Name: monitoring the reductive and oxidative half-reactions of a flavin-dependent monooxygenase using stopped-flow spectrophotometry
Uploaded: 2012-03-18T14:00:00
Duration: 12 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Monitoring the Reductive and Oxidative Half-Reactions of a Flavin-Dependent Monooxygenase using Stopped-Flow Spectrophotometry at JoVE.com

Forskning som stöds av NSF utmärkelsen MCB-1.021.384.

1. Beredning av Anaerob buffert <ol><li> Framställ 1 L av 100 mM kaliumfosfatbuffert, pH 7,5. Häll 250 ml av bufferten i en 500-ml Buchner-kolv med en omrörare. </li><li> Tillslut kolven med en gummipropp och placera den på en uppståndelse platta. Ansluta det korta röret av kolven till en Schlenk-ledning. </li><li> Avgasa buffert under vakuum under 5 timmar vid rumstemperatur med omrörning. Under denna tidsperiod, gör 5 på varandra följande rundor av vakuumavgasning och spolning med argon varje timme. </li><li> Spola kolven med argon i 10 sekunder och koppla bort den från vakuumgrenröret. Placera kolven inuti handskbox. </li><li> Låt kolven öppen i handskfacket över natten kraftig omrörning. </li></ol> 2. Avlägsnande av syre från den Stopped-Flow System <ol><li> Framställ 1 L av 0,1 M natriumacetat, pH 5,0. Häll 125 ml av denna buffert till en 250-ml Büchner kolv och utföra steg 1,2-1,4. </li><li> Väg ut 5mg glukosoxidas från Aspergillus niger (181.300 U / g) och 0,9 g glukos med användning av en 1,5 ml Eppendorf-rör och 50 ml Falcon koniskt rör, respektive. Placera båda behållarna i handskfacket. </li><li> Lös glukosoxidas och glukos i 50 ml av anaerob 0,1 M natriumacetat, pH 5,0 (slutlig koncentration av 18,13 E / ml och 100 mM, respektive). Fylla reservoaren sprutor med denna lösning (Figur 1). </li><li> Se till att driva ventilerna är i &quot;Load&quot; läge och fylla driver sprutorna (figur 1). Vrid F ventilen till &quot;kör&quot;-läget. Töm stoppet sprutan genom att klicka på Töm i Pro-Data styrprogram. Tryck på bufferten från enhet sprutan F genom flödet kretsen genom att manuellt höja motsvarande enhet RAM. Upprepa detta steg tio gånger totalt. Utför samma procedur med de andra tre köra sprutor. Vänta en timme. </li><li> Ersätta lösningen av reservoaren sprutor med samma buffert contaiNing glukosoxidas och glukos. Upprepa steg 2,4. </li><li> Upprepa steg 2,5 och låt lösningen stå i flödet systemet över natten. </li><li> Efter inkubering över natten, upprepa steg 2,5. </li></ol> 3. Framställning av syremättad Buffert <ol><li> Framställ 100 mM buffert kaliumfosfat (pH 7,5) och häll 50 ml till en 50-ml flaska med en omrörarstav. Förslut flaskan med en Wheaton propp och en Wheaton aluminiumförsegling. </li><li> Placera flaskan på is. Doppa en lång nål ansluten till en tank innehållande 100% syre i lösningen. Sätt in en annan kort nål genom proppen på flaskan som en ventil. </li><li> Bubbla lösningen med 100% syre under 1 timme med omrörning. </li><li> Ta först bort den korta nålen ur flaskan och vänta 10 sekunder innan du tar bort den långa nålen. Placera den stängda flaskan i handskfacket. </li></ol> 4. Beredning av NADPH lösning <ol><li> Väg upp 1 mg NADPH i en 1,5 ml Eppendorf-rör och placera it in i handskfacket. </li><li> Upplösa NADPH i 300 | il av anaerob 100 mM kaliumfosfatbuffert, pH 7,5. Avlägsna 30 | il av denna lösning från handskboxen för att bestämma den NADPH koncentration med en spektrofotometer (e 340 nm = 6270 M -1 cm -1). </li></ol> 5. Avlägsnande av syre från enzymlösningen <ol><li> Ta 400 | il av enzymet stamlösning från frysen och tina i handskbox. Enzymet stamlösning (360 pM) har tidigare framställts i 100 mM kaliumfosfatbuffert (pH 7,5) innehållande 100 mM NaCl och frystes i flytande kväve. </li><li> Överföra enzymlösningen till en 25-ml flaska med en omrörarstav, en kapsyl på flaskan med en Wheaton propp och en Wheaton aluminiumförsegling och avlägsna från handskboxen. </li><li> Placera flaskan på is och ansluta den till en Schlenk-ledning genom införande av en nål genom proppen till flaskan. </li><li> Avgasa enzymlösningen genom att utföra 5 på varandra följande rundor avdammsuga avgasning och spolning med argon var 20: e minut under 1 timme. </li><li> Spola injektionsflaska med argon i 10 sekunder och koppla bort den från vakuumgrenröret. Placera flaskan på is inne i handskfacket. </li></ol> 6. Reduktiv Half-reaktion: Övervakning Flavin Minskning <ol><li> Förbered slutade flöde instrument och Pro-Data styrprogram för enkel blandning läge efter tillverkarens protokoll. </li><li> Slå på ett cirkulerande vattenbad (15 ° C). Avlägsna syre från vattnet genom att bubbla kväve genom den under 20 