Name: monitoring the reductive and oxidative half-reactions of a flavin-dependent monooxygenase using stopped-flow spectrophotometry
Uploaded: 2012-03-18T14:00:00
Duration: 12 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Monitoring the Reductive and Oxidative Half-Reactions of a Flavin-Dependent Monooxygenase using Stopped-Flow Spectrophotometry at JoVE.com

המחקר נתמך על ידי פרס NSF MCB-1021384.

<ol>
	<li>Hissen, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Aspergillus+fumigatus+siderophore+biosynthetic+gene+sidA,+encoding+L&#45;ornithine+N5&#45;oxygenase,+is+required+for+virulence.">The Aspergillus fumigatus siderophore biosynthetic gene sidA, encoding L&#45;ornithine N5&#45;oxygenase, is required for virulence.</a> Infect. Immun. 73 (9), 5493-5503 (2005).</li><li>Chocklett, S. W., Sobrado, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspergillus+fumigatus+SidA+is+a+highly+specific+ornithine+hydroxylase+with+bound+flavin+cofactor.">Aspergillus fumigatus SidA is a highly specific ornithine hydroxylase with bound flavin cofactor.</a> Biochemistry. 49 (31), 6777-6783 (2010).</li><li>Mayfield, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+spectroscopic,+steady+state,+and+transient+kinetic+studies+of+a+representative+siderophore&#45;associated+flavin+monooxygenase.">Comprehensive spectroscopic, steady state, and transient kinetic studies of a representative siderophore&#45;associated flavin monooxygenase.</a> J. Biol. Chem. 285 (40), 30375-30388 (2010).</li><li>Fierke, C. A., Hammes, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+kinetic+approaches+to+enzyme+mechanisms.">Transient kinetic approaches to enzyme mechanisms.</a> Contemporary enzyme kinetics and mechanism. , (2009).</li><li>Palfey, B. A., McDonald, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+catalysis+in+flavin-dependent+monooxygenases.">Control of catalysis in flavin-dependent monooxygenases.</a> Arch. Biochem. Biophys. 493 (1), 26-26 (2010).</li><li>van Berkel, W. J. H., Kamerbeek, N. M., Fraaije, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flavoprotein+monooxygenases,+a+diverse+class+of+oxidative+biocatalysts.">Flavoprotein monooxygenases, a diverse class of oxidative biocatalysts.</a> J. Biotechnol. 124 (4), 670-689 (2006).</li><li>Chapman, S. K., Reid, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Flavoprotein Protocols. , (1999).</li><li>Sobrado, P., Fitzpatrick, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solvent+and+primary+deuterium+isotope+effects+show+that+lactate+CH+and+OH+bond+cleavage+are+concerted+in+Y254F+flavocytochrome+b2,+consistent+with+a+hydride+transfer+mechanism.">Solvent and primary deuterium isotope effects show that lactate CH and OH bond cleavage are concerted in Y254F flavocytochrome b2, consistent with a hydride transfer mechanism.</a> Biochemistry. 42, 15208-15214 (2003).</li><li>Kumar, S., Gawandi, V. B., Capito, N., Phillips, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substituent+effects+on+the+reaction+of+Î²-benzoylalanines+with+Pseudomonas+fluorescens+kynureninase.">Substituent effects on the reaction of Î²-benzoylalanines with Pseudomonas fluorescens kynureninase.</a> Biochemistry. 49 (36), 7909-7913 (2010).</li><li>Yun, D., Garc&#237;a-Serres, R., Chicalese, B. M., An, Y. H., Huynh, B. H., Bollinger, J. M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=(&#956;-1,2-Peroxo)diiron(III/III)+complex+as+a+precursor+to+the+diiron(III/IV)+intermediate+X+in+the+assembly+of+the+iron&#45;radical+cofactor+of+ribonucleotide+reductase+from+mouse.">(&#956;-1,2-Peroxo)diiron(III/III) complex as a precursor to the diiron(III/IV) intermediate X in the assembly of the iron&#45;radical cofactor of ribonucleotide reductase from mouse.</a> Biochemistry. 46 (7), 1925-1932 (2007).</li><li>Pennati, A., Zanetti, G., Aliverti, A., Gadda, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+salt+and+pH+on+the+reductive+half-reaction+of+Mycobacterium+tuberculosis+FprA+with+NADPH+Biochemistry.">Effect of salt and pH on the reductive half-reaction of Mycobacterium tuberculosis FprA with NADPH Biochemistry.</a> Biochemistry. 47 (11), 3418-3425 (2008).</li><li>Patil, P. V., Allou, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+protocatechuate+dioxygenase+for+maintaining+anaerobic+conditions+in+biochemical+experiments.">The use of protocatechuate dioxygenase for maintaining anaerobic conditions in biochemical experiments.</a> Analytical Biochemistry. 286 (2), 187-192 (2000).</li></ol>

