Name: monitoring the reductive and oxidative half-reactions of a flavin-dependent monooxygenase using stopped-flow spectrophotometry
Uploaded: 2012-03-18T14:00:00
Duration: 12 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Monitoring the Reductive and Oxidative Half-Reactions of a Flavin-Dependent Monooxygenase using Stopped-Flow Spectrophotometry at JoVE.com

Forskning støttet av NSF award MCB-1021384.

1. Utarbeidelse av Anaerob buffer <ol><li> Forbered en L på 100 mm kaliumfosfat buffer, 7,5 pH. Hell 250 ml av bufferen i en 500 ml Büchner kolbe med en bevegelse bar. </li><li> Tett kolben med en gummipropp og legg den på et oppstyr plate. Koble den korte slangen av kolben til en Schlenk linje. </li><li> Degas bufferen under vakuum i 5 timer ved romtemperatur med agitasjon. I løpet av denne perioden, utføre 5 påfølgende runder med vakuum avgassing og spyling med argon hver time. </li><li> Skyll kolben med argon i 10 sekunder og koble den fra vakuum manifold. Plasser kolben inni hanskerommet. </li><li> La kolben åpen i hanskerommet natten med kraftig omrøring. </li></ol> 2. Fjerner oksygen fra Stoppet-flow system <ol><li> Forbered en L på 0,1 M natriumacetat, 5,0 pH. Hell 125 ml av denne buffer i en 250 ml Büchner kolbe og utføre trinnene 01.02 til 01.04. </li><li> Vei ut 5mg glukose oksidase fra Aspergillus niger (181 300 U / g) og 0,9 g glukose ved hjelp av en 1,5 mL Eppendorf rør og 50 ml Falcon konisk tube, henholdsvis. Plasser begge beholdere inn i hanskerommet. </li><li> Løs opp glukose oksidase og glukose i 50 ml anaerob 0,1 M natriumacetat, pH 5,0 (endelige konsentrasjoner av 18.13 U / ml og 100 mm, henholdsvis). Fyll beholderen sprøyter med denne løsningen (Figur 1). </li><li> Sørg for at stasjonen ventiler er i &quot;belastning&quot; posisjon og fyll stasjonen sprøyter (figur 1). Drei F ventilen til &quot;drive&quot; posisjon. Tømme stopp sprøyten ved å klikke på tomt i Pro-Data kontroll programvare. Skyv buffer fra stasjonen sprøyte F gjennom flyten kretsen ved manuelt å heve tilsvarende stasjonen ram. Gjenta dette trinnet ti ganger totalt. Utfør samme prosedyre med de andre tre stasjonen sprøyter. Vent en time. </li><li> Erstatt løsningen på reservoar sprøyter med samme buffer containing glukose oksidase og glukose. Gjenta steg 2.4. </li><li> Gjenta trinn 2,5 og la oppløsningen stå i strømmen systemet over natten. </li><li> Etter natten inkubasjon, gjenta trinn 2.5. </li></ol> 3. Utarbeidelse av Oxygen Mettet buffer <ol><li> Forbered 100 mm kaliumfosfat buffer (pH 7,5) og hell 50 ml inn en 50-ml hetteglass med en bevegelse bar. Cap hetteglasset med en Wheaton propp og en Wheaton aluminiumsforsegling. </li><li> Plasser hetteglasset på is. Fordyp en lang nål tilkoblet en tank med 100% oksygen i løsningen. Sett inn en annen short nål gjennom proppen på hetteglasset som en ventil. </li><li> Bubble løsningen med 100% oksygen i 1 time med agitasjon. </li><li> Fjern først den korte kanylen fra hetteglasset og vente 10 sekunder før du fjerner den lange nålen. Plasser lukket hetteglass i hanskerommet. </li></ol> 4. Utarbeidelse av NADPH Solution <ol><li> Vei ut 1 mg av NADPH i et 1,5 ml Eppendorf rør og plasser it inn i hanskerommet. </li><li> Løs opp NADPH i 300 mL av anaerob 100 mm kaliumfosfat buffer, 7,5 pH. Ta 30 mL av denne løsningen fra hanskerommet for å bestemme NADPH konsentrasjonen med et spektrofotometer (ε 340 nm = 6270 M -1 cm -1). </li></ol> 5. Fjerning av oksygen fra Enzyme Solution <ol><li> Ta 400 mL av enzymet lager løsning fra fryseren og tine i hanskerommet. Enzymet stamløsning (360 mm) ble tidligere utarbeidet i 100 mm kaliumfosfat buffer (pH 7,5) inneholder 100 mm NaCl, og frosset i flytende nitrogen. </li><li> Overfør enzymet løsningen i en 25-ml hetteglass med en bevegelse bar, cap hetteglasset med en Wheaton propp og en Wheaton aluminiumsforsegling og fjerne fra hanskerommet. </li><li> Plasser hetteglasset på is og koble den til en Schlenk linje ved å stikke en nål gjennom proppen på hetteglasset. </li><li> Degas enzymet løsningen ved å utføre 5 påfølgende runder medstøvsuge avgassing og spyling med argon hvert 20. minutt i 1 time. </li><li> Skyll hetteglasset med argon i 10 sekunder og koble den fra vakuum manifold. Plasser hetteglasset på is inne i hanskerommet. </li></ol> 6. Reduktiv Half-reaksjon: Overvåking Flavin Reduksjon <ol><li> Klargjør stoppet-flow instrument og Pro-Data kontroll programvare for enkel blanding modus følge produsentens protokollen. </li><li> Slå på en sirkulerende vannbad (15 ° C). Fjerne oksygen fra vannet