minuter. Detta förhindrar kontaminering med syre genom flödeskretsen. </li><li> Bibehålla temperaturen hos de drivande sprutor och observationen cellen vid 15 ° C genom att ansluta höljet vattenbad av stoppat flöde till den cirkulerande badet. </li><li> I Kontrollpanelen fönster Pro-Data styrprogram välj Photodiode Array, Extern trigg (för att aktivera stoppas flöde transaktion), och Logarithmic skala. </li><li> Starta Pro-Data Viewer och definiera den katalog där data ska lagras. </li><li> Ersätta lösningen av reservoaren sprutor C och F med anaerob 100 mM kaliumfosfatbuffert (pH 7,5). Vrid C och ventilerna F till &quot;kör&quot;-läget. Töm stoppet sprutan genom att klicka på Töm i Pro-Data styrprogram. Tryck på bufferten från båda kör sprutor genom flödet kretsen genom att manuellt höja motsvarande enhet ram fem gånger totalt (klicka Töm före varje rörelse RAM). </li><li> För att säkerställa att glukos-oxidas har avlägsnats helt från strömningskretsen, utför steg 6.6 fyra gånger totalt. </li><li> Klicka på utgångsvärdet i Pro-Data styrprogram. </li><li> Blanda 100 | il av enzymet stamlösning med 1100 | il av anaerob 100 mM kaliumfosfatbuffert (slutlig koncentration efter blandning i stoppas flödet av 15 ^ M). </li><li> Byt ut lösningen av reservoaren SYRInge F med enzymlösningen. Vrid F ventilen till &quot;kör&quot;-läget. Töm stoppet sprutan genom att klicka på Töm i Pro-Data styrprogram. Tryck på enzymlösningen från enhet sprutan F genom flödet kretsen genom att manuellt höja motsvarande enhet RAM. Utför detta tre gånger totalt. I Pro-data styrprogram, som ackvisitionstiden till 60 sekunder. </li><li> Se till att båda driver sprutor fylls med motsvarande lösningar och enheten baggar är i kontakt med kolvarna kör sprutan. Vrid båda ventilerna till &quot;drive&quot; position och klicka förvärvar i Pro-Data styrprogram för att utföra enheten. Upprepa detta steg två gånger för att erhålla data i tre exemplar. Detta ger spektra av den oxiderade formen av enzymet. </li><li> Med A 452 nm värde som erhålls från de enheter, bestämma enzymkoncentrationen före blandning (s 452 nm = 13.700 M -1 cm -1) och förbereda 4 ml av en NADPH solution 1,5-faldigt mer koncentrerad. </li><li> Byt ut lösningen av behållaren spruta C med NADPH lösningen och tomma och fylla stopp sprutan tre gånger som beskrivs i 6,10. </li><li> Upprepa steg 6,11. Detta ger spektra under reduktionen av enzymet. </li></ol> 7. Oxidativ Half-reaktion: Övervakning Flavin Oxidation <ol><li> Förbered slutade flöde instrument och Pro-Data styrprogram för dubbelrum blandning läge efter tillverkarens protokoll. </li><li> Upprepa steg 6,2-6,5. </li><li> Ersätta lösningen i de fyra reservoar sprutor med anaerob 100 mM kaliumfosfatbuffert (pH 7,5). Vrid F ventilen till &quot;drive&quot;-läget. Töm stoppet sprutan genom att klicka på Töm i Pro-Data styrprogram. Tryck bufferten från enheten sprutan F genom flödet kretsen genom att manuellt öka den motsvarande enheten tryckkolv. Utför detta steg fem gånger i sin helhet varje enhet spruta. </li><li> Utför steg 7.3 fyra gånger i total för att fullständigt avlägsna innehållet från strömningskretsen. </li><li> Klicka utgångsvärdet i Pro-Data styrprogram. </li><li> Blanda 200 | il av enzymet stamlösning med 1000 | il av anaerob 100 mM kaliumfosfatbuffert (slutlig koncentration efter blandning i stoppas flödet av 15 ^ M). </li><li> Ersätta lösningen av reservoaren spruta A med enzymlösningen. Vrid En ventil till &quot;kör&quot;-läget. Töm stoppet sprutan genom att klicka på Töm i Pro-Data styrprogram. Tryck enzymlösningen från enhet spruta A genom flödeskretsen genom att manuellt öka den motsvarande enheten tryckkolv. Utför detta steg tre gånger totalt. I Pro-data styrprogram, ställa in tidsfördröjningen för 0,5 s och ackvisitionstid till 60 sekunder. </li><li> Se till att alla kör sprutor är fyllda med motsvarande lösningar och enheten baggar är i kontakt med kolvarna kör sprutan. Vänd alla ventiler till &quot;drive&quot; position och klicka förvärvar i Pro-Datett styrprogram för att utföra enheten. Upprepa detta steg två gånger till för att erhålla data i tre exemplar. Detta ger spektra av den oxiderade formen av enzymet. </li><li> Byt ut lösningen av behållaren spruta B med en NADPH-lösning 1,5-faldigt mer koncentrerad än den enzymlösningen i spruta A. Vrid B ventilen till &quot;drive&quot;-läge och töm och fyll stoppet sprutan tre gånger som beskrivs i 7,7. </li><li> Byt ut lösningen av behållaren spruta C med syresatt buffert. Vrid C ventilen till &quot;drive&quot;-läge och töm och fyll stoppet sprutan tre gånger som beskrivs i 7,7. I Pro-Data