Name: monitoring the reductive and oxidative half-reactions of a flavin-dependent monooxygenase using stopped-flow spectrophotometry
Uploaded: 2012-03-18T14:00:00
Duration: 12 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Monitoring the Reductive and Oxidative Half-Reactions of a Flavin-Dependent Monooxygenase using Stopped-Flow Spectrophotometry at JoVE.com

Forskning støttet af NSF pris MCB-1.021.384.

1. Fremstillinq af Anaerob puffer <ol><li> Forberede en L af 100 mM kaliumphosphatpuffer, pH 7,5. Hæld 250 ml af pufferen til en 500 mL Buchner-kolbe med en omrører. </li><li> Kolben med en gummiprop og placere den på en røre plade. Forbinde den korte rør i kolben til et Schlenk linie. </li><li> Afgasse bufferen under vakuum i 5 timer ved stuetemperatur under omrøring. I løbet af denne tidsperiode udføre 5 konsekutive runder af vakuum afgasnings-og skylning med argon hver time. </li><li> Skyl kolben med argon i 10 sekunder og tag det fra vakuummanifolden. Kolben anbringes inde i handskekassen. </li><li> Efter at kolben åben i handskekassen natten over med kraftig omrystning. </li></ol> 2. At fjerne oxygen fra stopped-flow system <ol><li> Forberede en L 0,1 M natriumacetat, pH 5,0. Hæld 125 ml af denne puffer i en 250 ml Buchner-kolbe og udføre trin 1,2-1,4. </li><li> Der afvejes 5mg glucoseoxidase fra Aspergillus niger (181.300 U / g) og 0,9 g glucose ved anvendelse af en 1,5 ml Eppendorf-rør og 50 ml Falcon konisk rør, hhv. Placer begge beholdere i handskerummet. </li><li> Opløs glucoseoxidase og glucose i 50 ml anaerob 0,1 M natriumacetat, pH 5,0 (slutkoncentrationer på 18,13 U / ml og 100 mM). Fylde reservoiret sprøjter med denne opløsning (figur 1). </li><li> Sørg for, at drive ventilerne er i &quot;load&quot; og udfylder de drev sprøjterne (figur 1). Drej F ventil til &quot;drive&quot; position. Tøm stoppet sprøjten ved at klikke på Tøm i Pro-Data kontrol software. Skubbe buffer fra drevet sprøjte F gennem strømningskredsløbet ved manuelt at hæve den tilsvarende drevet stempel. Gentag dette trin ti gange i alt. Udfør den samme procedure med de tre andre drev sprøjter. Vent en time. </li><li> Erstatte opløsning af reservoiret sprøjter med den samme buffer contaiNing glucoseoxidase og glucose. Gentag trin 2.4. </li><li> Gentag trin 2,5 og lad opløsningen stå i strømmen systemet natten. </li><li> Efter inkubation natten over, trin gentages 2,5. </li></ol> 3. Fremstillinq af iltmættet puffer <ol><li> Fremstilling af 100 mM kaliumphosphatpuffer (pH 7,5) og hældes 50 ml i en 50-ml hætteglas med en omrører. Luk hætteglasset med en Wheaton prop og en Wheaton aluminiumforsegling. </li><li> Placer hætteglasset på is. Nedsænke en lang nål forbundet til en tank indeholdende 100% oxygen i opløsningen. Indsætte et andet kort nål gennem proppen i hætteglasset som en ventil. </li><li> Boble opløsningen med 100% oxygen i 1 time under omrøring. </li><li> Fjern først den korte nålen fra hætteglasset og vent 10 sekunder, før du fjerner den lange kanyle. Placer den lukkede hætteglasset i handskerummet. </li></ol> 4. Fremstillinq af NADPH opløsning <ol><li> Afvej 1 mg NADPH i et 1,5 ml Eppendorf-rør og anbringes it ind i handskekassen. </li><li> Opløs NADPH i 300 pi anaerob 100 mM kaliumphosphatpuffer, pH 7,5. Fjernelse 30 ul af denne opløsning fra handskerummet at bestemme NADPH koncentrationen med et spektrofotometer (∈ 340 nm = 6270 M-1 cm-1). </li></ol> 5. Fjernelse af oxygen fra enzymopløsningen <ol><li> Tag 400 pi enzym-stamopløsning fra fryseren og tø i handskekassen. Den enzym-stamopløsning (360 uM) blev i forvejen fremstillet i 100 mM kaliumphosphatbuffer (pH 7,5) indeholdende 100 mM NaCl, og frosset i flydende nitrogen. </li><li> Overfør enzymopløsningen i et 25 ml-hætteglas med en omrører, Luk hætteglasset med en Wheaton prop og en Wheaton aluminiumshætte og fjerne fra handskeboksen. </li><li> Anbring hætteglasset på is og forbinde det til en Schlenk linie ved at indsætte en nål gennem proppen i hætteglasset. </li><li> Afgasse enzymopløsning ved at udføre 5 konsekutive runder afvakuum afgasning og skylning med argon hvert 20. minut i 1 time. </li><li> Skyl hætteglasset med argon i 10 sekunder og tag det fra vakuummanifolden. Anbring hætteglasset på is inde i handskekassen. </li></ol> 6. Reduktiv Half-reaktion: Overvågning Flavin Reduktion <ol><li> Klargør stopped-flow instrument og Pro-Data styreprogrammel til engangsbrug blande-mode følge producentens protokol. </li><li> Tænde en cirkulerende vandbad (15 ° C). Fjerne oxygen fra vandet ved at boble nitrogen igennem i 20 minutter. Dette