ved boblet nitrogen gjennom det i 20 minutter. Dette forhindrer oksygen forurensning gjennom flyten kretsen. </li><li> Opprettholde temperaturen på stasjonen sprøyter og observasjon celle ved 15 ° C ved å koble den vannbad huset til stoppet-flow til sirkulerende bad. </li><li> I Kontrollpanel vinduet på Pro-Data kontroll programvare select fotodiode Array, ekstern trigger (for å aktivere stanset-flow drift), og Logarithmic skala. </li><li> Start Pro-Data Viewer programvare og definere katalogen der de datafiler skal lagres. </li><li> Erstatt løsning av reservoaret sprøyter C og F med anaerob 100 mm kaliumfosfat buffer (pH 7,5). Snu C og F ventiler til &quot;stasjonen&quot; posisjon. Tømme stopp sprøyten ved å klikke tomt i Pro-Data kontroll programvare. Skyv buffer fra begge kjøretur sprøyter gjennom flyten kretsen ved manuelt å heve tilsvarende stasjonen ram fem ganger totalt (klikk Tomt før hver bevegelse av ram). </li><li> For å sikre at glukose oksidase er fullstendig fjernet fra strømmen kretsen, utføre trinn 6,6 fire ganger totalt. </li><li> Klikk på Baseline i Pro-Data kontroll programvare. </li><li> Bland 100 mL av enzym stamløsning med 1100 mL av anaerob 100 mm kaliumfosfat buffer (endelig konsentrasjon etter blanding i stoppet strømmen av 15 mm). </li><li> Erstatt løsning av reservoaret SYRInge F med enzymet løsningen. Drei F ventilen til &quot;drive&quot; posisjon. Tømme stopp sprøyten ved å klikke tomt i Pro-Data kontroll programvare. Skyv enzymet løsningen fra stasjonen sprøyten F gjennom flyten kretsen ved manuelt å heve tilsvarende stasjonen ram. Utfør dette tre ganger totalt. I Pro-Data kontroll programvaren, angir oppkjøpet tid til 60 sek. </li><li> Sørg for at begge driver sprøyter er fylt med tilhørende løsninger og stasjonen værer er i kontakt med stasjonen sprøyte stempler. Vri begge ventilene til &quot;drive&quot; posisjon og klikk Acquire i Pro-Data kontroll programvare for å utføre stasjonen. Gjenta dette trinnet to ganger mer å skaffe dataene i tre eksemplarer. Dette gir spektra av den oksiderte formen av enzymet. </li><li> Bruke En 452 nm verdi hentet fra stasjonene, fastslår enzymet konsentrasjon før blanding (ε 452 nm = 13700 M -1 cm -1) og forberede 4 ml av en NADPH solution 1,5 ganger mer konsentrert. </li><li> Erstatt løsning av reservoaret sprøyta C med NADPH løsningen og tomme og fyll stopp sprøyten tre ganger som beskrevet i 6.10. </li><li> Gjenta steg 6,11. Dette gir spektra under reduksjon av enzymet. </li></ol> 7. Oksidativ Half-reaksjon: Overvåking Flavin oksidering <ol><li> Klargjør stoppet-flow instrument og Pro-Data kontroll programvare for dobbel blanding modus følge produsentens protokollen. </li><li> Gjenta trinn 6.2-6.5. </li><li> Bytt løsningen i de fire reservoaret sprøyter med anaerob 100 mm kaliumfosfat buffer (pH 7,5). Drei F ventilen til &quot;drive&quot; posisjon. Tøm stopp sprøyten ved å klikke tomt i Pro-Data kontroll programvare. Skyv buffer fra stasjonen sprøyten F gjennom flyten kretsen ved manuelt å heve tilsvarende stasjonen ram. Utfør dette trinnet fem ganger totalt med hver stasjon sprøyte. </li><li> Utfør trinn 7.3 fire ganger i total for å fjerne innholdet fra flyten kretsen. </li><li> Klikk Baseline i Pro-Data kontroll programvare. </li><li> Bland 200 mL av enzym stamløsning med 1000 mL av anaerob 100 mm kaliumfosfat buffer (endelig konsentrasjon etter blanding i stoppet strømmen av 15 mm). </li><li> Erstatt løsning av reservoaret sprøyta A med enzymet løsningen. Vri En ventil til &quot;stasjonen&quot; posisjon. Tømme stopp sprøyten ved å klikke tomt i Pro-Data kontroll programvare. Skyv enzymet løsningen fra stasjon sprøyten A gjennom flyten kretsen ved manuelt å heve tilsvarende stasjonen ram. Utfør dette trinnet tre ganger totalt. I Pro-Data kontroll programvare, angi tidsforsinkelsen til 0,5 s og oppkjøp tid til 60 s. </li><li> Sørg for at alle driver sprøyter er fylt med tilhørende løsninger og stasjonen værer er i kontakt med stasjonen sprøyte stempler. Slå alle ventiler til &quot;drive&quot; posisjon og klikk Acquire i Pro-Daten kontroll programvare for å utføre stasjonen. Gjenta dette trinnet to ganger for å få dataene i tre eksemplarer. Dette gir spektra av den oksiderte formen av enzymet. </li><li> Erstatt løsning av reservoaret sprøyte B med en NADPH løsning 1,5 ganger mer konsentrert enn enzymet løsningen i sprøyte A. Vri B ventilen til &quot;drive&quot; posisjon og tømme og fylle stopp sprøyten tre ganger som beskrevet i 7.7. </li><li> Erstatt løsning av reservoaret sprøyte C med oksygenrikt