Name: monitoring the reductive and oxidative half-reactions of a flavin-dependent monooxygenase using stopped-flow spectrophotometry
Uploaded: 2012-03-18T14:00:00
Duration: 12 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Monitoring the Reductive and Oxidative Half-Reactions of a Flavin-Dependent Monooxygenase using Stopped-Flow Spectrophotometry at JoVE.com

Работа поддержана NSF награду MCB-1021384.

<ol>
	<li>Hissen, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Aspergillus+fumigatus+siderophore+biosynthetic+gene+sidA,+encoding+L&#45;ornithine+N5&#45;oxygenase,+is+required+for+virulence.">The Aspergillus fumigatus siderophore biosynthetic gene sidA, encoding L&#45;ornithine N5&#45;oxygenase, is required for virulence.</a> Infect. Immun. 73 (9), 5493-5503 (2005).</li><li>Chocklett, S. W., Sobrado, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspergillus+fumigatus+SidA+is+a+highly+specific+ornithine+hydroxylase+with+bound+flavin+cofactor.">Aspergillus fumigatus SidA is a highly specific ornithine hydroxylase with bound flavin cofactor.</a> Biochemistry. 49 (31), 6777-6783 (2010).</li><li>Mayfield, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+spectroscopic,+steady+state,+and+transient+kinetic+studies+of+a+representative+siderophore&#45;associated+flavin+monooxygenase.">Comprehensive spectroscopic, steady state, and transient kinetic studies of a representative siderophore&#45;associated flavin monooxygenase.</a> J. Biol. Chem. 285 (40), 30375-30388 (2010).</li><li>Fierke, C. A., Hammes, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+kinetic+approaches+to+enzyme+mechanisms.">Transient kinetic approaches to enzyme mechanisms.</a> Contemporary enzyme kinetics and mechanism. , (2009).</li><li>Palfey, B. A., McDonald, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+catalysis+in+flavin-dependent+monooxygenases.">Control of catalysis in flavin-dependent monooxygenases.</a> Arch. Biochem. Biophys. 493 (1), 26-26 (2010).</li><li>van Berkel, W. J. H., Kamerbeek, N. M., Fraaije, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flavoprotein+monooxygenases,+a+diverse+class+of+oxidative+biocatalysts.">Flavoprotein monooxygenases, a diverse class of oxidative biocatalysts.</a> J. Biotechnol. 124 (4), 670-689 (2006).</li><li>Chapman, S. K., Reid, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Flavoprotein Protocols. , (1999).</li><li>Sobrado, P., Fitzpatrick, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solvent+and+primary+deuterium+isotope+effects+show+that+lactate+CH+and+OH+bond+cleavage+are+concerted+in+Y254F+flavocytochrome+b2,+consistent+with+a+hydride+transfer+mechanism.">Solvent and primary deuterium isotope effects show that lactate CH and OH bond cleavage are concerted in Y254F flavocytochrome b2, consistent with a hydride transfer mechanism.</a> Biochemistry. 42, 15208-15214 (2003).</li><li>Kumar, S., Gawandi, V. B., Capito, N., Phillips, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substituent+effects+on+the+reaction+of+Î²-benzoylalanines+with+Pseudomonas+fluorescens+kynureninase.">Substituent effects on the reaction of Î²-benzoylalanines with Pseudomonas fluorescens kynureninase.</a> Biochemistry. 49 (36), 7909-7913 (2010).</li><li>Yun, D., Garc&#237;a-Serres, R., Chicalese, B. M., An, Y. H., Huynh, B. H., Bollinger, J. M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=(&#956;-1,2-Peroxo)diiron(III/III)+complex+as+a+precursor+to+the+diiron(III/IV)+intermediate+X+in+the+assembly+of+the+iron&#45;radical+cofactor+of+ribonucleotide+reductase+from+mouse.">(&#956;-1,2-Peroxo)diiron(III/III) complex as a precursor to the diiron(III/IV) intermediate X in the assembly of the iron&#45;radical cofactor of ribonucleotide reductase from mouse.</a> Biochemistry. 46 (7), 1925-1932 (2007).</li><li>Pennati, A., Zanetti, G., Aliverti, A., Gadda, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+salt+and+pH+on+the+reductive+half-reaction+of+Mycobacterium+tuberculosis+FprA+with+NADPH+Biochemistry.">Effect of salt and pH on the reductive half-reaction of Mycobacterium tuberculosis FprA with NADPH Biochemistry.</a> Biochemistry. 47 (11), 3418-3425 (2008).</li><li>Patil, P. V., Allou, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+protocatechuate+dioxygenase+for+maintaining+anaerobic+conditions+in+biochemical+experiments.">The use of protocatechuate dioxygenase for maintaining anaerobic conditions in biochemical experiments.</a> Analytical Biochemistry. 286 (2), 187-192 (2000).</li></ol>

Нам нечего раскрывать.