אין לנו מה למסור.

אנזימים לזרז תגובות חמזור בדרך כלל מכילים cofactors כגון hemes ו flavins כי עוברים שינויים משמעותיים ספיגת במהלך מחזור קטליטי. טופס חמצון של פלבין מציג ספיגת מקסימום ב ~ 360 ו 450 ננומטר, וצמצום שלה הוא פיקוח בדרך כלל על ידי ביצוע ירידה ספיגת ב 450 ננומטר 7. באופן כללי, כמה ביניים זמניים קיימים אבל בצורה וריקבון מהר מדי כדי להימדד ב הספקטרופוטומטרים רגילים. שימוש Photophysics יישומי SX20 הפסיק זרימת ספקטרופוטומטר (או מכשירים דומים), ניתן למדוד שינויים ספיגת בקנה מידה זמן אלפית השנייה (מת בזמן, 2 ms). כאן למדנו את רדוקטיביים ו חמצוני חצאי תגובות של monooxygenase פלבין תלוי Sida F, המשמש כמודל. שיעור ההעברה הידריד נקבע על ידי מדידת השינוי של ספיגת ב 452 ננומטר לאחר ערבוב עם האנזים NADPH בתנאים אנאירוביים. לאחר מכן, לוקחים advantagהדואר של מצב ערבוב כפול של המכשיר הפסיק זרימה, האנזים 1 היה הגיב עם NADPH, עד הפחתה מלאה הושגה, ואז מופחת אנזימים NADP + מורכב היה מעורב עם חמצן. בעקבות הליך זה, ניתן לזהות חולפות ביניים לפלבין מחומצן ו למדוד שיעורי היווצרות עששת. זיהוי ביניים אלה מספק נתונים ניסיוניים על אופיו של המין מגיב קטליזה. במקרה של Sida F, היווצרות C4a-hydroperoxyflavin (פיקוח בדרך כלל 370-380 ננומטר), שהיא המין hydroxylating. בנוסף, מדידת שיעור קבוע של כל שלב מאפשר לקבל מידע על השלב החליפין בקביעת התגובה לעזור להבהיר את המנגנונים הקינטית וכימי של האנזים. באופן כללי, גישות דומות ניתן להשתמש flavoenzymes אחרים, או חלבונים אשר ספיגת חלו שינויים, כגון חלבונים המשךעין heme, פוספט pyridoxal-או ללא ברזל heme 8-10. המגבלה בשיטה זו היא כי כמויות גדולות של האנזים מטוהרים נדרשים, אך ניתן להתגבר באמצעות מערכת ביטוי עם תשואות גבוהות. אחת קובעת את ריכוז החלבון האופטימלית ספקטרום הקלטה באמצעות חלבון מספיק כך אות מספיק חזק ניתן לצפות, אבל לא יותר מדי, כך האנזים אינו מבוזבז. בדרך כלל, ריכוז האנזים הנמוך ביותר פלבין המכילים אנזימים המשמשים עצר זרימה ניסויים הוא 6-10 מיקרומטר (אחרי ערבוב) והוא נקבע באמצעות מקדם המקביל טוחנת הכחדה של האנזים. במקרה של Sida F, אחוז FAD קשור האנזים הוא 50-65% 2. Apo-חלבון נחשב פעיל בניסויים אלו כי cofactor FAD כרוך הכרחי קטליזה. מגבלה נוספת ניתן בשיטה זו הוא, אם תהליכים האנזים להתרחש מהר יותר מאשר 2 ms (זמן מת של זרימה הפסיק) הם לא לצפות, אבל הפה מדווחים אסטרטגיות שבו שיעורי ניתן לצמצם להתגבר על בעיה זו. דוגמה אחת לכך כולל באמצעות ריכוז NaCl גבוה התגובה של ferredoxin-NADP + reductase 11. קרצוף של חמצן במעגל זרימת זרימה עצר לעתים קרובות צעד מסובך בניסוי זה דורש תשומת לב מיוחדת. אוקסידאז-גלוקוז גלוקוז המערכת המתוארת כאן משמשת בהצלחה ברוב המעבדות כפי שהיא שיטה יעילה וזולה. עם זאת, ישנם מספר חסרונות אשר כוללים את הייצור של H 2 O 2 עבור יישומים מסוימים חלופות אחרות כמו מערכת dioxygenase-protocatechuate protocatechuate יש לשקול 12. ניצול של תיבת כפפה אנאירובי מקל כדי להבטיח תנאים אנאירוביים, אך אינה הכרחית. חמצן יש להסיר מן המעגל זרימת זרימה הפסיקה כפי שאנו רוצים את האנזים להיות מופחת בהיעדר חמצן או מגיבים עם חמצן בריכוזזה שאנחנו לציין. למרות הפסיקה זרימת הוא בתא הכפפות, אין חמצן במעגל זרימת אם היינו מאגרים אירובי בניסויים קודמים. בנוסף ספיגת מדידות, מבחני dichroism הקרינה ואת מעגלי ניתן לבצע ספקטרופוטומטר הפסיקה זרימת Photophysics יישומי SX20 עם האביזרים המתאימים.