buffer. Vri C ventilen til &quot;drive&quot; posisjon og tømme og fylle stopp sprøyten tre ganger som beskrevet i 7.7. I Pro-Data kontroll programvare, angir du forsinkelsen og oppkjøpet tid på 15 og 900 s, henholdsvis. </li><li> Gjenta steg 7.8. Dette gir spektra under reoxidation av fullt redusert enzymet. </li></ol> 8. Data Analysis <ol><li> Start Pro-Data Converter-programvare. Klikk på Options ikonet og velg Lagre i ProDataCSV. </li><li> Åpentkatalogen der datafilene ble lagret. Dra filene til APL Pro-Data Converter vinduet. Dataene lagres automatisk som CSV-format filer i samme katalog. </li><li> Åpne CSV-format ved hjelp av Microsoft Excel (Microsoft, Redmond, WA, USA). Normalisere baseline de stoppet-flow spor ved å trekke tilsvarende absorpsjon ved 700 nm. </li><li> Analyser korrigerte spor ved hjelp KaleidaGraph (Synergy Software, Reading, PA) ved å montere den handlingen i absorbans ved tilsvarende maksimal versus tid til riktig eksponentiell funksjon. Som vist i figur 2B, absorbansen ved 452 nm ble plottet som funksjon av tid for å bestemme frekvensen av Flavin reduksjon etter blanding enzymet og NADPH i stoppet-flow instrument. I dette tilfellet ble den beste passform av data innhentet ved hjelp av en dobbel eksponentiell ligning og priser på 0,65 og 0,23 s -1 ble beregnet for første og andre fase av reduksjonen, respectively. For å bestemme frekvensen av dannelsen av C4a-hydroperoxyflavin middels og reoxidation etter reagerer redusert enzym med oksygen, analyserte vi stoppet-flow spor på 380 og 452 nm, henholdsvis (Figur 3B). Ved hjelp av en enkelt eksponentiell ligning, beregnet vi satser på 1,4 og 0,006 s -1 for første og andre trinn i oksidativt halvreaksjon, henholdsvis. </li></ol> 9. Representative Resultater Resultatene fra forsøkene er beskrevet i de forrige avsnittene viser hvordan reduktive halvreaksjon av A f Sida kan overvåkes ved å måle endringene i absorbansen ved 452 nm, som tilsvarer endringene i redoks tilstand Flavin. Satsen for dette trinnet kan bestemmes ved å montere dataene til riktig ligning (figur 2, Step 8.4). Reduksjonen rente innhentet (0,65 s -1) er lik k katten verdi beregnet medsteady-state eksperimenter 2, antyder at reduksjonen er det hastighetsbegrensende bestemme trinn i reaksjonen. Å dra nytte av dobbel blanding modus på stoppet-flow, kan graden av oksidasjon og mellomprodukter i denne halvreaksjon fastsettes (figur 3; Step 8.4). I reaksjonen katalysert av A f Sida er C4a-hydroperoxyflavin klart påvist (λ max på 380 nm), og frekvensen av formasjonen og forfall kan beregnes. Den langsomme Satsen for reoxidation innhentet (0,006 s -1) indikerer at C4a-hydroperoxyflavin er meget stabil i fravær av ornithine. <img alt="Scheme 1" src="/files/ftp_upload/3803/3803scheme1.jpg" /> Scheme en. Mechanism of A f SIDA. Den isoallozaxine ring av FAD kofaktor vises. Den oksidert Flavin (A) binder seg til NADPH (B) og reagerer og danner redusert Flavin og NADP + (C). Etter reaksjon med molekylær oksygen og binding avornithine er C4a-hydroperoxyflavin dannet (D). Dette er de hydroxylating arter. Etter hydroksylering av ornithine må hydroxyflavin (E) være dehydrert å danne oksidert enzymet. NADP + forblir bundet gjennom katalytiske syklus og er det siste produktet som skal slippes (F). <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/3803/3803fig1.jpg" /> Figur 1. Den stoppet-flow instrument. A) Bilde av komponentene i Applied Photophysics SX20 stoppet-flow spektrofotometer. B) Bilde av prøven aggregatet. C) Scheme av flyten kretsen i dobbel blanding modus. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/3803/3803fig2.jpg" /> Figur 2. Anaerob reduksjon av Sida med NADPH i stoppet-flow instrument. A) Spectral endringer registrert etter blanding like volumer av 30 mM Sida og 45 mM NADPH. Den første spektrum (oksidert Sida) og siste spektrum (fullt redusert SidA) er uthevet i blått og rødt, henholdsvis. B) Absorbance trace på 452 nm registrert som en funksjon av tid. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/3803/3803fig3.jpg" /> Figur 3. Oksidasjon av Sida i stoppet-flow instrument. A) Spectral endringer registrert etter blande like mengder fullt redusert Sida og oksygenert buffer. De endelige konsentrasjonen var 15 mM Sida, 22,5 mM NADPH, og 0,95 mM oksygen. Spekteret registrert på 0.034, 4.268 og 727.494 s tilsvarer fullt redusert enzymet, det C4a-hydroperoxyflavin middels (λ max på 380 nm), og oksidert enzymet (λ max på 450 nm), henholdsvis. B) Absorbance trace på 382 og 452 nm registrert som en funksjon av tid.

