تحديد سعر نقل هيدريد عن طريق قياس التغير في الامتصاصية في 452 نانومتر بعد خلط انزيم مع NADPH في الظروف اللاهوائية. في وقت لاحق، مع الميزهوكان (ه) من وضع خلط مزدوج وثيقة وقف التدفق، كان رد فعل لأول مرة انزيم مع NADPH، حتى تم تحقيق تخفيض كامل، ثم كانت مختلطة في خفض انزيم NADP + مجمع مع الأكسجين. بعد هذا الإجراء، فإنه من الممكن الكشف عن عابر وسيطة فلافين الاوكسيجين وقياس معدلات تكوين والاضمحلال. وتحديد هذه السلع الوسيطة توفر البيانات التجريبية حول طبيعة هذا النوع رد فعل في الحفز. في حالة وجود سيدا و، تشكيل C4a-hydroperoxyflavin (رصدها عادة في 370-380 نانومتر)، والذي هو نوع hydroxylating. وبالإضافة إلى ذلك، وقياس معدل ثابت من كل خطوة واحد يسمح للحصول على معلومات عن خطوة تحديد سعر للتفاعل ويساعد على إلقاء الضوء على آليات الحركية والكيميائية للانزيم. بشكل عام، يمكن استخدام نهج مماثل لflavoenzymes أخرى، أو البروتينات التي الامتصاصية التغييرات التي حدثت، مثل البروتينات التي تابععين الهيم، بيريدكسال فوسفات، أو غير هيم الحديد 8-10. وجود قيود على هذا الأسلوب هو أن هناك حاجة إلى كميات كبيرة من انزيم المنقى، ولكن يمكن التغلب على ذلك عن طريق استخدام نظام التعبير ذات العوائد المرتفعة. واحد يحدد تركيز بروتين الأمثل لأطياف تسجيل عن طريق استخدام ما يكفي من البروتين بحيث يمكن ملاحظة إشارة قوية بما فيه الكفاية، ولكن ليس كثيرا حتى لا يضيع هذا الانزيم. عادة، فإن أقل تركيز انزيم لفلافين التي تحتوي على الانزيمات المستخدمة في توقف تدفق التجارب هو 6-10 ميكرومتر (بعد خلط) ويتم تحديده باستخدام المقابلة معامل الانقراض ضرس من الانزيم. في حالة وجود سيدا و، النسبة المئوية للFAD انزيم ملزمة هو 50-65٪ 2. ويعتبر الاشتقاق بروتين كما نشط في هذه التجارب لأن العامل المساعد FAD المنضم هو ضروري لالحفز. ومن أوجه القصور الممكنة لهذا الأسلوب هو في حالة العمليات في انزيم يحدث بشكل أسرع من 2 مللي ثانية (الوقت الميت من التدفق توقف) لن يكون لاحظوا، ولكن الوتفيد التقارير يحرث الاستراتيجيات التي يمكن أن انخفضت معدلات للتغلب على هذه المشكلة. مثال واحد لهذا يتضمن استخدام تركيزات عالية كلوريد الصوديوم في رد فعل على اختزال + NADP فيريدوكسين-11. لتنقية الأكسجين من الدائرة تدفق تدفق توقفت في كثير من الأحيان خطوة صعبة في هذه التجربة وتتطلب اهتماما خاصا. يستخدم الجلوكوز أوكسيديز الجلوكوز، نظام الموصوفة هنا بنجاح في معظم المختبرات كما هو وسيلة فعالة وغير مكلفة. ومع ذلك، هناك بعض السلبيات التي تشمل إنتاج H 2 O 2 وبالنسبة لبعض التطبيقات وينبغي النظر في بدائل أخرى مثل نظام دي أكسيجيناز-protocatechuate protocatechuate 12. الاستفادة من علبة القفازات اللاهوائية يجعل من الاسهل لضمان الظروف اللاهوائية، ولكن ليس ضروريا. ويجب إزالة الأكسجين من دائرة تدفق تدفق توقف لاننا نريد ان يتم تخفيض الانزيم في غياب الأكسجين أو تتفاعل مع الأكسجين في تركيزق الذي نحدده نحن. وعلى الرغم من توقف التدفق هو في علبة القفازات، وهناك أكسجين في دائرة تدفق إذا كنا مخازن الهوائية في التجارب السابقة. بالإضافة إلى قياسات الامتصاصية، يمكن تنفيذ المقايسات ازدواج اللون مضان والتعميم في معمل توقف تدفق للPhotophysics التطبيقية SX20 مع الملحقات ذات الصلة.