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> ציוד כללי למעבדות </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td></tr><tr><td> משאבת ואקום </td><td> וולש </td><td> - </td></tr><tr><td> בוכנר צלוחיות </td><td> דיג </td><td> 70340-500 </td></tr><tr><td> מערבבים ברים </td><td> דיג </td><td> 14-512-129 </td></tr><tr><td> מערבבים צלחות </td><td> דיג </td><td> 11-100-49S </td></tr><tr><td> Schlenk קווי </td><td> Kontes זכוכית </td><td> - </td></tr><tr><td> ארגון מיכל </td><td> Airgas </td><td> AR UPC300 </td></tr><tr><td> מיכל חנקן </td><td> Airgas </td><td> NI200 </td></tr><tr><td> מיכל חנקן, טוהר אולטרה ציון גבוה </td><td> Airgas </td><td> NI UHP200 </td></tr><tr><td> מיכל חמצן </td><td> Airgas </td><td> שור 40 </td></tr><tr><td> 5% מימן מאזן חנקן מיכל </td><td> Airgas </td><td> X02NI95B200H998 </td></tr><tr><td> SX20 סנטopped זרימת ספקטרופוטומטר </td><td> AppliedPhotophysics </td><td> - </td></tr><tr><td> כפפה תיבת </td><td> בישן </td><td> - </td></tr><tr><td> מי האמבט </td><td> יתירה מאונ &#39;Brinkmann </td><td> - </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> ספקי </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 50 מ&quot;ל BD פלקון צינורות </td><td> דיג </td><td> 14-432-23 </td></tr><tr><td> 15 מ&quot;ל BD פלקון חרוטי צינורות </td><td> דיג </td><td> 05-527-90 </td></tr><tr><td> 1.5 מ&quot;ל Eppendorf צינורות microcentrifuge </td><td> דיג </td><td> 05-402-18 </td></tr><tr><td> 50 ו 25 מ&quot;ל צלוחיות זכוכית </td><td> דיג </td><td> 06-402 </td></tr><tr><td> גומי פקקים </td><td> דיג </td><td> 06-447H </td></tr><tr><td> אלומיניום חותמות </td><td> דיג </td><td> 06-406-15 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> ReagenTS </td><td></td><td></td></tr><tr><td> פוספט אשלגן, monobasic </td><td> דיג </td><td> AC2714080025 </td></tr><tr><td> פוספט אשלגן, dibasic </td><td> דיג </td><td> P288-500 </td></tr><tr><td> סודיום אצטט </td><td> סיגמא </td><td> S-2889 </td></tr><tr><td> גלוקוז אוקסידאז מ א ניז&#39;ר </td><td> סיגמא </td><td> G7141-250KU </td></tr><tr><td> D-גלוקוז </td><td> דיג </td><td> D16-500 </td></tr><tr><td> β-NADPH </td><td> דיג </td><td> ICN10116783 </td></tr><tr><td> L (+)-ornithine hydrochloride </td><td> דיג </td><td> ICN10116783 </td></tr></tbody></table>

monitoring the reductive and oxidative half-reactions of a flavin-dependent monooxygenase using stopped-flow spectrophotometry