styrprogram, ställ in fördröjningen och förvärv tid på 15 och 900 s, respektive. </li><li> Upprepa steg 7,8. Detta ger spektra under återoxidation av den fullständigt reducerade enzymet. </li></ol> 8. Dataanalys <ol><li> Starta Pro-Data Converter. Klicka på ikonen Alternativ och välj Spara i ProDataCSV. </li><li> Öppetkatalogen där datafiler förvarades. Dra filerna till APL Pro-Data Converter fönster. Uppgifterna sparas automatiskt som CSV-filer i samma katalog. </li><li> Öppna CSV-filer med Microsoft Excel (Microsoft, Redmond, WA, USA). Normalisera baslinje stoppat flöde spår genom att subtrahera den motsvarande absorption vid 700 nm. </li><li> Analysera de korrigerade spår med KaleidaGraph (Synergy Software, Reading, PA) genom att passa handlingen i absorbansen vid motsvarande maximala funktion av tiden till lämplig exponentiell funktion. Såsom visas i figur 2B, absorbansen vid 452 nm plottades som en funktion av tiden för att bestämma hastigheten av flavin reduktion efter blandning av enzymet och NADPH i stoppat flöde instrumentet. I detta fall var den bästa passningen av de data som erhållits med hjälp av en dubbel exponentiell ekvation och andelen 0,65 och 0,23 s -1 beräknades för den första och andra etappen av minskning, respectively. För att bestämma hastigheten för bildning av C4a-hydroperoxyflavin intermediären och återoxidation efter omsättning av den reducerade enzymet med syre, analyserade vi stoppat flöde spår vid 380 och 452 nm, respektive (Figur 3B). Med ett och samma exponentiell ekvation, beräknade vi andelen 1,4 och 0,006 s -1 för första och andra steget i den oxidativa halv-reaktion, respektive. </li></ol> 9. Representativa resultat Resultaten från de experiment som beskrivs i föregående avsnitt visar hur den reduktiva halv-reaktion av Af Sida kan övervakas genom att mäta förändringarna i absorbansen vid 452 nm, vilket motsvarar förändringarna i redox-tillståndet hos flavin. Hastigheten för detta steg kan bestämmas genom att anpassa data till den lämpliga ekvationen (figur 2; Steg 8,4). Minskningen som erhålls (0,65 s -1) liknar den k katten beräknat medsteady-state experiment 2, vilket antyder att minskningen är den hastighetsbestämmande steget av reaktionen. Med utnyttjande av det dubbla blandning läge i stoppat flöde, kan hastigheten för oxidation och mellanproduktema i föreliggande halv-reaktionen bestämdes (figur 3; Steg 8,4). I reaktionen som katalyseras av Af Sida är C4a-hydroperoxyflavin detekteras tydligt (λ max 380 nm), och hastigheten för bildning och nedbrytning kan beräknas. Den långsamma den erhållna återoxidering (0,006 s -1) indikerar att C4a-hydroperoxyflavin är mycket stabil i frånvaro ornitin. <img alt="Schema 1" src="/files/ftp_upload/3803/3803scheme1.jpg" /> Schema 1. Mekanism av A f Sida. Den isoallozaxine ringen av FAD kofaktor visas. Den oxiderade flavin (A) binder till NADPH (B) och reagerar för att bilda reducerad flavin och NADP + (C). Efter reaktion med molekylärt syre och bindningen avornitin, är C4a-hydroperoxyflavin bildas (D). Detta är hydroxylera arter. Efter hydroxylering av ornitin, måste hydroxyflavin (E) dehydratiseras till att bilda den oxiderade enzymet. NADP + förblir bunden genom den katalytiska cykeln och är den sista produkten som skall frigöras (F). <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/3803/3803fig1.jpg" /> Figur 1. Stoppat flöde instrumentet. A) Bild av komponenterna i den Applied Photophysics SX20 stoppat flöde spektrofotometer. B) Bild på provhantering enheten. C) Scheme av flödet kretsen i dubbel blandning läge. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/3803/3803fig2.jpg" /> Figur 2. Anaerob minskning av Sida med NADPH i den stoppade flöde instrument. A) spektrala förändringar som registrerats efter blandning lika delar 30 M Sida och 45 M NADPH. Den första spektrum (oxideras Sida) och sista spektrum (fullt reducerad SidA) markeras i blått och rött, respektive. B) Absorbans spår vid 452 nm registreras som en funktion av tiden. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/3803/3803fig3.jpg" /> Figur 3. Oxidation av Sida i den stoppade flöde instrument. A) spektrala förändringar registreras efter blandning av lika volymer av den fullständigt reduceras Sida och syresatt buffert. De slutliga koncentrationerna var 15 pM Sida, 22,5 ^ M NADPH, och 0,95 mM syre. Spektrumet registrerades vid 0,034, 4,268, och 727,494 s motsvarar den fullständigt reducerade enzymet, C4a-hydroperoxyflavin mellanprodukt (λ max 380 nm), och den oxiderade enzym (λ max 450 nm), respektive. B) Absorbans spår vid 382 och 452 nm registrerades som en funktion av tiden.