forhindrer oxygen kontaminering via strømningskredsløbet. </li><li> Holde temperaturen af ​​de trækkende sprøjter og observation cellen ved 15 ° C ved at forbinde vandbadet hus stopped-flow til den cirkulerende bad. </li><li> I vinduet Kontrolpanel af Pro-Data software til udvalgte Photodiode Array, ekstern trigger (for at aktivere stopped-flow drift), og Logarithmic skala. </li><li> Start Pro-Data viewer software og definere det bibliotek, hvor de data, filer vil blive gemt. </li><li> Erstatte opløsning af reservoiret sprøjter C og F med anaerob 100 mM kaliumphosphatpuffer (pH 7,5). Dreje C og F ventiler til &quot;drive&quot; position. Tøm stoppet sprøjten ved at klikke på Tøm i Pro-Data kontrol software. Skubbe pufferen fra begge drevet sprøjter gennem strømningskredsløbet ved manuelt at hæve tilsvarende drev ram fem gange i alt (på tom før hver bevægelse af stemplet). </li><li> For at sikre, at glucoseoxidase er blevet fjernet fuldstændigt fra strømningskredsløbet, udføre trin 6.6 fire gange i alt. </li><li> Klik på Baseline i Pro-Data kontrol software. </li><li> Bland 100 pi enzym-stamopløsning med 1100 pi anaerob 100 mM kaliumphosphatpuffer (slutkoncentration efter blanding i standses strømmen af ​​15 uM). </li><li> Erstatte opløsning af reservoiret SYRinge F med enzymopløsning. Drej F ventil til &quot;drive&quot; position. Tøm stoppet sprøjten ved at klikke på Tøm i Pro-Data kontrol software. Skubbe enzymopløsning fra drev sprøjte F gennem strømningskredsløbet ved manuelt at hæve den tilsvarende drevet stempel. Udfør denne tre gange i alt. I Pro-data styringssoftware, der erhvervelse tid til 60 sek. </li><li> Sikre, at begge drevet sprøjter fyldt med deres tilsvarende opløsninger og drevet væddere er i kontakt med drevet sprøjte stemplerne. Drej begge ventiler til &quot;drive&quot; position og klik på Hent i Pro-Data kontrol software til at udføre drevet. Gentag dette trin to gange mere for at opnå data i tre eksemplarer. Dette giver spektre af den oxiderede form af enzymet. </li><li> Ved hjælp af en 452 nm værdi opnået fra drevene bestemme den enzymkoncentrationen før blanding (E 452 nm = 13.700 M-1cm-1) og forberede 4 ml af en NADPH Solution 1,5 gange mere koncentreret. </li><li> Erstatte opløsning af reservoiret sprøjte C med NADPH opløsning og tomme og fyldes stop sprøjten tre gange som beskrevet i 6,10. </li><li> Gentag trin 6,11. Dette giver spektre under reduktionen af ​​enzymet. </li></ol> 7. Oxidativ Half-reaktion: Overvågning Flavin Oxidation <ol><li> Klargør stopped-flow instrument og Pro-Data styreprogrammel til dobbelt blande-mode følge producentens protokol. </li><li> Gentage trin 6,2-6,5. </li><li> Erstatte opløsningen i de fire reservoir sprøjter med anaerob 100 mM kaliumphosphatpuffer (pH 7,5). Drej F ventil til &quot;drive&quot; position. Tøm stoppet sprøjten ved at klikke på Tøm i Pro-Data kontrol software. Skubbe pufferen fra drevet sprøjten F gennem strømningskredsløbet ved manuelt at hæve den tilsvarende drevet stempel. Udfør dette trin fem gange i alt med hvert drev sprøjte. </li><li> Udfør trin 7.3 fire gange i total fuldstændigt fjerne indholdet fra strømningskredsløbet. </li><li> Klik på Baseline i Pro-Data kontrol software. </li><li> Bland 200 pi enzym-stamopløsning med 1000 pi anaerob 100 mM kaliumphosphatpuffer (slutkoncentration efter blanding i standses strømmen af ​​15 uM). </li><li> Erstatte opløsning af reservoiret sprøjte A med enzymopløsning. Dreje en ventil til &quot;drive&quot; position. Tøm stoppet sprøjten ved at klikke på Tøm i Pro-Data kontrol software. Skubbe enzymopløsning fra drev sprøjte A gennem strømningskredsløbet ved manuelt at hæve den tilsvarende drevet stempel. Udfør dette trin tre gange i alt. I Pro-Data kontrol software, indstille tidsforsinkelsen til 0,5 s og erhvervelse tid til 60 sek. </li><li> Sørg for, at alle drev sprøjter fyldt med deres tilsvarende løsninger og drevet væddere er i kontakt med drevet sprøjte stempler. Drej alle ventiler til &quot;drev&quot; position og klik erhverve i Pro-Daten kontrol software for at udføre drevet. Gentag dette trin to gange for at få data i tre eksemplarer. Dette giver spektre af den oxiderede form af enzymet. </li><li> Erstatte opløsning af reservoiret sprøjte B med en NADPH opløsning 1,5 gange mere koncentreret end den enzymopløsning i sprøjten A. Drej B ventilen til &quot;drive&quot; position og tomme og fyldes stop sprøjten tre gange som beskrevet i 7.7. </li><li> Erstatte opløsning af reservoiret sprøjte C med oxygeneret puffer. Drej C ventilen til &quot;drive&quot; position og