Aspergillus fumigatus siderophore (Sida) הוא monooxygenase FAD המכיל המזרז hydroxylation של ornithine ב ביוסינתזה של siderophores hydroxamate החיוניים ארסיות (למשל ferricrocin או נ &#39;, נ&#39;, נ&#39;&#39; &#39;, triacetylfusarinine C) 1. התגובה catalyzed ידי Sida ניתן לחלק רדוקטיביים ו חמצוני למוצרי תגובות וחצי (ערכת 1). רדוקטיבי חצי תגובה, FAD חמצון חייב Sida F, הוא מופחת על ידי NADPH 2,3. ב חמצוני חצי תגובה , cofactor מופחת מגיב עם חמצן מולקולרי כדי ליצור C4a-hydroperoxyflavin ביניים, אשר מעבירה אטום חמצן ornithine. כאן אנו מתארים הליך למדוד את שיעורי וכדי לזהות את הצורות השונות של הספקטרום Sida באמצעות מכשיר הפסיקה זרימת מותקן תא הכפפות אנאירובי. ב-מכשיר הפסיק לזרום, כמויות קטנות של המגיבים הם במהירות מעורבת, ואחרי זרימה הוא נעצר על ידי המזרק ה stop (איור 1), השינויים הרפאים של הפתרון ממוקם בתא המדידה נרשמות לאורך זמן. בחלק הראשון של הניסוי, אנו מראים כיצד ניתן להשתמש במכשיר הפסיק זרימת במצב אחד, שבו הפחתת אנאירובי של פלבין ב Sida F על ידי NADPH נמדד באופן ישיר. לאחר מכן להשתמש בהגדרות ערבוב כפול שבו Sida F מצטמצם 1 anaerobically ידי NADPH עבור פרק זמן מוגדר של זמן בלולאה ההזדקנות, ולאחר מכן הגיבו עם חמצן מולקולרי בתא המדידה (איור 1). על מנת לבצע את הניסוי הזה, מאגרים אנאירוביים נחוצים משום שכאשר רק רדוקטיבי חצי התגובה פיקוח, כל החמצן הפתרונות יגיב עם cofactor פלבין מופחת וליצור C4a-hydroperoxyflavin ביניים אשר בסופו של דבר להירקב בחזרה פלבין חמצון . זו לא תאפשר למשתמש למדוד במדויק את קצב הפחתת מאז לא תהיה תחלופה מלאה של enzyme. כאשר חמצון וחצי תגובת נחקרת האנזים חייב להיות מופחת בהיעדר חמצן כך רק את הצעדים בין הפחתת חמצון הם נצפו. אחד מאגרים המשמשים בניסוי זה הוא רווי חמצן, כדי שנוכל ללמוד חמצוני חצי תגובה על ריכוזים גבוהים יותר של חמצן. אלה הם לעתים קרובות את ההליכים שבוצעו כאשר לומדים בין אם את רדוקטיביים או חמצוני למוצרי תגובות וחצי עם פלבין המכילים monooxygenases. טווח הזמן של טרום היציב ניסויים שבוצעו עם הזרם, הוא עצר את אלפיות שניות, אשר מאפשר לקבוע את קבועי קצב פנימי איתור וזיהוי של חומרי ביניים בתגובה 4. הנהלים המתוארים כאן יכול להיות מיושם על פלבין תלויי monooxygenases אחרים. 5,6

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring the Reductive and Oxidative Half-Reactions of a Flavin-Dependent Monooxygenase using Stopped-Flow Spectrophotometry at JoVE.com

Monitoring the Reductive and Oxidative Half-Reactions of a Flavin-Dependent Monooxygenase using Stopped-Flow Spectrophotometry

אנו מתארים את השימוש של המכשיר הפסיקה זרימת לחקור הן את רדוקטיביים ו חמצוני חצאי תגובות<em&gt; אספרגילוס fumigatus</em&gt; Siderophore (Sida), monooxygenase פלבין תלוי. לאחר מכן, אנו מציגים את הספקטרום המתאים המינים בתגובה של Sida ואנחנו לחשב את קבוע קצב עבור היווצרותם.