<ol>
	<li>Hissen, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Aspergillus+fumigatus+siderophore+biosynthetic+gene+sidA,+encoding+L&#45;ornithine+N5&#45;oxygenase,+is+required+for+virulence.">The Aspergillus fumigatus siderophore biosynthetic gene sidA, encoding L&#45;ornithine N5&#45;oxygenase, is required for virulence.</a> Infect. Immun. 73 (9), 5493-5503 (2005).</li><li>Chocklett, S. W., Sobrado, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspergillus+fumigatus+SidA+is+a+highly+specific+ornithine+hydroxylase+with+bound+flavin+cofactor.">Aspergillus fumigatus SidA is a highly specific ornithine hydroxylase with bound flavin cofactor.</a> Biochemistry. 49 (31), 6777-6783 (2010).</li><li>Mayfield, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+spectroscopic,+steady+state,+and+transient+kinetic+studies+of+a+representative+siderophore&#45;associated+flavin+monooxygenase.">Comprehensive spectroscopic, steady state, and transient kinetic studies of a representative siderophore&#45;associated flavin monooxygenase.</a> J. Biol. Chem. 285 (40), 30375-30388 (2010).</li><li>Fierke, C. A., Hammes, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+kinetic+approaches+to+enzyme+mechanisms.">Transient kinetic approaches to enzyme mechanisms.</a> Contemporary enzyme kinetics and mechanism. , (2009).</li><li>Palfey, B. A., McDonald, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+catalysis+in+flavin-dependent+monooxygenases.">Control of catalysis in flavin-dependent monooxygenases.</a> Arch. Biochem. Biophys. 493 (1), 26-26 (2010).</li><li>van Berkel, W. J. H., Kamerbeek, N. M., Fraaije, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flavoprotein+monooxygenases,+a+diverse+class+of+oxidative+biocatalysts.">Flavoprotein monooxygenases, a diverse class of oxidative biocatalysts.</a> J. Biotechnol. 124 (4), 670-689 (2006).</li><li>Chapman, S. K., Reid, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Flavoprotein Protocols. , (1999).</li><li>Sobrado, P., Fitzpatrick, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solvent+and+primary+deuterium+isotope+effects+show+that+lactate+CH+and+OH+bond+cleavage+are+concerted+in+Y254F+flavocytochrome+b2,+consistent+with+a+hydride+transfer+mechanism.">Solvent and primary deuterium isotope effects show that lactate CH and OH bond cleavage are concerted in Y254F flavocytochrome b2, consistent with a hydride transfer mechanism.</a> Biochemistry. 42, 15208-15214 (2003).</li><li>Kumar, S., Gawandi, V. B., Capito, N., Phillips, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substituent+effects+on+the+reaction+of+Î²-benzoylalanines+with+Pseudomonas+fluorescens+kynureninase.">Substituent effects on the reaction of Î²-benzoylalanines with Pseudomonas fluorescens kynureninase.</a> Biochemistry. 49 (36), 7909-7913 (2010).</li><li>Yun, D., Garc&#237;a-Serres, R., Chicalese, B. M., An, Y. H., Huynh, B. H., Bollinger, J. M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=(&#956;-1,2-Peroxo)diiron(III/III)+complex+as+a+precursor+to+the+diiron(III/IV)+intermediate+X+in+the+assembly+of+the+iron&#45;radical+cofactor+of+ribonucleotide+reductase+from+mouse.">(&#956;-1,2-Peroxo)diiron(III/III) complex as a precursor to the diiron(III/IV) intermediate X in the assembly of the iron&#45;radical cofactor of ribonucleotide reductase from mouse.</a> Biochemistry. 46 (7), 1925-1932 (2007).</li><li>Pennati, A., Zanetti, G., Aliverti, A., Gadda, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+salt+and+pH+on+the+reductive+half-reaction+of+Mycobacterium+tuberculosis+FprA+with+NADPH+Biochemistry.">Effect of salt and pH on the reductive half-reaction of Mycobacterium tuberculosis FprA with NADPH Biochemistry.</a> Biochemistry. 47 (11), 3418-3425 (2008).</li><li>Patil, P. V., Allou, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+protocatechuate+dioxygenase+for+maintaining+anaerobic+conditions+in+biochemical+experiments.">The use of protocatechuate dioxygenase for maintaining anaerobic conditions in biochemical experiments.</a> Analytical Biochemistry. 286 (2), 187-192 (2000).</li></ol>