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> عام معدات المختبرات </td><td> شركة </td><td> فهرس العدد </td></tr><tr><td> فراغ مضخة </td><td> وولش </td><td> - </td></tr><tr><td> بوخنر قوارير </td><td> الصياد </td><td> 70340-500 </td></tr><tr><td> إثارة القضبان </td><td> الصياد </td><td> 14-512-129 </td></tr><tr><td> إثارة لوحات </td><td> الصياد </td><td> 11-100-49S </td></tr><tr><td> شلنك خطوط </td><td> Kontes زجاج </td><td> - </td></tr><tr><td> الأرجون دبابة </td><td> Airgas </td><td> AR UPC300 </td></tr><tr><td> النيتروجين دبابة </td><td> Airgas </td><td> NI200 </td></tr><tr><td> خزان النيتروجين، ودرجة نقاء عالية جدا </td><td> Airgas </td><td> NI UHP200 </td></tr><tr><td> خزان الأكسجين </td><td> Airgas </td><td> OX 40 </td></tr><tr><td> 5 توازن النيتروجين خزان الهيدروجين٪ </td><td> Airgas </td><td> X02NI95B200H998 </td></tr><tr><td> SX20 القديسأوب تدفق طيفي </td><td> AppliedPhotophysics </td><td> - </td></tr><tr><td> علبة القفازات </td><td> خجول </td><td> - </td></tr><tr><td> ماء الحمام </td><td> BRINKMANN لاودا </td><td> - </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> لوازم </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 50 مل BD الصقر أنابيب </td><td> الصياد </td><td> 14-432-23 </td></tr><tr><td> 15 مليلتر دينار بحريني الصقر مخروطي أنابيب </td><td> الصياد </td><td> 05-527-90 </td></tr><tr><td> 1.5 microcentrifuge إيبندورف أنابيب مل </td><td> الصياد </td><td> 05-402-18 </td></tr><tr><td> 50 و 25 قارورة زجاج مل </td><td> الصياد </td><td> 06-402 </td></tr><tr><td> سدادات المطاط </td><td> الصياد </td><td> 06-447H </td></tr><tr><td> الألومنيوم الاختام </td><td> الصياد </td><td> 06-406-15 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> ReagenTS </td><td></td><td></td></tr><tr><td> فوسفات البوتاسيوم، أحادى </td><td> الصياد </td><td> AC2714080025 </td></tr><tr><td> فوسفات البوتاسيوم، ثنائي القاعدة </td><td> الصياد </td><td> P288-500 </td></tr><tr><td> خلات الصوديوم </td><td> سيغما </td><td> S-2889 </td></tr><tr><td> أوكسيديز الجلوكوز من أ. النيجر </td><td> سيغما </td><td> G7141-250KU </td></tr><tr><td> D-جلوكوز </td><td> الصياد </td><td> D16-500 </td></tr><tr><td> β-NADPH </td><td> الصياد </td><td> ICN10116783 </td></tr><tr><td> L (+)-الأورنيثين هيدروكلوريد </td><td> الصياد </td><td> ICN10116783 </td></tr></tbody></table>

