Name: monitoring the reductive and oxidative half-reactions of a flavin-dependent monooxygenase using stopped-flow spectrophotometry
Uploaded: 2012-03-18T14:00:00
Duration: 12 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Monitoring the Reductive and Oxidative Half-Reactions of a Flavin-Dependent Monooxygenase using Stopped-Flow Spectrophotometry at JoVE.com

Araştırma NSF ödül MCB-1021384 tarafından desteklenmektedir.

1. Anaerobik Tampon Hazırlanması <ol><li> 100 mM potasyum fosfat tamponu, pH 7.5 1 L hazırlayın. Bir karıştırıcı çubuğa sahip bir 500 ml&#39;lik şişe içine Büchner tamponun 250 mL dökülür. </li><li> Bir lastik tıpa ile şişesi Seal ve bir karıştırma plaka üzerine yerleştirin. Bir Schlenk hattına balonun kısa tüp bağlayın. </li><li> Ajitasyon ile oda sıcaklığında 5 saat boyunca vakum altında Degas tamponu. Bu süre boyunca, her saat gaz giderme ve argon püskürtülerek vakum 5 eliniz gerçekleştirin. </li><li> 10 saniye için argon ile şişesi yıkayın ve vakum manifoldu ayırın. Torpido gözü içine konur. </li><li> Kuvvetli çalkalama ile gece torpido gözünde şişesi açık bırakın. </li></ol> 2. Durduruldu-akış Sistemi Oksijen Çıkarma <ol><li> 0.1 M sodyum asetat, pH 5.0 1 L hazırlayın. 250 ml Büchner balona bu tamponu 125 ml dökün ve adımları 1,2-1,4 gerçekleştirin. </li><li> 5 tarttınAspergillus Nijer (181.300 U / g) ve 0.9 g glukoz, 1.5 ml Eppendorf tüp ve 50 ml Falcon konik tüp kullanarak, sırasıyla gelen mg glukoz oksidaz. Torpido gözü içine hem kapları yerleştirin. </li><li> Anaerobik 0.1 M sodyum asetat, pH 5.0 (nihai 18,13 U / mL &#39;lik konsantrasyonu ve 100 mM, sırasıyla) 50 mL glukoz oksidaz ve glikoz eritilir. Bu çözelti (Şekil 1) ile rezervuar şırınga doldurun. </li><li> Sürücü vanalar &quot;yük&quot; konumunda olduğundan emin olun ve sürücü şırınga (Şekil 1) doldurun. &quot;Sürücü&quot; konumuna F vana çevirin. Pro-Data kontrolü yazılımı Boş tıklayarak durdurma şırınga boşaltın. Elle ilgili sürücü ram yükselterek akım devresi aracılığıyla sürücü şırınga F tampon itin. Bu adımı toplam on kez tekrarlayın. Diğer üç sürücü şırınga ile aynı işlemi uygulayın. Bir saat bekleyin. </li><li> Aynı tampon contai ile rezervuar şırınga çözeltisi yeriniglukoz oksidaz ve glikoz ning. Adım 2.4 tekrarlayın. </li><li> Tekrar 2.5 adım ve çözüm gecede akış sistemi içinde bekletin. </li><li> Gecelik inkübasyondan sonra, tekrar 2.5 adım. </li></ol> 3. Oksijen Doymuş Tampon Hazırlanması <ol><li> 100 mM potasyum fosfat tamponu (pH 7.5) hazırlanması ve bir karıştırma çubuğuna sahip bir 50-ml şişe içinde 50 mL dökülür. Bir Wheaton stoper ve bir Wheaton alüminyum mühür ile flakon kap. </li><li> Buz üzerinde şişe yerleştirin. Çözeltisine% 100 oksijen içeren bir tanka bağlı uzun bir iğne batırmak. Bir kanat olarak flakonun stoper üzerinden başka bir kısa iğne yerleştirin. </li><li> Ajitasyon ile 1 saat% 100 oksijen ile Kabarcık çözüm. </li><li> İlk tüpten kısa iğne kaldırmak ve uzun bir iğne çıkarmadan önce 10 saniye bekleyin. Torpido kapalı şişe yerleştirin. </li></ol> 4. NADPH Çözüm hazırlanması <ol><li> 1.5 ml Eppendorf tüp NADPH 1 mg tartılarak i yerleştirintorpido gözü içine t. </li><li> Anaerobik 100 mM potasyum fosfat tamponu, pH 7.5, 300 uL NADPH eritilir. Bir spektrofotometre (ε 340 nm = 6,270 M -1 cm -1) ile NADPH konsantrasyonunu belirlemek için torpido gözü bu çözüm 30 uL çıkarın. </li></ol> 5.. Enzim Çözüm gelen oksijen giderimi <ol><li> Torpido gözünde dondurucu ve çözülme enzimini stok solüsyonundan 400 uL atın. Enzim stok solüsyonu (360 uM), daha önce 100 mM NaCl ihtiva eden 100 mM potasyum fosfat tamponu (pH 7.5) hazırlanmış ve sıvı azot içinde donduruldu. </li><li> Bir karıştırma çubuğu ile 25 ml şişeye enzim çözeltisi aktarın, bir Wheaton stoper ve bir Wheaton alüminyum mühür ile flakon