Ферменты, которые катализируют окислительно-восстановительных реакций обычно содержат кофакторов, таких как гема и флавинов, которые подвергаются значительным изменениям абсорбции в ходе каталитического цикла. Окисленной формы флавин представляет поглощение максимума при ~ 360 и 450 нм, а его сокращение, как правило, контролируются после поглощения снижения при 450 нм 7. В общем, некоторые промежуточные переходные присутствуют, но форма и распад слишком быстро, чтобы быть измерена в обычных спектрофотометров. Использование прикладного Фотофизика SX20 остановил поток спектрофотометр (или аналогичные инструменты), то можно измерить абсорбцию изменения в масштабе времени миллисекунды (мертвое время, 2 мс). Здесь мы изучали восстановительного и окислительного половина реакции флавин-зависимой монооксигеназной е SIDA, выступающей в качестве модели. Скорость передачи гидрид было определено путем измерения изменения поглощения при 452 нм после смешивания ферментов с NADPH в анаэробных условиях. Впоследствии, принимая advantagе двойного смешивания режим остановил поток инструмент, фермент впервые взаимодействует с NADPH, до полного снижение было достигнуто, то снижение фермент НАДФ + комплекс в смеси с кислородом. После этой процедуры, можно обнаружить переходные кислородом промежуточных флавин и измерять скорости образования и распада. Идентификация этих промежуточных обеспечивает экспериментальные данные о природе реагирующих частиц в катализе. В случае е SIDA, формирование C4a-hydroperoxyflavin (как правило, контролируется на 370-380 нм), который является hydroxylating видов. Кроме того, измерения константы скорости каждым шагом позволяет получить информацию о лимитирующей стадии реакции и помочь выяснить кинетических и химических механизмов фермента. В целом, аналогичные подходы могут быть использованы для других flavoenzymes, или белки, для которых поглощение произошли изменения, такие как белки, продолжениеАйн гема, пиридоксаль-фосфат, или негемового железа 8-10. Ограничение этого метода является то, что большое количество очищенных ферментов не требуется, но это можно преодолеть с помощью выражения системы с высокой урожайностью. Один определяет оптимальную концентрацию белка для регистрации спектров с помощью достаточно белка, так что достаточно сильный сигнал можно наблюдать, но не слишком много, так что фермент не зря. Как правило, самые низкие концентрации ферментов для флавин-содержащих ферментов, используемых в остановили поток экспериментов 6-10 мкм (после смешивания) и определяется с помощью соответствующего молярный коэффициент погашения фермента. В случае е SIDA, доля фермента связаны FAD является 50-65% 2. Апо-белков считается неактивным в этих экспериментах, так как связанные кофактора FAD необходимо для катализа. Другим возможным ограничением этого метода является то, если процессы в фермента происходит быстрее, чем 2 мс (мертвое время остановить поток), они не будут соблюдаться, но япрежде чем сообщается стратегии, где ставки могут быть снижены для преодоления этой проблемы. Одним из примеров этого включает в себя использование высоких концентраций NaCl в реакции ферредоксин-НАДФ +-редуктазы 11. Очистка кислорода из потока цепи остановился поток часто является хитрый шаг в этом эксперименте и требует особого внимания. Глюкозооксидазы глюкозы система, описываемая здесь успешно используется в большинстве лабораторий, как это эффективный и недорогой метод. Тем не менее, есть некоторые недостатки, которые включают производство H 2 O 2, а для некоторых приложений других вариантов, как protocatechuate dioxygenase-protocatechuate система должна рассматриваться 12. Использование анаэробных перчаточный ящик позволяет легко обеспечить анаэробные условия, но не является существенным. Кислород должен быть удален из потока цепи остановил поток, как мы хотим, чтобы фермент должны быть сокращены в отсутствие кислорода или вступать в реакцию с кислородом в концентрациис, что мы указываем. Несмотря на то, остановил поток находится в перчаточном ящике, есть кислород в циркуляционный контур если бы мы использовали аэробных буфера в предыдущих экспериментах. В дополнение к поглощению измерения флуоресценции и кругового дихроизма анализов может быть выполнена в прикладной Фотофизика SX20 остановил поток спектрофотометр с соответствующими аксессуарами.