מעקב אחר רדוקטיביים ו חמצוני חצאי תגובות של Monooxygenase פלבין תלויי באמצעות הופסק-Flow spectrophotometry

Aspergillus fumigatus siderophore A (SidA) is an FAD-containing monooxygenase that catalyzes the hydroxylation of ornithine in the biosynthesis of ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

גנרטור ביטוי חלבון תפוקה גבוהה באמצעות פלטפורמת Microfluidic

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Monitoring the Wall Mechanics During Stent Deployment in a Vessel

מעקב אחר מכניקה קיר במהלך פריסה סטנט בכלי

Clinical trials have reported different restenosis rates for various stent designs1. It is speculated that stent-induced strain concentrations on the ...

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

ללא קשר, לייבל ללא ניטור של תאים תאי מטריקס באמצעות ספקטרוסקופיית ראמאן

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

Mass Cytometry: Protocol for Daily Tuning and Running Cell Samples on a CyTOF Mass Cytometer

Cytometry המוני: פרוטוקול לכוונון יומי ודגימות תאים פועלים על Cytometer המוני CyTOF

In recent years, the rapid analysis of single cells has commonly been performed using flow cytometry and fluorescently-labeled antibodies. However, the ...

Surgical Technique for the Implantation of Tissue Engineered Vascular Grafts and Subsequent In Vivo Monitoring

Surgical Technique for the Implantation of Tissue Engineered Vascular Grafts and Subsequent In Vivo Monitoring

טכניקה כירורגית להשתלה של רקמות שתלי כלי דם מהונדסים ולאחר<em&gt; In vivo</em&gt; ניטור

The development of Tissue Engineered Vessels (TEVs) is advanced by the ability to routinely and effectively implant TEVs (4-5 mm in diameter) into a large ...

Real Time Monitoring of Intracellular Bile Acid Dynamics Using a Genetically Encoded FRET-based Bile Acid Sensor

ניטור בזמן אמת של תאיים חומצות מרה Dynamics שימוש חומצות מרה חיישן מבוסס סריג גנטי מקודד

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. ...

Intra-cardiac Side-Firing Light Catheter for Monitoring Cellular Metabolism using Transmural Absorbance Spectroscopy of Perfused Mammalian Hearts

מהצד הפנים-לב-אש קטטר אור עבור ניטור מטבוליזם הסלולר באמצעות בליעה בספיגת העבר של הלבבות המגברים

Absorbance spectroscopy of cardiac muscle provides non-destructive assessment of cytosolic and mitochondrial oxygenation via myoglobin and cytochrome ...

Preclinical Cardiac Electrophysiology Assessment by Dual Voltage and Calcium Optical Mapping of Human Organotypic Cardiac Slices

מיפוי אופטי של הערכת החשמל לניתוחי לב באמצעות מתח כפול וסידן

Human cardiac slice preparations have recently been developed as a platform for human physiology studies and therapy testing to bridge the gap between ...

Imaging and Quantification of the Area of Fast-Moving Microbubbles Using a High-Speed Camera and Image Analysis

הדמיה וכמות של האזור של מיקרו-bubbles הנע במהירות באמצעות מצלמה במהירות גבוהה וניתוח תמונה

An experimental and image analysis technique is presented for imaging cavitation bubbles and calculating their area. The high-speed imaging experimental ...

Labeling of Extracellular Vesicles for Monitoring Migration and Uptake in Cartilage Explants

תיוג של שלל חוץ-תאי לניטור הגירה וספיגה של סחוס

Extracellular vesicles (EVs) are used in different studies to prove their potential as a cell-free treatment due to their cargo derived from their ...