kap ve torpido gözü kaldırmak. </li><li> Buz üzerinde şişe yerleştirin ve flakon stoper ile bir iğne sokarak bir Schlenk hattına bağlayın. </li><li> Degas 5 eliniz gerçekleştirerek enzim solüsyonu1 saat boyunca her 20 dakikada bir gaz alma ve argon püskürtülerek temizlenmelidir. </li><li> 10 saniye için argon ile flakon yıkayın ve vakum manifoldu ayırın. Torpido gözü içindeki buz üzerinde şişe yerleştirin. </li></ol> 6. Redüktif Half-tepki: İzleme Flavin Azaltma <ol><li> Durdu akışı enstrüman ve üreticinin protokolü takip tek karıştırma modu için Pro-Data kontrol yazılımı hazırlayın. </li><li> Bir dolaşan su banyosunda (15 ° C) açın. 20 dakika için azot gazı ile yoluyla su oksijen çıkarın. Bu akış devresi yoluyla oksijen kirlenmesini önleyen. </li><li> Dolaşımdaki banyosuna durduruldu-akış su banyosu gövde bağlayarak sürücü şırınga sıcaklıkta ve 15 ° C gözlem hücre korur. </li><li> Pro-Data kontrol yazılımı seçin Photodiode Array, Dış tetik (durdu akışı işlemini aktif) ve Logarit ve Denetim Masası penceresindehmic ölçek. </li><li> Pro-Data görüntüleyici yazılımı başlatın ve veri dosyalarını saklanacağı dizini tanımlar. </li><li> Rezervuar şırınga C ve oksijensiz 100 mM potasyum fosfat tamponu (pH 7.5) ile F çözeltisi yerine geçer. &quot;Sürücü&quot; konumuna C ve F vanaları kapatın. Pro-Data kontrolü yazılımı Boş tıklayarak durdurma şırınga boşaltın. Manuel (ram her hareketinden önce Boş tıklayın) toplam ram beş kez ilgili sürücü yükselterek akım devresi boyunca her iki sürücü şırınga olan tampon itin. </li><li> Bu glukoz oksidaz akım devresi tamamen kaldırılmıştır sağlamak amacıyla, toplam 6.6 dört kez adım gerçekleştirin. </li><li> Pro-Data kontrol yazılımı bazal tıklayın. </li><li> Anaerobik 100 mM potasyum fosfat tamponunda (15 uM durduruldu akışta karıştırıldıktan sonra nihai konsantrasyon) ile 1100 uL enzim stok solüsyonundan 100 ul karıştırılır. </li><li> Rezervuar syr çözümü değiştirinenzim solüsyonu ile birlikte inge F. &quot;Sürücü&quot; konumuna F vana çevirin. Pro-Data kontrolü yazılımı Boş tıklayarak durdurma şırınga boşaltın. Elle ilgili sürücü ram yükselterek akım devresi aracılığıyla sürücü şırınga F enzim çözeltisi itin. Toplam üç kere uygulayın. Pro-Data kontrol yazılımı, 60 s edinimi süresi ayarlayın. </li><li> Her iki sürücü şırıngalar sürücü şırınga pistonları ile temasta bulunan bunlara karşılık gelen çözümleri ve sürücü koç ile dolu olduğundan emin olun. &quot;Sürücü&quot; konumuna hem vanaları açın ve sürücü gerçekleştirmek için Pro-Data kontrolü yazılımı Acquire tıklatın. Üç kopya olarak verileri elde etmek için iki kat daha fazla bu adımı yineleyin. Enzim okside formunda bu verimler spektrumları. </li><li> Sürücüleri elde A 452 nm değeri kullanılarak, (ε 452 nm = 13.700 M -1 cm -1) karıştırmadan önce enzim konsantrasyonunun belirlenmesi ve NADPH eriyik 4 mL hazırlanmasın 1,5 kat daha konsantre. </li><li> NADPH çözüm ve 6.10 açıklandığı gibi boş ve dolum durdurma şırınga üç kez rezervuar şırınga C çözümü değiştirin. </li><li> Adım 6.11 tekrarlayın. Enzim indirgeme sırasında bu verimler spektrumları. </li></ol> 7. Oksidatif Half-tepki: İzleme Flavin Oksidasyon <ol><li> Durdu akışı enstrüman ve üreticinin protokolü takip çift karıştırma modu için Pro-Data kontrol yazılımı hazırlayın. </li><li> 6,2-6,5 adımları tekrarlayın. </li><li> Anaerobik 100 mM potasyum fosfat tamponu (pH 7.5) ile birlikte dört rezervuar şırınga içinde çözelti yerine geçer. &quot;Sürücü&quot; konumuna F vana çevirin. Pro-Data kontrolü yazılımı Boş tıklayarak durdurma şırınga boşaltın. Elle ilgili sürücü ram yükselterek akım devresi aracılığıyla sürücü şırınga F tampon itin. Her sürücü şırınga ile toplam beş kez bu adımı gerçekleştirin. </li><li> Tot 7.3 dört kez adım gerçekleştirinarkadaşları, tamamen akış