monitoring the reductive and oxidative half-reactions of a flavin-dependent monooxygenase using stopped-flow spectrophotometry

الرشاشية الدخناء حاملة الحديد A (سيدا) هو monooxygenase FAD المحتوية على أن يحفز الهيدروكسيل من الأورنيثين في التركيب الحيوي من siderophores hydroxamate التي تعتبر ضرورية لالفوعة (على سبيل المثال ferricrocin أو N &#39;، N &quot;، N&#39;&#39;&#39;-triacetylfusarinine C) 1. ويمكن تقسيم رد فعل يحفزه سيدا إلى الاختزالية والأكسدة ردود الفعل نصف (مخطط 1). وفي التخفيض نصف رد فعل، يتم تقليل FAD تتأكسد منضما إلى سيدا و، بواسطة NADPH 2،3. وفي رد فعل الأكسدة نصف والعامل المساعد انخفاض يتفاعل مع الأوكسجين الجزيئي لتشكيل المتوسطة C4a-hydroperoxyflavin، والذي ينقل الأكسجين إلى ذرة الأورنيثين. هنا، ونحن تصف إجراء لقياس معدلات وكشف أشكال مختلفة من الأطياف سيدا باستخدام أداة توقف تدفق مثبتة في 1 علبة القفازات اللاهوائية. في صك توقف التدفق، كميات صغيرة من المواد الداخلة في التفاعل وبسرعة متفاوتة، وبعد أن تم إيقاف تدفق من قبل اله حقنة توقف (الشكل 1)، وتسجل التغيرات الطيفية من الحل وضعت في زنزانة الملاحظة مع مرور الوقت. في الجزء الأول من التجربة، وتبين لنا كيف يمكننا استخدام أداة توقف التدفق في وضع واحد، حيث يتم قياسها بشكل مباشر على تخفيض اللاهوائية من فلافين في وسيدا و بواسطة NADPH. نحن نستخدم ثم إعدادات خلط مزدوج حيث لا هوائيا اول خفض لسيدا و NADPH بواسطة لفترة محددة من الوقت في حلقة الشيخوخة، ومن ثم كان رد فعل مع الأكسجين الجزيئي في الخلية مراقبة (الشكل 1). من أجل تنفيذ هذه التجربة، ومخازن اللاهوائية ضرورية لأنه عندما يتم رصد سوى التخفيض نصف رد فعل، أي الأوكسجين في الحلول وتتفاعل مع العامل المساعد فلافين انخفاض وتشكيل وسيطة C4a-hydroperoxyflavin التي من شأنها أن تتحلل في نهاية المطاف العودة الى فلافين المؤكسد . فإن هذا لن تسمح للمستخدم لقياس بدقة معدلات انخفاض منذ لن يكون هناك دوران كامل للenzyme. عندما يجب أن تجرى حاليا دراسة الأكسدة نصف رد فعل يتم تخفيض الانزيم في غياب الأوكسجين بحيث يتم فقط لاحظت الخطوات بين الحد والأكسدة. واحد من المخازن المؤقتة المستخدمة في هذه التجربة هو الاوكسجين مشبعة حتى نتمكن من دراسة الأكسدة نصف رد فعل على تركيزات أعلى من الأوكسجين. هذه غالبا ما تكون الإجراءات المنفذة وعند دراسة إما الاختزالية أو مؤكسد نصف ردود فعل مع فلافين التي تحتوي على monooxygenases. مقياس الوقت من التجارب السابقة للحالة استقرار أداء مع التدفق توقف هو ميلي ثانية إلى ثانية، والتي تسمح بتحديد سعر الثوابت الجوهرية وكشف وتحديد وسيطة في رد فعل 4. ويمكن تطبيق الإجراءات المذكورة هنا لmonooxygenases فلافين التي تعتمد على الآخرين. 5،6

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring the Reductive and Oxidative Half-Reactions of a Flavin-Dependent Monooxygenase using Stopped-Flow Spectrophotometry at JoVE.com

Monitoring the Reductive and Oxidative Half-Reactions of a Flavin-Dependent Monooxygenase using Stopped-Flow Spectrophotometry

وصفنا استخدام أداة توقف تدفق للتحقيق في كل من الاختزالية والاكسدة نصف ردود فعل<em&gt; الرشاشية الدخناء</em&gt; حاملة الحديد A (سيدا)، والتي تعتمد على monooxygenase فلافين. نعرض ثم الأطياف المقابلة لالأنواع في رد فعل من سيدا، ونحن حساب ثوابت معدل لتشكيلها.