Vi har inget att lämna ut.

Enzymer som katalyserar redoxreaktioner innehåller vanligen kofaktorer såsom hemer och flaviner som undergår betydande absorbansförändringar under den katalytiska cykeln. Den oxiderade formen av flavin presenteras absorbansmaxima vid ~ 360 och 450 nm, och dess reduktion övervakas typiskt genom att följa absorbansen minskning vid 450 nm 7. I allmänhet vissa transienta mellanprodukter är närvarande men formen och sönderfall alltför snabb för att mätas i regelbundna spektrofotometrar. Användning av Applied Photophysics SX20 stoppat flöde spektrofotometer (eller liknande instrument), är det möjligt att mäta absorbansen förändringar i millisekunder skala (dödtid, 2 ms). Här har vi studerat de reduktiva och oxidativ halva reaktioner flavinberoende monooxygenas A f Sida, som fungerar som en modell. Hastigheten för hydridöverföring bestämdes genom att mäta förändringen av absorbansen vid 452 nm efter blandning av enzymet med NADPH under anaeroba betingelser. Därefter, med advantage av den dubbla blandningen läge för den stoppade flöde instrument var enzymet först reagera med NADPH, tills full reduktion uppnåddes, då den reducerade enzym-NADP + komplex blandades med syre. Efter denna procedur är det möjligt att upptäcka övergående syresatta Flavin intermediärer och att mäta andelen bildning och förfall. Identifieringen av dessa mellanprodukter ger experimentella data om vilken typ av de reagerande arter i katalys. I fallet med Af Sida, bildningen av C4a-hydroperoxyflavin (typiskt övervakas vid 370-380 nm), som är Med hydroxyleringsmedlet arter. Dessutom kan mätning av hastighetskonstanten för varje steg gör det möjligt att erhålla information om den hastighetsbestämmande steget av reaktionen och bidra till att belysa de kinetiska och kemiska mekanismer av enzymet. I allmänhet kan liknande metoder användas för andra flavoenzymes eller proteiner för vilka absorbansförändringar uppstått, såsom proteiner som fortsain heme, pyridoxal-fosfat, eller icke-hemjäm 8-10. En begränsning med denna metod är att stora mängder av renat enzym erfordras, men detta kan övervinnas genom användning av en expressions-system med höga utbyten. Man bestämmer den optimala proteinkoncentrationen för inspelning spektra med användning av tillräckligt med protein för att en tillräckligt stark signal kan observeras, men inte alltför mycket, så att enzymet inte går till spillo. Typiskt är den lägsta enzymkoncentrationen för flavin-innehållande enzymer som används i stoppat flöde experiment 6-10 pM (efter blandning) och bestäms med användning av motsvarande molära extinktionskoefficienten av enzymet. I fallet med Af Sida, är procentandelen av det bundna enzymet FAD 50-65% 2. Apo-protein anses som inaktiv i dessa experiment eftersom en bunden FAD kofaktor är nödvändig för katalys. En annan möjlig begränsning med denna metod är, om processer i ett enzym inträffa snabbare än 2 ms (dödtid av stoppat flöde) kommer de inte att observeras, men teere redovisas strategier där priserna kan sänkas till lösa denna fråga. Ett exempel på detta innefattar användning av en hög NaCl-koncentration i reaktionsblandningen av en ferredoxin-NADP reduktas + 11. Den skrubbning av syre från strömningskretsen i stoppat flöde är ofta en besvärlig steg i detta experiment och kräver speciell uppmärksamhet. Glukosoxidas glukos-systemet som beskrivs här används med framgång i de flesta laboratorier eftersom det är en effektiv och billig metod. Det finns emellertid vissa nackdelar, vilka innefattar framställning av H 2 O 2 och för vissa tillämpningar andra alternativ såsom protocatechuate dioxygenas-protocatechuate bör övervägas 12. Användningen av en anaerob handskbox gör det lättare att säkerställa anaeroba betingelser, men är inte väsentligt. Syre måste avlägsnas från strömningskretsen i stoppat flöde som vi vill det enzym som skall reduceras i frånvaro av syre eller reagera med syre i en koncentrations som vi anger. Även om stoppade flöde finns i handskfacket finns syre i flödet kretsen om vi använde aeroba buffertar i tidigare experiment. Förutom absorbansmätningar kan fluorescens och cirkulär dikroism analyser utföras i Applied Photophysics SX20 stoppat flöde spektrofotometer med motsvarande tillbehör.