<ol>
	<li>Hissen, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Aspergillus+fumigatus+siderophore+biosynthetic+gene+sidA,+encoding+L&#45;ornithine+N5&#45;oxygenase,+is+required+for+virulence.">The Aspergillus fumigatus siderophore biosynthetic gene sidA, encoding L&#45;ornithine N5&#45;oxygenase, is required for virulence.</a> Infect. Immun. 73 (9), 5493-5503 (2005).</li><li>Chocklett, S. W., Sobrado, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspergillus+fumigatus+SidA+is+a+highly+specific+ornithine+hydroxylase+with+bound+flavin+cofactor.">Aspergillus fumigatus SidA is a highly specific ornithine hydroxylase with bound flavin cofactor.</a> Biochemistry. 49 (31), 6777-6783 (2010).</li><li>Mayfield, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+spectroscopic,+steady+state,+and+transient+kinetic+studies+of+a+representative+siderophore&#45;associated+flavin+monooxygenase.">Comprehensive spectroscopic, steady state, and transient kinetic studies of a representative siderophore&#45;associated flavin monooxygenase.</a> J. Biol. Chem. 285 (40), 30375-30388 (2010).</li><li>Fierke, C. A., Hammes, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+kinetic+approaches+to+enzyme+mechanisms.">Transient kinetic approaches to enzyme mechanisms.</a> Contemporary enzyme kinetics and mechanism. , (2009).</li><li>Palfey, B. A., McDonald, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+catalysis+in+flavin-dependent+monooxygenases.">Control of catalysis in flavin-dependent monooxygenases.</a> Arch. Biochem. Biophys. 493 (1), 26-26 (2010).</li><li>van Berkel, W. J. H., Kamerbeek, N. M., Fraaije, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flavoprotein+monooxygenases,+a+diverse+class+of+oxidative+biocatalysts.">Flavoprotein monooxygenases, a diverse class of oxidative biocatalysts.</a> J. Biotechnol. 124 (4), 670-689 (2006).</li><li>Chapman, S. K., Reid, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Flavoprotein Protocols. , (1999).</li><li>Sobrado, P., Fitzpatrick, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solvent+and+primary+deuterium+isotope+effects+show+that+lactate+CH+and+OH+bond+cleavage+are+concerted+in+Y254F+flavocytochrome+b2,+consistent+with+a+hydride+transfer+mechanism.">Solvent and primary deuterium isotope effects show that lactate CH and OH bond cleavage are concerted in Y254F flavocytochrome b2, consistent with a hydride transfer mechanism.</a> Biochemistry. 42, 15208-15214 (2003).</li><li>Kumar, S., Gawandi, V. B., Capito, N., Phillips, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substituent+effects+on+the+reaction+of+Î²-benzoylalanines+with+Pseudomonas+fluorescens+kynureninase.">Substituent effects on the reaction of Î²-benzoylalanines with Pseudomonas fluorescens kynureninase.</a> Biochemistry. 49 (36), 7909-7913 (2010).</li><li>Yun, D., Garc&#237;a-Serres, R., Chicalese, B. M., An, Y. H., Huynh, B. H., Bollinger, J. M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=(&#956;-1,2-Peroxo)diiron(III/III)+complex+as+a+precursor+to+the+diiron(III/IV)+intermediate+X+in+the+assembly+of+the+iron&#45;radical+cofactor+of+ribonucleotide+reductase+from+mouse.">(&#956;-1,2-Peroxo)diiron(III/III) complex as a precursor to the diiron(III/IV) intermediate X in the assembly of the iron&#45;radical cofactor of ribonucleotide reductase from mouse.</a> Biochemistry. 46 (7), 1925-1932 (2007).</li><li>Pennati, A., Zanetti, G., Aliverti, A., Gadda, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+salt+and+pH+on+the+reductive+half-reaction+of+Mycobacterium+tuberculosis+FprA+with+NADPH+Biochemistry.">Effect of salt and pH on the reductive half-reaction of Mycobacterium tuberculosis FprA with NADPH Biochemistry.</a> Biochemistry. 47 (11), 3418-3425 (2008).</li><li>Patil, P. V., Allou, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+protocatechuate+dioxygenase+for+maintaining+anaerobic+conditions+in+biochemical+experiments.">The use of protocatechuate dioxygenase for maintaining anaerobic conditions in biochemical experiments.</a> Analytical Biochemistry. 286 (2), 187-192 (2000).</li></ol>