tømme og refill stop sprøjte tre gange som beskrevet i 7,7. I Pro-Data kontrol software, skal du indstille forsinkelsen og erhvervelse tid på 15 og 900 s, hhv. </li><li> Gentag trin 7.8. Dette giver spektre under reoxidering af det fuldt reduceret enzym. </li></ol> 8. Dataanalyse <ol><li> Start Pro-Data konverter software. Klik på ikonet, og vælg Gem i ProDataCSV. </li><li> Åbentdet bibliotek, hvor de datafiler, blev opbevaret. Træk filer til APL Pro-Data konverter vinduet. Dataene gemmes automatisk som CSV format filer i samme mappe. </li><li> Åbn CSV format filer ved hjælp af Microsoft Excel (Microsoft, Redmond, WA, USA). Normalisere baseline af stopped-flow-spor ved at trække tilsvarende absorption ved 700 nm. </li><li> Analysere korrigerede spor med KaleidaGraph (Synergy Software, Reading, PA) ved at anbringe afbildning af absorbansen ved den tilsvarende maksimale versus tid til den passende eksponentiel funktion. Som vist i figur 2B, at absorbansen ved 452 nm blev plottet som en funktion af tid for at bestemme hastigheden af flavin reduktion efter blanding af enzymet og NADPH i stopped-flow instrument. I dette tilfælde blev den bedste pasform af data opnået ved hjælp af en dobbelt eksponentiel ligning og satser på 0,65 og 0,23 s -1 blev beregnet for den første og anden fase af den reduktion, respectively. At bestemme hastigheden for dannelse af C4a-hydroperoxyflavin mellemproduktet og reoxidering efter reaktion af den reducerede enzymet med oxygen, analyserede vi stopped-flow spor ved 380 og 452 nm (figur 3B). Anvendelse af en enkelt eksponentiel ligning vi beregnet hastigheder på 1,4 og 0,006 s-1 til det første og andet trin af den oxidative halv-reaktion, hhv. </li></ol> 9. Repræsentative resultater Resultaterne fra eksperimenterne beskrevet i de foregående afsnit viser, hvordan den reduktive halv-reaktion af en f Sida kan overvåges ved at måle ændringerne i absorbans ved 452 nm, hvilket svarer til ændringer i redoxtilstanden af flavin. Hastigheden af dette trin kan bestemmes ved at tilpasse dataene til den passende ligning (figur 2, trin 8.4). Den opnåede reduktion hastighed (0,65 s-1) svarer til kcat beregnet tilsteady-state forsøg 2, hvilket antyder, at reduktionen er det hastighedsbestemmende trin af reaktionen. At drage fordel af det dobbelte blande-mode af stopped-flow, kan hastigheden for oxidation og mellemprodukterne i denne halv-reaktion bestemmes (figur 3, Trin 8.4). I reaktionen katalyseres af en f Sida er C4a-hydroperoxyflavin klart påvist (λ max 380 nm), og hastigheden for dannelse og nedbrydning kan beregnes. Den langsomme sats af den opnåede genoxidation (0,006 s -1) angiver, at C4a-hydroperoxyflavin er meget stabil i fravær ornithin. <img alt="Skema 1" src="/files/ftp_upload/3803/3803scheme1.jpg" /> Skema 1. Mechanism A f Sida. Den isoallozaxine ring FAD cofaktor er vist. Den oxiderede flavin (A) binder til NADPH (B) og reagerer til dannelse af reduceret flavin og NADP + (C). Efter reaktion med molekylært oxygen og binding afornithin er C4a-hydroperoxyflavin dannet (D). Dette er hydroxylering arter. Efter hydroxylering af ornithin, skal hydroxyflavin (E) dehydreres til dannelse af oxideret enzym. NADP + forbliver bundet gennem den katalytiske cyklus, og er den sidste, der skal frigives (F). <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/3803/3803fig1.jpg" /> Figur 1. Den stopped-flow instrument. A) et billede af komponenterne i Applied Photophysics SX20 stopped-flow-spektrofotometer. B) Billede af prøven aggregatet. C) Skema af strømningskredsløbet i dobbelt blande-mode. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/3803/3803fig2.jpg" /> Figur 2. Anaerob reduktion af Sida med NADPH i stopped-flow instrument. A) spektrale ændringer registreret efter blanding af lige volumener af 30 uM Sida og 45 uM NADPH. Den første spektrum (oxideret Sida), og sidste spektrum (fuldt reduceret SidA) er fremhævet i blå og rød, hhv. B) Absorbans spor ved 452 nm registreres som en funktion af tiden. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/3803/3803fig3.jpg" /> Figur 3. Oxidation af Sida i stopped-flow instrument. A) spektrale ændringer registreret efter blanding af lige volumener af den fuldt reducerede Sida og oxygenerede puffer. Slutkoncentrationerne var 15 uM Sida, 22,5 uM NADPH, og 0,95 mM oxygen. Spektret registreret ved 0,034, 4,268, og 727,494 s svarer til den fuldt reducerede enzym, C4a-hydroperoxyflavin mellemprodukt (λ max 380 nm), og det oxiderede enzym (λ max 450 nm), hhv. B) Absorbans spor på 382 og 452 nm registreres som en funktion af tiden.