<table border="1"><tbody><tr><td> Генеральный лабораторное оборудование </td><td> Компания </td><td> Номер по каталогу </td></tr><tr><td> Вакуум-насос </td><td> Скрываться, не уплатив проигрыша </td><td> - </td></tr><tr><td> Бюхнер колбы </td><td> Рыбак </td><td> 70340-500 </td></tr><tr><td> Движение баров </td><td> Рыбак </td><td> 14-512-129 </td></tr><tr><td> Движение плит </td><td> Рыбак </td><td> 11-100-49S </td></tr><tr><td> Шленка линии </td><td> Kontes стекла </td><td> - </td></tr><tr><td> Аргон танк </td><td> Airgas </td><td> AR UPC300 </td></tr><tr><td> Азот танк </td><td> Airgas </td><td> Ni200 </td></tr><tr><td> Азот бак, ультра высокой чистоты </td><td> Airgas </td><td> Н.И. UHP200 </td></tr><tr><td> Кислородная емкость </td><td> Airgas </td><td> ОХ 40 </td></tr><tr><td> 5% водорода баланс азота танк </td><td> Airgas </td><td> X02NI95B200H998 </td></tr><tr><td> Санкт-SX20опнут потока спектрофотометр </td><td> AppliedPhotophysics </td><td> - </td></tr><tr><td> Перчаточный ящик </td><td> Застенчивый </td><td> - </td></tr><tr><td> Водяная баня </td><td> Brinkmann Lauda </td><td> - </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Запас </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 50 мл BD Сокол труб </td><td> Рыбак </td><td> 14-432-23 </td></tr><tr><td> 15 мл BD Сокол конических труб </td><td> Рыбак </td><td> 05-527-90 </td></tr><tr><td> 1,5 мл труб Эппендорф микроцентрифужных </td><td> Рыбак </td><td> 05-402-18 </td></tr><tr><td> 50 и 25 мл флаконы стеклянные </td><td> Рыбак </td><td> 06-402 </td></tr><tr><td> Резиновые пробки </td><td> Рыбак </td><td> 06-447H </td></tr><tr><td> Алюминиевые уплотнения </td><td> Рыбак </td><td> 06-406-15 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Ригенц </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Фосфат калия, однозамещенный </td><td> Рыбак </td><td> AC2714080025 </td></tr><tr><td> Фосфат калия, двухосновной </td><td> Рыбак </td><td> P288-500 </td></tr><tr><td> Ацетат натрия </td><td> Сигма </td><td> S-2889 </td></tr><tr><td> Глюкозооксидазы из A. Нигер </td><td> Сигма </td><td> G7141-250KU </td></tr><tr><td> D-глюкозы </td><td> Рыбак </td><td> D16-500 </td></tr><tr><td> β-NADPH </td><td> Рыбак </td><td> ICN10116783 </td></tr><tr><td> L (+)-орнитин гидрохлорид </td><td> Рыбак </td><td> ICN10116783 </td></tr></tbody></table>

monitoring the reductive and oxidative half-reactions of a flavin-dependent monooxygenase using stopped-flow spectrophotometry

Aspergillus fumigatus siderophore A (SidA) is an FAD-containing monooxygenase that catalyzes the hydroxylation of ornithine in the biosynthesis of hydroxamate siderophores that are essential for virulence (e.g. ferricrocin or N',N",N'''-triacetylfusarinine C)1. The reaction catalyzed by SidA can be divided into reductive and oxidative half-reactions (Scheme 1). In the reductive half-reaction, the oxidized FAD bound to Af SidA, is reduced by NADPH2,3. In the oxidative half-reaction, the reduced cofactor reacts with molecular oxygen to form a C4a-hydroperoxyflavin intermediate, which transfers an oxygen atom to ornithine. Here, we describe a procedure to measure the rates and detect the different spectral forms of SidA using a stopped-flow instrument installed in an anaerobic glove box. In the stopped-flow instrument, small volumes of reactants are rapidly mixed, and after the flow is stopped by the stop syringe (Figure 1), the spectral changes of the solution placed in the observation cell are recorded over time. In the first part of the experiment, we show how we can use the stopped-flow instrument in single mode, where the anaerobic reduction of the flavin in Af SidA by NADPH is directly measured. We then use double mixing settings where Af SidA is first anaerobically reduced by NADPH for a designated period of time in an aging loop, and then reacted with molecular oxygen in the observation cell (Figure 1). In order to perform this experiment, anaerobic buffers are necessary because when only the reductive half-reaction is monitored, any oxygen in the solutions will react with the reduced flavin cofactor and form a C4a-hydroperoxyflavin intermediate that will ultimately decay back into the oxidized flavin. This would not allow the user to accurately measure rates of reduction since there would be complete turnover of the enzyme. When the oxidative half-reaction is being studied the enzyme must be reduced in the absence of oxygen so that just the steps between reduction and oxidation are observed. One of the buffers used in this experiment is oxygen saturated so that we can study the oxidative half-reaction at higher concentrations of oxygen. These are often the procedures carried out when studying either the reductive or oxidative half-reactions with flavin-containing monooxygenases. The time scale of the pre-steady-state experiments performed with the stopped-flow is milliseconds to seconds, which allow the determination of intrinsic rate constants and the detection and identification of intermediates in the reaction4. The procedures described here can be applied to other flavin-dependent monooxygenases.5,6