Vi har ingenting å avsløre.

Enzymer som katalyserer redoksreaksjoner vanligvis inneholder kofaktorer som hemes og flavins som gjennomgår betydelige absorbansavlesninger endringer i løpet av katalytiske syklusen. Den oksidert form av Flavin presenterer absorbans maxima på ~ 360 og 450 nm, og reduksjonen er typisk overvåkes ved å følge absorbansen nedgang på 450 nm 7. Generelt noen forbigående mellomprodukter er til stede, men formen og forfall for fort til å bli målt i faste spektrofotometre. Bruke Applied Photophysics SX20 stoppet-flow spektrofotometer (eller lignende instrumenter), er det mulig å måle absorbans endringer i millisekund tidsskalaen (dead-tiden, 2 ms). Her har vi studert de reduktive og oksidativt halv-reaksjoner i Flavin-avhengige monooxygenase A f Sida, som tjener som en modell. Satsen for hydride overføringen ble bestemt ved å måle endring av absorbansen ved 452 nm etter blanding enzymet med NADPH under anaerobe forhold. Senere, tar advantage av den doble blanding modus på stoppet-flow instrument, ble det enzymet første reagerte med NADPH, inntil full reduksjon ble oppnådd, da den reduserte enzymet-NADP + komplekset ble blandet med oksygen. Etter denne prosedyren, er det mulig å oppdage forbigående oksygenerte Flavin mellomprodukter og å måle utbredelsen av dannelse og forfall. Identifiseringen av disse mellomprodukter gir eksperimentelle data om arten av de som reagerer arter i katalyse. I tilfelle av en f Sida, dannelsen av C4a-hydroperoxyflavin (typisk overvåkes ved 370-380 nm), som er den hydroxylating arter. I tillegg måle hastighetskonstanten av hvert trinn gjør det mulig å få informasjon om det hastighetsbegrensende bestemme trinnet i reaksjonen og bidra til å belyse de kinetiske og kjemiske mekanismer av enzymet. Generelt kan lignende tilnærminger brukes til andre flavoenzymes, eller proteiner som absorbans skjedd endringer, for eksempel proteiner som fortsain heme, pyridoxal-fosfat, eller ikke-heme jern 8-10. En begrensning med denne metoden er at store mengder renset enzymet er nødvendig, men dette kan løses ved hjelp av et uttrykk system med høy avkastning. En bestemmer optimal protein konsentrasjon for opptak spektra ved hjelp av nok protein, slik at et sterkt nok signal kan observeres, men ikke for mye slik at enzymet ikke er bortkastet. Vanligvis er den laveste enzymet konsentrasjon for Flavin-holdige enzymer som brukes i stoppes-flømmingseksperimenter 6-10 mM (etter blanding) og fastsettes med tilsvarende molare utryddelse koeffisient av enzymet. I tilfelle av en f Sida, er prosentandelen av enzymet bundet FAD 50-65% 2. Apo-protein regnes som inaktive i disse forsøkene, fordi en innbundet FAD kofaktor er nødvendig for katalyse. En annen mulig begrensning med denne metoden er hvis prosessene i et enzym skje raskere enn 2 ms (død tidspunktet for stanset-flow) de ikke vil bli observert, men there rapporteres strategier hvor prisene kan reduseres for å overvinne dette problemet. Et eksempel på dette inkluderer bruk en høy NaCl konsentrasjon i reaksjon på en ferredoxin-NADP + reduktase 11. Den skrubbing av oksygen fra flyten krets av stanset-flow er ofte en vanskelig skritt i dette eksperimentet, og krever spesiell oppmerksomhet. Den glukose oksidase-glukose system som beskrives her er brukt med hell i de fleste laboratorier som det er en effektiv og rimelig metode. Det er imidlertid noen ulemper som omfatter produksjon av H 2 O 2 og for enkelte programmer andre alternativer som protocatechuate dioxygenase-protocatechuate system bør vurderes 12. Utnyttelse av en anaerob hanskerommet gjør det lettere å sikre anaerobe forhold, men er ikke avgjørende. Oksygen må fjernes fra flyten krets av stanset-flow som vi ønsker at enzymet reduseres i fravær av oksygen eller reagere med oksygen på konsentrasjons som vi angir. Selv om stanset-flow er i hanskerommet, det er oksygen i flyten kretsen hvis vi hadde brukt aerobic buffere i tidligere forsøk. I tillegg til absorpsjonsmålingene, kan fluorescens og rundskriv dichroism analysene utføres i Applied Photophysics SX20 stoppet-flow spektrofotometer med tilsvarende tilbehør.