<ol>
	<li>Hissen, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Aspergillus+fumigatus+siderophore+biosynthetic+gene+sidA,+encoding+L&#45;ornithine+N5&#45;oxygenase,+is+required+for+virulence.">The Aspergillus fumigatus siderophore biosynthetic gene sidA, encoding L&#45;ornithine N5&#45;oxygenase, is required for virulence.</a> Infect. Immun. 73 (9), 5493-5503 (2005).</li><li>Chocklett, S. W., Sobrado, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspergillus+fumigatus+SidA+is+a+highly+specific+ornithine+hydroxylase+with+bound+flavin+cofactor.">Aspergillus fumigatus SidA is a highly specific ornithine hydroxylase with bound flavin cofactor.</a> Biochemistry. 49 (31), 6777-6783 (2010).</li><li>Mayfield, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+spectroscopic,+steady+state,+and+transient+kinetic+studies+of+a+representative+siderophore&#45;associated+flavin+monooxygenase.">Comprehensive spectroscopic, steady state, and transient kinetic studies of a representative siderophore&#45;associated flavin monooxygenase.</a> J. Biol. Chem. 285 (40), 30375-30388 (2010).</li><li>Fierke, C. A., Hammes, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+kinetic+approaches+to+enzyme+mechanisms.">Transient kinetic approaches to enzyme mechanisms.</a> Contemporary enzyme kinetics and mechanism. , (2009).</li><li>Palfey, B. A., McDonald, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+catalysis+in+flavin-dependent+monooxygenases.">Control of catalysis in flavin-dependent monooxygenases.</a> Arch. Biochem. Biophys. 493 (1), 26-26 (2010).</li><li>van Berkel, W. J. H., Kamerbeek, N. M., Fraaije, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flavoprotein+monooxygenases,+a+diverse+class+of+oxidative+biocatalysts.">Flavoprotein monooxygenases, a diverse class of oxidative biocatalysts.</a> J. Biotechnol. 124 (4), 670-689 (2006).</li><li>Chapman, S. K., Reid, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Flavoprotein Protocols. , (1999).</li><li>Sobrado, P., Fitzpatrick, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solvent+and+primary+deuterium+isotope+effects+show+that+lactate+CH+and+OH+bond+cleavage+are+concerted+in+Y254F+flavocytochrome+b2,+consistent+with+a+hydride+transfer+mechanism.">Solvent and primary deuterium isotope effects show that lactate CH and OH bond cleavage are concerted in Y254F flavocytochrome b2, consistent with a hydride transfer mechanism.</a> Biochemistry. 42, 15208-15214 (2003).</li><li>Kumar, S., Gawandi, V. B., Capito, N., Phillips, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substituent+effects+on+the+reaction+of+Î²-benzoylalanines+with+Pseudomonas+fluorescens+kynureninase.">Substituent effects on the reaction of Î²-benzoylalanines with Pseudomonas fluorescens kynureninase.</a> Biochemistry. 49 (36), 7909-7913 (2010).</li><li>Yun, D., Garc&#237;a-Serres, R., Chicalese, B. M., An, Y. H., Huynh, B. H., Bollinger, J. M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=(&#956;-1,2-Peroxo)diiron(III/III)+complex+as+a+precursor+to+the+diiron(III/IV)+intermediate+X+in+the+assembly+of+the+iron&#45;radical+cofactor+of+ribonucleotide+reductase+from+mouse.">(&#956;-1,2-Peroxo)diiron(III/III) complex as a precursor to the diiron(III/IV) intermediate X in the assembly of the iron&#45;radical cofactor of ribonucleotide reductase from mouse.</a> Biochemistry. 46 (7), 1925-1932 (2007).</li><li>Pennati, A., Zanetti, G., Aliverti, A., Gadda, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+salt+and+pH+on+the+reductive+half-reaction+of+Mycobacterium+tuberculosis+FprA+with+NADPH+Biochemistry.">Effect of salt and pH on the reductive half-reaction of Mycobacterium tuberculosis FprA with NADPH Biochemistry.</a> Biochemistry. 47 (11), 3418-3425 (2008).</li><li>Patil, P. V., Allou, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+protocatechuate+dioxygenase+for+maintaining+anaerobic+conditions+in+biochemical+experiments.">The use of protocatechuate dioxygenase for maintaining anaerobic conditions in biochemical experiments.</a> Analytical Biochemistry. 286 (2), 187-192 (2000).</li></ol>