<table border="1"><tbody><tr><td> Allmän laboratorieutrustning </td><td> Företaget </td><td> Katalognr </td></tr><tr><td> Vakuumpump </td><td> Welch </td><td> - </td></tr><tr><td> Biichner-kolvar </td><td> Fisher </td><td> 70340-500 </td></tr><tr><td> Rör om stängerna </td><td> Fisher </td><td> 14-512-129 </td></tr><tr><td> Rör om plattorna </td><td> Fisher </td><td> 11-100-49S </td></tr><tr><td> Schlenk-linjer </td><td> Kontes Glass </td><td> - </td></tr><tr><td> Argon tanken </td><td> Airgas </td><td> AR UPC300 </td></tr><tr><td> Kvävetank </td><td> Airgas </td><td> NI200 </td></tr><tr><td> Kvävetank, ultrahög renhet </td><td> Airgas </td><td> NI UHP200 </td></tr><tr><td> Syretanken </td><td> Airgas </td><td> OX 40 </td></tr><tr><td> 5% Hydrogen resten kväve tanken </td><td> Airgas </td><td> X02NI95B200H998 </td></tr><tr><td> SX20 Stop-flöde spektrofotometer </td><td> AppliedPhotophysics </td><td> - </td></tr><tr><td> Handskfack </td><td> Coy </td><td> - </td></tr><tr><td> Vattenbad </td><td> Brinkmann Lauda </td><td> - </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Förbrukningsmaterial </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 50 ml BD Falcon rör </td><td> Fisher </td><td> 14-432-23 </td></tr><tr><td> 15 ml BD Falcon koniska rör </td><td> Fisher </td><td> 05-527-90 </td></tr><tr><td> 1,5 ml Eppendorf mikrocentrifug-rör </td><td> Fisher </td><td> 05-402-18 </td></tr><tr><td> 50 och 25 ml glasflaskor </td><td> Fisher </td><td> 06-402 </td></tr><tr><td> Gummiproppar </td><td> Fisher </td><td> 06-447H </td></tr><tr><td> Aluminiumplomber </td><td> Fisher </td><td> 06-406-15 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Reagents </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Kaliumfosfat, monobasiskt </td><td> Fisher </td><td> AC2714080025 </td></tr><tr><td> Kaliumfosfat, dibasiskt </td><td> Fisher </td><td> P288-500 </td></tr><tr><td> Natriumacetat </td><td> Sigma </td><td> S-2889 </td></tr><tr><td> Glukosoxidas från A. niger </td><td> Sigma </td><td> G7141-250KU </td></tr><tr><td> D-Glukos </td><td> Fisher </td><td> D16-500 </td></tr><tr><td> β-NADPH </td><td> Fisher </td><td> ICN10116783 </td></tr><tr><td> L (+)-ornitin, hydroklorid </td><td> Fisher </td><td> ICN10116783 </td></tr></tbody></table>