<table border="1"><tbody><tr><td> Generelt Laboratory Utstyr </td><td> Firma </td><td> Katalog nummer </td></tr><tr><td> Vakuumpumpe </td><td> Welch </td><td> - </td></tr><tr><td> Büchner flasker </td><td> Fisher </td><td> 70340-500 </td></tr><tr><td> Rør barer </td><td> Fisher </td><td> 14-512-129 </td></tr><tr><td> Rør plater </td><td> Fisher </td><td> 11-100-49s </td></tr><tr><td> Schlenk linjer </td><td> Kontes Glass </td><td> - </td></tr><tr><td> Argon tank </td><td> Airgas </td><td> AR UPC300 </td></tr><tr><td> Nitrogen tank </td><td> Airgas </td><td> NI200 </td></tr><tr><td> Nitrogen tank, ultra høy renhet klasse </td><td> Airgas </td><td> NI UHP200 </td></tr><tr><td> Oksygen tank </td><td> Airgas </td><td> OX 40 </td></tr><tr><td> 5% Hydrogen balanse nitrogen tank </td><td> Airgas </td><td> X02NI95B200H998 </td></tr><tr><td> SX20 StOP-flow spektrofotometer </td><td> AppliedPhotophysics </td><td> - </td></tr><tr><td> Hanskerom </td><td> Coy </td><td> - </td></tr><tr><td> Vannbad </td><td> Brinkmann Lauda </td><td> - </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Rekvisita </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 50 ml BD Falcon rør </td><td> Fisher </td><td> 14-432-23 </td></tr><tr><td> 15 ml BD Falcon konisk rør </td><td> Fisher </td><td> 05-527-90 </td></tr><tr><td> 1,5 ml Eppendorf Mikrosentrifugerør </td><td> Fisher </td><td> 05-402-18 </td></tr><tr><td> 50 og 25 ml hetteglass </td><td> Fisher </td><td> 06-402 </td></tr><tr><td> Gummiproppene </td><td> Fisher </td><td> 06-447H </td></tr><tr><td> Aluminum tetninger </td><td> Fisher </td><td> 06-406-15 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Reagents </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Kalium fosfat, monobasic </td><td> Fisher </td><td> AC2714080025 </td></tr><tr><td> Kalium fosfat, dibasic </td><td> Fisher </td><td> P288-500 </td></tr><tr><td> Natriumacetat </td><td> Sigma </td><td> S-2889 </td></tr><tr><td> Glukose oksidase fra A. Niger </td><td> Sigma </td><td> G7141-250KU </td></tr><tr><td> D-Glukose </td><td> Fisher </td><td> D16-500 </td></tr><tr><td> β-NADPH </td><td> Fisher </td><td> ICN10116783 </td></tr><tr><td> L (+)-Ornithine hydrochloride </td><td> Fisher </td><td> ICN10116783 </td></tr></tbody></table>