Vi har intet at afsløre.

Enzymer, der katalyserer redoxreaktioner sædvanligvis indeholde cofaktorer såsom hæm&#39;er og flaviner, der undergår væsentlig absorbansændringer under den katalytiske cyklus. Den oxiderede form af flavin viser absorbansen maksima ved ~ 360 og 450 nm, og reduktion er typisk overvåget ved at følge absorbansen fald ved 450 nm 7. I almindelighed er nogle forbigående mellemprodukter til stede, men form og forfald for hurtigt til at blive målt i regelmæssige spektrofotometre. Anvendelse af Applied Photophysics SX20 stopped-flow spektrofotometer (eller lignende instrumenter), er det muligt at måle absorbans ændringer i millisekund tidsskala (døde-tid, 2 ms). Her studerede de reduktive og oxidative halve reaktioner flavin-afhængige monooxygenase A f Sida, der tjener som model. Hastigheden af ​​hydrid overførsel blev bestemt ved at måle ændringen i absorbans ved 452 nm efter tilsætningen af ​​enzymet med NADPH under anaerobe betingelser. Efterfølgende under advantage af den dobbelte blande-mode af stopped-flow instrument blev enzymet først omsættes med NADPH, indtil fuldstændig reduktion blev opnået, derefter reduceret enzym-NADP +-kompleks blev blandet med oxygen. Efter denne procedure, er det muligt at detektere forbigående oxygenerede Flavin mellemprodukter og til at måle satser for dannelse og forfald. Identifikationen af ​​disse mellemprodukter tilvejebringer eksperimentelle data om arten af ​​de reagerende arter katalyse. I tilfælde af f Sida, dannelsen af C4a-hydroperoxyflavin (typisk overvåget ved 370-380 nm), hvilket er den hydroxylering arter. Desuden tillader måling af hastighedskonstanten for hvert trin at man opnår information om den hastighedsbestemmende trin af reaktionen og hjælpe til at belyse de kinetiske og kemiske mekanismer af enzymet. I almindelighed kan tilsvarende fremgangsmåder kan anvendes til andre flavoenzymes eller proteiner som absorbansændringer forekom, såsom proteiner, contain hæm, pyridoxal-phosphat, eller ikke-hæm-jern 8-10. En begrænsning ved denne metode er, at store mængder af oprenset enzym er påkrævet, men dette kan overvindes ved anvendelse af et ekspressionssystem med høje udbytter. Man bestemmer den optimale proteinkoncentration til optagelse spektre ved anvendelse af nok protein, således at et stærkt signal kan observeres, men ikke for meget, så at enzymet ikke er spildt. Typisk den laveste enzymkoncentrationen for flavin-holdige enzymer, der anvendes i stopped-flow eksperimenter er 6-10 um (efter blanding) og bestemmes ved den tilsvarende molære ekstinktionskoefficient af enzymet. I tilfælde af f Sida, er procentdelen af enzymet er bundet FAD 50-65% 2. Apo-protein betragtes som inaktive i disse eksperimenter, fordi en bundet FAD cofaktor er nødvendig for katalyse. En anden mulig begrænsning ved denne metode er, hvis processer i en enzym forekommer hurtigere end 2 ms (dødtiden af ​​stopped-flow), vil de ikke blive observeret, men there er rapporteret strategier, hvor satser kan nedsættes for at overvinde dette problem. Et eksempel på dette omfatter at anvende en høj NaCI-koncentration på reaktionen af en ferredoxin-NADP + reduktase 11. Vaskning af oxygen fra strømningskredsløb af stopped-flow er ofte en vanskelig trin i dette eksperiment, og kræver særlig opmærksomhed. Den glucoseoxidase-glucose er beskrevet her er anvendt med succes i de fleste laboratorier da det er en effektiv og billig fremgangsmåde. Der er imidlertid visse ulemper, som omfatter fremstilling af H2O 2 og til nogle anvendelser andre alternativer såsom protocatechuate dioxygenase-protocatechuate bør overvejes 12. Anvendelsen af ​​en anaerob handskekasse gør det lettere at sikre anaerobe betingelser, men er ikke væsentligt. Oxygen skal fjernes fra strømningskredsløb af stopped-flow, som vi vil enzymet at blive reduceret i fravær af oxygen eller reagere med oxygen i en koncentrations, som vi angiver. Selv om den stopped-flow er i handskekassen, der er oxygen i strømningskredsløbet, hvis vi anvendt aerobe puffere i tidligere eksperimenter. Ud over absorbansmålinger, kan fluorescens og cirkulær dichroisme assays udføres i Applied Photophysics SX20 stopped-flow spektrofotometer med de tilsvarende tilbehør.