رصد انتقاصية ومؤكسد نصف ردود فعل من Monooxygenase فلافين التي تعتمد على استخدام توقف تدفق الطيفي

Aspergillus fumigatus siderophore A (SidA) is an FAD-containing monooxygenase that catalyzes the hydroxylation of ornithine in the biosynthesis of ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

عالية الإنتاجية مولد بروتين تعبير باستخدام منصة ميكروفلويديك

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Monitoring the Wall Mechanics During Stent Deployment in a Vessel

رصد ميكانيكا الحائط أثناء النشر ستينت في وعاء

Clinical trials have reported different restenosis rates for various stent designs1. It is speculated that stent-induced strain concentrations on the ...

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

عدم الاتصال، تسمية خالية من رصد خلايا المصفوفة خارج الخلية، وباستخدام التحليل الطيفي رامان

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

Mass Cytometry: Protocol for Daily Tuning and Running Cell Samples on a CyTOF Mass Cytometer

الخلوي الجماعي: بروتوكول لضبط اليومية وعينات الخلايا تشغيل عداد الكريات الشامل على CyTOF

In recent years, the rapid analysis of single cells has commonly been performed using flow cytometry and fluorescently-labeled antibodies. However, the ...

Surgical Technique for the Implantation of Tissue Engineered Vascular Grafts and Subsequent In Vivo Monitoring

Surgical Technique for the Implantation of Tissue Engineered Vascular Grafts and Subsequent In Vivo Monitoring

تقنية جراحية لزرع الأنسجة المهندسة الأوعية الدموية الطعوم واللاحقة<em&gt; في فيفو</em&gt; الرصد

The development of Tissue Engineered Vessels (TEVs) is advanced by the ability to routinely and effectively implant TEVs (4-5 mm in diameter) into a large ...

Real Time Monitoring of Intracellular Bile Acid Dynamics Using a Genetically Encoded FRET-based Bile Acid Sensor

رصد في الوقت الحقيقي من بين الخلايا الصفراء حمض حيوية باستخدام حمض الصفراء الاستشعار القائمة على الحنق ترميز وراثيا

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. ...

Intra-cardiac Side-Firing Light Catheter for Monitoring Cellular Metabolism using Transmural Absorbance Spectroscopy of Perfused Mammalian Hearts

القسطرة الخفيفة داخل القلب للإشعال الجانبي لرصد الأيض الخلوي باستخدام مطياف الامتصاص عبر الجدارية لقلوب الثدييات المنصهرة

Absorbance spectroscopy of cardiac muscle provides non-destructive assessment of cytosolic and mitochondrial oxygenation via myoglobin and cytochrome ...

Preclinical Cardiac Electrophysiology Assessment by Dual Voltage and Calcium Optical Mapping of Human Organotypic Cardiac Slices

تقييم الكهربائيات القلبية قبل الاحتكين بواسطة الجهد المزدوج ورسم الخرائط البصرية الكالسيوم لشرائح القلب العضوية البشرية

Human cardiac slice preparations have recently been developed as a platform for human physiology studies and therapy testing to bridge the gap between ...

Imaging and Quantification of the Area of Fast-Moving Microbubbles Using a High-Speed Camera and Image Analysis

التصوير والتدين الكمي لمنطقة الزبلات الدقيقة سريعة الحركة باستخدام كاميرا عالية السرعة وتحليل الصور

An experimental and image analysis technique is presented for imaging cavitation bubbles and calculating their area. The high-speed imaging experimental ...

Labeling of Extracellular Vesicles for Monitoring Migration and Uptake in Cartilage Explants

وضع العلامات على الحويصلات خارج الخلية لرصد الهجرة والإقبال في الغضاريف Explants

Extracellular vesicles (EVs) are used in different studies to prove their potential as a cell-free treatment due to their cargo derived from their ...