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring the Reductive and Oxidative Half-Reactions of a Flavin-Dependent Monooxygenase using Stopped-Flow Spectrophotometry at JoVE.com

Monitoring the Reductive and Oxidative Half-Reactions of a Flavin-Dependent Monooxygenase using Stopped-Flow Spectrophotometry

Мы описываем использование остановил поток инструментом для исследования и восстановительного и окислительного половины реакций<em&gt; Aspergillus фумигатус</em&gt; Сидерофора (SIDA), флавин-зависимой монооксигеназной. Затем мы показываем, спектров, соответствующих видов реакции SIDA и вычислить константы скорости их образования.

Мониторинг восстановительной и окислительной Half-Реакции Флавин-зависимой монооксигеназной использованием Остановлено-Flow спектрофотометрии

Aspergillus fumigatus siderophore A (SidA) is an FAD-containing monooxygenase that catalyzes the hydroxylation of ornithine in the biosynthesis of ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

Высокая пропускная способность экспрессии белков генератора с использованием платформы Микрофлюидных

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Monitoring the Wall Mechanics During Stent Deployment in a Vessel

Мониторинг стены механики во время установки стента в сосуде

Clinical trials have reported different restenosis rates for various stent designs1. It is speculated that stent-induced strain concentrations on the ...

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

Бесконтактная, этикетки без мониторинга клеток и внеклеточного матрикса использованием спектроскопии комбинационного

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

Mass Cytometry: Protocol for Daily Tuning and Running Cell Samples on a CyTOF Mass Cytometer

Массовые цитометрии: Протокол для ежедневного настройка и запуск образцы клеток на Цитометр массовой CyTOF

In recent years, the rapid analysis of single cells has commonly been performed using flow cytometry and fluorescently-labeled antibodies. However, the ...

Surgical Technique for the Implantation of Tissue Engineered Vascular Grafts and Subsequent In Vivo Monitoring

Surgical Technique for the Implantation of Tissue Engineered Vascular Grafts and Subsequent In Vivo Monitoring

Хирургическая техника для имплантации тканей Engineered сосудистые протезы и последующих<em&gt; В Vivo</em&gt; Мониторинг

The development of Tissue Engineered Vessels (TEVs) is advanced by the ability to routinely and effectively implant TEVs (4-5 mm in diameter) into a large ...

Real Time Monitoring of Intracellular Bile Acid Dynamics Using a Genetically Encoded FRET-based Bile Acid Sensor

Недвижимость Мониторинг Время внутриклеточного желчных кислот Dynamics Использование генетически кодируемых FRET основе желчных кислот датчик

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. ...

Intra-cardiac Side-Firing Light Catheter for Monitoring Cellular Metabolism using Transmural Absorbance Spectroscopy of Perfused Mammalian Hearts

Внутрисердечная боковая стрельба Световой катетер для мониторинга клеточного метаболизма с помощью трансмуральной абсорбции спектроскопии Перфизуд млекопитающих сердец

Absorbance spectroscopy of cardiac muscle provides non-destructive assessment of cytosolic and mitochondrial oxygenation via myoglobin and cytochrome ...

Preclinical Cardiac Electrophysiology Assessment by Dual Voltage and Calcium Optical Mapping of Human Organotypic Cardiac Slices

Доклиническая кардиологическая электрофизиология по двойному напряжению и оптическому картированию кальция органов человеческого сердца

Human cardiac slice preparations have recently been developed as a platform for human physiology studies and therapy testing to bridge the gap between ...

Imaging and Quantification of the Area of Fast-Moving Microbubbles Using a High-Speed Camera and Image Analysis

Изображение и количественная оценка области быстро движущихся микропузырей с помощью высокоскоростной камеры и анализа изображений

An experimental and image analysis technique is presented for imaging cavitation bubbles and calculating their area. The high-speed imaging experimental ...

Labeling of Extracellular Vesicles for Monitoring Migration and Uptake in Cartilage Explants

Маркировка внеклеточных везикул для мониторинга миграции и поглощения в хрящевых эксплантатах

Extracellular vesicles (EVs) are used in different studies to prove their potential as a cell-free treatment due to their cargo derived from their ...