<table border="1"><tbody><tr><td> Almindeligt laboratorieudstyr </td><td> Firma </td><td> Katalognr </td></tr><tr><td> Vakuumpumpe </td><td> Welch </td><td> - </td></tr><tr><td> Büchner kolber </td><td> Fisher </td><td> 70340-500 </td></tr><tr><td> Stir barer </td><td> Fisher </td><td> 14-512-129 </td></tr><tr><td> Stir plader </td><td> Fisher </td><td> 11-100-49S </td></tr><tr><td> Schlenk-linjer </td><td> Kontes Glass </td><td> - </td></tr><tr><td> Argon tanken </td><td> Airgas </td><td> AR UPC300 </td></tr><tr><td> Nitrogentanken </td><td> Airgas </td><td> NI200 </td></tr><tr><td> Nitrogentanken, ultra høj renhedsgrad </td><td> Airgas </td><td> NI UHP200 </td></tr><tr><td> Oxygen tanken </td><td> Airgas </td><td> OX 40 </td></tr><tr><td> 5% hydrogenperoxid balance nitrogentanken </td><td> Airgas </td><td> X02NI95B200H998 </td></tr><tr><td> SX20 Stopped-flow spektrofotometer </td><td> AppliedPhotophysics </td><td> - </td></tr><tr><td> Handskerum </td><td> Coy </td><td> - </td></tr><tr><td> Vandbad </td><td> Brinkmann Lauda </td><td> - </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tilbehør </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 50 ml BD Falcon-rør </td><td> Fisher </td><td> 14-432-23 </td></tr><tr><td> 15 ml BD Falcon koniske rør </td><td> Fisher </td><td> 05-527-90 </td></tr><tr><td> 1,5 ml Eppendorf mikrocentrifugerør </td><td> Fisher </td><td> 05-402-18 </td></tr><tr><td> 50 og 25 ml hætteglas </td><td> Fisher </td><td> 06-402 </td></tr><tr><td> Gummipropper </td><td> Fisher </td><td> 06-447H </td></tr><tr><td> Aluminiumforseglinger </td><td> Fisher </td><td> 06-406-15 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Reagensts </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Kaliumphosphat, monobasisk </td><td> Fisher </td><td> AC2714080025 </td></tr><tr><td> Kaliumphosphat, dibasisk </td><td> Fisher </td><td> P288-500 </td></tr><tr><td> Natriumacetat </td><td> Sigma </td><td> S-2889 </td></tr><tr><td> Glucoseoxidase fra A. niger </td><td> Sigma </td><td> G7141-250KU </td></tr><tr><td> D-glucose </td><td> Fisher </td><td> D16-500 </td></tr><tr><td> β-NADPH </td><td> Fisher </td><td> ICN10116783 </td></tr><tr><td> L (+)-ornithin-hydrochlorid </td><td> Fisher </td><td> ICN10116783 </td></tr></tbody></table>