monitoring the reductive and oxidative half-reactions of a flavin-dependent monooxygenase using stopped-flow spectrophotometry

Aspergillus fumigatus siderophore A (Sida) er en FAD-holdig monooxygenase som katalyserer hydroksylering av ornithine i biosyntesen av hydroxamate siderophores som er viktig for virulens (f.eks ferricrocin eller N &#39;, N &quot;, N&#39;&#39;&#39;-triacetylfusarinine C) 1. Reaksjonen katalyseres av Sida kan deles inn i reduktive og oksidativt halv-reaksjoner (Scheme 1). I reduktive halvreaksjon, blir oksidert FAD bundet til en f Sida, redusert med NADPH 2,3. I oksidativt halvreaksjon , redusert kofaktor reagerer med molekylært oksygen for å danne en C4a-hydroperoxyflavin middels, som overfører en oksygen atom til ornithine. Her beskriver vi en prosedyre for å måle prisene og oppdage de ulike spektrale former for Sida bruke en stoppet-flow instrument installert i en anaerob hanskerommet. I stoppet-flow instrument, små mengder reaktanter er raskt blandet, og etter at strømmen er stoppet av the stopp sprøyte (figur 1), blir spektrale endringer av løsningen plassert i observasjonen cellen registrert over tid. I første del av eksperimentet, viser vi hvordan vi kan bruke stoppet-flow instrument i én modus, hvor den anaerobe reduksjon av Flavin i A f Sida av NADPH blir direkte målt. Vi bruker doble blande miljøer hvor A f Sida er første anaerobt reduseres med NADPH for en utpekt periode i en aldrende løkke, og deretter reagerte med molekylær oksygen i observasjonen celle (figur 1). For å utføre dette eksperimentet, anaerobe buffere er nødvendig fordi når bare den reduktive halvreaksjon overvåkes, vil enhver oksygen i løsningene reagere med redusert Flavin kofaktor og danne en C4a-hydroperoxyflavin mellomliggende som til slutt vil råtne tilbake i oksidert Flavin . Dette ville ikke tillate brukeren å måle utbredelsen av reduksjon siden det ville være fullstendig omsetning av EnzYme. Når den oksidative halvreaksjon blir studert enzymet må reduseres i fravær av oksygen, slik at bare de trinnene mellom reduksjon og oksidasjon er observert. En av buffere som brukes i dette forsøket er oksygen mettet slik at vi kan studere oksidativt halvreaksjon ved høyere konsentrasjoner av oksygen. Disse er ofte de prosedyrer som utføres når en skal studere enten reduktive eller oksidativt halv-reaksjoner med Flavin-holdige monooxygenases. Tiden omfanget av de pre-steady-state eksperimenter utført med stoppet-flow er millisekunder til sekunder, som tillater bestemmelse av iboende hastighetskonstanter og påvisning og identifikasjon av mellomprodukter i reaksjonen 4. Prosedyrene som er beskrevet her kan brukes til andre Flavin-avhengige monooxygenases. 5,6