monitoring the reductive and oxidative half-reactions of a flavin-dependent monooxygenase using stopped-flow spectrophotometry

Aspergillus fumigatus siderofor A (Sida) är en FAD-innehållande monooxygenas som katalyserar hydroxylering av ornitin i biosyntesen av hydroxamat sideroforer som är väsentliga för virulens (t.ex. ferricrocin eller N &#39;, N &quot;, N&#39;&#39;&#39;-triacetylfusarinine C) 1. den reaktion som katalyseras av Sida kan delas in i reduktiva och oxidativ halvreaktioner (Schema 1). I den reduktiva halv-reaktionen oxideras FAD bunden till A f Sida, reduceras med NADPH 2,3. I den oxidativa halv-reaktion den reducerade kofaktorn reagerar med molekylärt syre för att bilda en C4a-hydroperoxyflavin mellanliggande, som överför en syreatom till ornitin. Här beskriver vi ett förfarande för att mäta hastigheter och upptäcka de olika spektrala former av Sida med en stoppad flöde instrument installeras i en anaerob handskbox. I stoppat flöde instrumentet, små volymer av reaktanter blandas snabbt, och efter det att flödet stoppas genom: ee stopp spruta (figur 1), är de spektrala förändringarna av lösningen placerades i observationen cellen registrerades över tiden. I den första delen av experimentet visar vi hur vi kan använda den stoppade flöde instrument i samma läge, där den anaeroba minskningen av flavin i A f Sida NADPH är direkt mäts. Vi använder sedan dubbla blanda inställningarna där A f Sida först anaerobt minskas med NADPH under en bestämd tidsperiod i en åldrande slinga, och sedan reagera med molekylärt syre i observationen cellen (Figur 1). För att utföra detta experiment, anaeroba buffertar är nödvändiga eftersom bara den reduktiva halv-reaktionen övervakas, kommer något syre i lösningarna reagerar med den reducerade flavin kofaktor och bildar en C4a-hydroperoxyflavin intermediär som i slutändan kommer att sönderfalla tillbaka till den oxiderade flavin . Detta skulle inte tillåta användaren att exakt mäta nedsättningar eftersom det skulle vara komplett omsättning EnzYME. När den oxidativa halv-reaktionen studeras enzymet måste minskas i frånvaro av syre, så att bara de stegen mellan reduktion och oxidation observeras. En av de buffertar som används i detta experiment är syre mättades så att vi kan studera den oxidativa halv-reaktionen vid högre koncentrationer av syre. Det är ofta de tester som utfördes när man studerar antingen reduktiva eller oxidativ halva reaktioner med flavin innehåller monooxygenases. Den tidsskala pre-steady-state experiment utförda med stoppad-flödet är millisekunder till sekunder, som tillåter såväl fastställandet av inneboende hastighetskonstanter och upptäckt och identifiering av mellanprodukter i reaktionen 4. De förfaranden som beskrivs här kan appliceras på andra flavinberoende monooxygenases. 5,6