monitoring the reductive and oxidative half-reactions of a flavin-dependent monooxygenase using stopped-flow spectrophotometry

Aspergillus fumigatus siderofor A (Sida) er en FAD-holdig monooxygenase, som katalyserer hydroxyleringen af ornithin i biosyntesen af hydroxamat siderophorer, der er væsentlige for virulens (f.eks ferricrocin eller N &#39;, N &quot;, N&#39;&#39;&#39;-triacetylfusarinine C) 1. reaktionen katalyseres af Sida kan opdeles i reduktive og oxidativ halve reaktioner (skema 1). reduktiv halv-reaktion, er det oxiderede FAD bundet til A f Sida, reduceres NADPH 2,3. i den oxidative halv-reaktion den reducerede cofaktor reagerer med molekylært oxygen til dannelse af en C4a-hydroperoxyflavin mellemprodukt, som overfører et oxygenatom til ornithin. Her beskriver vi en fremgangsmåde til måling af priser og påvise de forskellige spektrale former Sida anvendelse af en stopped-flow instrument installeret i en anaerob handskekasse. I stopped-flow instrument, er små volumener af reaktanter hurtigt blandet, og efter strømningen standses ved the stoppet sprøjte (figur 1), er de spektrale ændringer af opløsningen anbringes i den observation cellen optaget over tid. I den første del af forsøget viser vi, hvordan vi kan bruge stopped-flow instrument i single-mode, hvor den anaerobe reduktion af flavin i A f Sida af NADPH er direkte målt. Vi derefter anvende dobbelt blanding miljøer, hvor A f Sida først anaerobt reduceres med NADPH i en udpeget tidsperiode i et aldrende sløjfe, og omsættes derefter med molekylært oxygen i observation celle (figur 1). For at udføre dette forsøg, anaerobe buffere er nødvendigt, fordi når kun den reduktive halv-reaktionen overvåges, vil enhver oxygen i opløsningerne reagerer med den reducerede flavin-cofaktor og danner en C4a-hydroperoxyflavin mellemprodukt, som i sidste ende vil henfalde tilbage i den oxiderede flavin . Dette ville ikke tillade brugeren at måle nedsættelsessatser da der ville være fuldstændig omsætning EnzYme. Når den oxidative halv-reaktion blev undersøgt enzymet skal reduceres i fravær af oxygen, således at kun de trin mellem reduktion og oxidation observeres. En af de anvendte puffere i dette forsøg er oxygen mættet, således at vi kan studere oxidative halv-reaktion ved højere koncentrationer af oxygen. Det er ofte de, der er gennemført, når man studerer enten de reduktive eller oxidative halve reaktioner med flavin-holdige monooxygenases. Tidsskalaen for de forud steady-state eksperimenter udført med stopped-flow er millisekunder til sekund, som tillader bestemmelse af iboende hastighedskonstanter og påvisning og identifikation af mellemprodukter i reaktion 4. De her beskrevne procedurer kan anvendes til andre flavin-afhængigt monooxygenaser. 5,6