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring the Reductive and Oxidative Half-Reactions of a Flavin-Dependent Monooxygenase using Stopped-Flow Spectrophotometry at JoVE.com

Monitoring the Reductive and Oxidative Half-Reactions of a Flavin-Dependent Monooxygenase using Stopped-Flow Spectrophotometry

Vi beskriver bruk av en stoppet-flow instrument for å undersøke både reduktive og oksidativt halv-reaksjoner fra<em&gt; Aspergillus fumigatus</em&gt; Siderophore A (Sida), en Flavin-avhengig monooxygenase. Så viser spektrene tilsvarende artene på den reaksjonen av Sida og vi beregne hastighetskonstanter for dannelse deres.

Overvåking av reduktiv og oksidativt halv-reaksjoner av en Flavin-avhengig Monooxygenase hjelp Stoppet-Flow Spektrofotometri

Aspergillus fumigatus siderophore A (SidA) is an FAD-containing monooxygenase that catalyzes the hydroxylation of ornithine in the biosynthesis of ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

High-throughput Protein Expression Generator Ved hjelp av en Microfluidic Platform

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Monitoring the Wall Mechanics During Stent Deployment in a Vessel

Overvåking veggen Mechanics Under Stent Deployment i en Vessel

Clinical trials have reported different restenosis rates for various stent designs1. It is speculated that stent-induced strain concentrations on the ...

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

Ikke-kontakt, Label-fri Overvåking av celler og ekstracellulær matriks med Raman spektroskopi

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

Mass Cytometry: Protocol for Daily Tuning and Running Cell Samples on a CyTOF Mass Cytometer

Mass cytometri: Protokoll for Daily Tuning og kjører celleprøver på en CyTOF Mass cytometer

In recent years, the rapid analysis of single cells has commonly been performed using flow cytometry and fluorescently-labeled antibodies. However, the ...

Surgical Technique for the Implantation of Tissue Engineered Vascular Grafts and Subsequent In Vivo Monitoring

Surgical Technique for the Implantation of Tissue Engineered Vascular Grafts and Subsequent In Vivo Monitoring

Kirurgisk teknikk for Implantasjon av Tissue Engineered vaskulære implantater og Følgende<em&gt; I Vivo</em&gt; Overvåking

The development of Tissue Engineered Vessels (TEVs) is advanced by the ability to routinely and effectively implant TEVs (4-5 mm in diameter) into a large ...

Real Time Monitoring of Intracellular Bile Acid Dynamics Using a Genetically Encoded FRET-based Bile Acid Sensor

Sanntidsovervåking av Intracellulær gallesyre Dynamics Ved hjelp av en genetisk kodet FRET baserte gallesyre Sensor

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. ...

Intra-cardiac Side-Firing Light Catheter for Monitoring Cellular Metabolism using Transmural Absorbance Spectroscopy of Perfused Mammalian Hearts

Intra-CARDIAC side-avfyring lys kateter for overvåking Cellular metabolisme bruker transmuralt absorbansen spektroskopi av Perfusert pattedyr hjerter

Absorbance spectroscopy of cardiac muscle provides non-destructive assessment of cytosolic and mitochondrial oxygenation via myoglobin and cytochrome ...

Preclinical Cardiac Electrophysiology Assessment by Dual Voltage and Calcium Optical Mapping of Human Organotypic Cardiac Slices

Preklinisk hjertelektrofysiologi vurdering av dual spenning og kalsium optisk kartlegging av humane organotypiske hjerteskiver

Human cardiac slice preparations have recently been developed as a platform for human physiology studies and therapy testing to bridge the gap between ...

Imaging and Quantification of the Area of Fast-Moving Microbubbles Using a High-Speed Camera and Image Analysis

Bildebehandling og kvantifisering av området av hurtiggående mikrobobler ved hjelp av et høyhastighetskamera og bildeanalyse

An experimental and image analysis technique is presented for imaging cavitation bubbles and calculating their area. The high-speed imaging experimental ...