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring the Reductive and Oxidative Half-Reactions of a Flavin-Dependent Monooxygenase using Stopped-Flow Spectrophotometry at JoVE.com

Monitoring the Reductive and Oxidative Half-Reactions of a Flavin-Dependent Monooxygenase using Stopped-Flow Spectrophotometry

Beskriver vi användningen av en stoppat flöde instrument för att undersöka både reducerande och oxiderande halvreaktioner som<em&gt; Aspergillus fumigatus</em&gt; Siderofor A (Sida), en flavinberoende monooxygenas. Vi visar sedan spektra som motsvarar arten i reaktionen Sida och vi beräknar att hastighetskonstanterna för deras bildande.

Övervakning de reduktiva och oxidativ Halva Reaktioner av en flavinberoende monooxygenas med Stoppad-Flow Spektrofotometri

Aspergillus fumigatus siderophore A (SidA) is an FAD-containing monooxygenase that catalyzes the hydroxylation of ornithine in the biosynthesis of ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

Hög genomströmning Protein Expression Generator Med en mikroflödessystem plattform

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Monitoring the Wall Mechanics During Stent Deployment in a Vessel

Övervakning av Wall Mechanics Under stentutveckling i ett kärl

Clinical trials have reported different restenosis rates for various stent designs1. It is speculated that stent-induced strain concentrations on the ...

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

Beröringsfri, Label-free övervakning av celler och extracellulär matris med Raman-spektroskopi

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

Mass Cytometry: Protocol for Daily Tuning and Running Cell Samples on a CyTOF Mass Cytometer

Mass Cytometry: Protokoll för Daily Tuning och kör prover cell på en CyTOF Mass Cytometer

In recent years, the rapid analysis of single cells has commonly been performed using flow cytometry and fluorescently-labeled antibodies. However, the ...

Surgical Technique for the Implantation of Tissue Engineered Vascular Grafts and Subsequent In Vivo Monitoring

Surgical Technique for the Implantation of Tissue Engineered Vascular Grafts and Subsequent In Vivo Monitoring

Kirurgisk teknik för implantation av vävnadstekniska kärlimplantat och efterföljande<em&gt; In Vivo</em&gt; Övervakning

The development of Tissue Engineered Vessels (TEVs) is advanced by the ability to routinely and effectively implant TEVs (4-5 mm in diameter) into a large ...

Real Time Monitoring of Intracellular Bile Acid Dynamics Using a Genetically Encoded FRET-based Bile Acid Sensor

Realtidsövervakning av intracellulär Bile Acid Dynamics hjälp av en genetiskt kodad FRET-baserade Bile Acid Sensor

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. ...

Intra-cardiac Side-Firing Light Catheter for Monitoring Cellular Metabolism using Transmural Absorbance Spectroscopy of Perfused Mammalian Hearts

Intra-kardiell sido bränning ljus kateter för övervakning cellulär metabolism med transmural Absorbansspektroskopi av parfymera däggdjurs hjärtan

Absorbance spectroscopy of cardiac muscle provides non-destructive assessment of cytosolic and mitochondrial oxygenation via myoglobin and cytochrome ...

Preclinical Cardiac Electrophysiology Assessment by Dual Voltage and Calcium Optical Mapping of Human Organotypic Cardiac Slices

Preklinisk hjärtelektrofysiologisk bedömning av dubbel spänning och kalciumoptisk kartläggning av mänskliga organotypiska hjärtskivor

Human cardiac slice preparations have recently been developed as a platform for human physiology studies and therapy testing to bridge the gap between ...

Imaging and Quantification of the Area of Fast-Moving Microbubbles Using a High-Speed Camera and Image Analysis

Avbildning och kvantifiering av området snabbrörliga mikrobubblor Med hjälp av en höghastighetskamera och bildanalys

An experimental and image analysis technique is presented for imaging cavitation bubbles and calculating their area. The high-speed imaging experimental ...