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring the Reductive and Oxidative Half-Reactions of a Flavin-Dependent Monooxygenase using Stopped-Flow Spectrophotometry at JoVE.com

Monitoring the Reductive and Oxidative Half-Reactions of a Flavin-Dependent Monooxygenase using Stopped-Flow Spectrophotometry

Vi beskriver anvendelsen af ​​en stopped-flow instrument at undersøge både reduktive og oxidativ halve reaktioner<em&gt; Aspergillus fumigatus</em&gt; Siderofor A (Sida) et flavin-afhængigt monooxygenase. Vi derefter viser spektre, der svarer til de arter i reaktionen af ​​Sida og vi beregne hastighedskonstanterne for deres dannelse.

Overvågning de reduktive og oxidativ Halve Reaktioner fra et flavin-afhængigt monooxygenase med stopped-flow spektrofotometri

Aspergillus fumigatus siderophore A (SidA) is an FAD-containing monooxygenase that catalyzes the hydroxylation of ornithine in the biosynthesis of ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

High-throughput Protein Expression Generator Ved hjælp af en Mikrofluid Platform

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Monitoring the Wall Mechanics During Stent Deployment in a Vessel

Overvågning af Wall Mekanik Under Stent Deployment i en beholder

Clinical trials have reported different restenosis rates for various stent designs1. It is speculated that stent-induced strain concentrations on the ...

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

Ikke-kontakt, Label-fri overvågning af celler og ekstracellulær matrix ved hjælp af Raman spektroskopi

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

Mass Cytometry: Protocol for Daily Tuning and Running Cell Samples on a CyTOF Mass Cytometer

Mass Cytometry: Protokol for Daily Tuning og Running celleprøver på en CyTOF Mass Cytometer

In recent years, the rapid analysis of single cells has commonly been performed using flow cytometry and fluorescently-labeled antibodies. However, the ...

Surgical Technique for the Implantation of Tissue Engineered Vascular Grafts and Subsequent In Vivo Monitoring

Surgical Technique for the Implantation of Tissue Engineered Vascular Grafts and Subsequent In Vivo Monitoring

Kirurgisk Teknik for implantation af manipuleret væv kargrafter og efterfølgende<em&gt; In Vivo</em&gt; Overvågning

The development of Tissue Engineered Vessels (TEVs) is advanced by the ability to routinely and effectively implant TEVs (4-5 mm in diameter) into a large ...

Real Time Monitoring of Intracellular Bile Acid Dynamics Using a Genetically Encoded FRET-based Bile Acid Sensor

Real Time Overvågning af intracellulære Bile Acid Dynamics Ved hjælp af en genetisk indkodede FRET-baserede Bile Acid Sensor

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. ...

Intra-cardiac Side-Firing Light Catheter for Monitoring Cellular Metabolism using Transmural Absorbance Spectroscopy of Perfused Mammalian Hearts

Intra-hjerte side-fyring lys kateter til overvågning cellulære metabolisme ved hjælp af Transmural absorbans spektroskopi af Perfamale pattedyr hjerter

Absorbance spectroscopy of cardiac muscle provides non-destructive assessment of cytosolic and mitochondrial oxygenation via myoglobin and cytochrome ...

Preclinical Cardiac Electrophysiology Assessment by Dual Voltage and Calcium Optical Mapping of Human Organotypic Cardiac Slices

Præklinisk hjerteelektrofysiologivurdering ved dobbelt spænding og calciumoptisk kortlægning af humane organotypiske hjerteskiver

Human cardiac slice preparations have recently been developed as a platform for human physiology studies and therapy testing to bridge the gap between ...

Imaging and Quantification of the Area of Fast-Moving Microbubbles Using a High-Speed Camera and Image Analysis

Billeddannelse og kvantificering af området for hurtige mikrobobler ved hjælp af et højhastighedskamera og billedanalyse

An experimental and image analysis technique is presented for imaging cavitation bubbles and calculating their area. The high-speed imaging experimental ...