devresinden içeriğini çıkarmak için kullanılır. </li><li> Pro-Data kontrol yazılımı bazal tıklayın. </li><li> Anaerobik 100 mM potasyum fosfat tamponunda (15 uM durduruldu akışta karıştırıldıktan sonra nihai konsantrasyon) ile 1000 uL enzim stok solüsyonundan 200 ul karıştırılır. </li><li> Bir enzim solüsyonu ile birlikte rezervuar şırınganın çözeltisi yerine geçer. &quot;Sürücü&quot; konumuna bir kapak kapatın. Pro-Data kontrolü yazılımı Boş tıklayarak durdurma şırınga boşaltın. Elle ilgili sürücü ram yükselterek sürücü şırıngadan bir akım devresi aracılığıyla enzim çözeltisi itin. Bu adımı toplam üç kez uygulayın. Pro-Data kontrol yazılımı olarak, 0,5 s gecikme süresi ve 60 s edinimi süresi ayarlayın. </li><li> Tüm sürücü şırıngalar sürücü şırınga pistonları ile temasta bulunan bunlara karşılık gelen çözümleri ve sürücü koç ile dolu olduğundan emin olun. &quot;Sürücü&quot; konumuna tüm vanaları açın ve Pro-Dat in Acquire tıklayınsürücü gerçekleştirmek için bir kontrol yazılımı. Üç kopya olarak verileri elde etmek için bu adımı iki kez daha tekrarlayın. Enzim okside formunda bu verimler spektrumları. </li><li> Şırınga A&#39;da enzim solüsyonu &quot;sürücü&quot; pozisyonu ve boş ve dolum durdurma şırınga 7,7 açıklanan üç kez B vana açma &#39;den 1.5 kat daha konsantre bir NADPH çözümü ile rezervuar şırınga B çözümü değiştirin. </li><li> Oksijenli tamponu ile rezervuar şırınga C çözümü değiştirin. &quot;Sürücü&quot; pozisyonu ve boş ve dolum durdurma şırınga 7.7 açıklandığı gibi üç defa C vana çevirin. Pro-Data kontrol yazılımı olarak, sırasıyla 15 ve 900 s gecikme ve satın alma zamanını ayarlayın. </li><li> Adım 7.8 tekrarlayın. Tamamen indirgenmiş enzim reoxidation sırasında bu verimler spektrumları. </li></ol> 8. Veri Analizi <ol><li> Pro-Data Converter yazılımı başlatın. Seçenekler simgesini tıklayın ve ProDataCSV Kaydet seçeneğini seçin. </li><li> Açıkveri dosyalarını dizinini muhafaza edildi. APL Pro-Data dönüştürücü penceresine dosyaları sürükleyin. Veriler aynı dizinde CSV formatında dosyalar otomatik olarak kaydedilecektir. </li><li> Microsoft Excel (Microsoft, Redmond, WA, ABD) ile CSV formatında dosyaları açın. 700 nm&#39;de absorpsiyon karşılık gelen çıkarılarak durduruldu-akış izlerinin taban normalize. </li><li> Uygun üstel fonksiyonu için zamana karşı gelen maksimum absorbans arsa takarak KaleidaGraph (Sinerji Yazılım, Reading, PA) kullanılarak düzeltilebilir izlerini analiz edin. Şekil 2B, durdurulmuş-akış cihazı içinde enzim ve NADPH karıştırıldıktan sonra flavin redüksiyon oranını belirlemek üzere, zamanın bir fonksiyonu olarak çizilmiştir 452 nm&#39;de absorbans gösterilmiştir. Bu durumda, veri en uygun redüksiyon, res birinci ve ikinci faz için hesaplanmış bir çift üstel denklemi ve 0.65 ve 0.23 s -1 oranları kullanılarak elde edilmiştirolarak bulundu. C4a-hydroperoxyflavin ara ve oksijen ile indirgenmiş enzim reaksiyonu sonrasında reoxidation oluşum oranını belirlemek için, sırasıyla, 380 ve 452 nm, (Şekil 3B) olarak durdurulur-akış izleri analiz edilmiştir. Tek bir üstel denklemi kullanılarak, sırasıyla, yarı-reaksiyonu oksidatif birinci ve ikinci adımı için 1.4 ve 0,006 s -1 oranları hesaplandı. </li></ol> 9. Temsilcisi Sonuçlar Önceki bölümlerde açıklandığı deneyler sonucu bir f Sida indirgeyici yarı-tepkimesi flavin indirgenmiş durumunu değişikliklere karşılık 452 nm de absorbans değişiklikler ölçülerek kontrol edilebilir göstermek. Bu adımın oranı uygun denklemi (; Adım 8,4 Şekil 2) &#39;ye uyan verileri tarafından tespit edilebilir. Elde edilen giderme oranı (0.65 s-1) ile hesaplanan k kedi değeri benzerindirgeme reaksiyonu hızını-belirleyici adım olduğunu düşündürmektedir kararlı durum deneyler 2,. Durduruldu-akış çift karıştırma modu yararlanarak, oksidasyon ve bu yarı-reaksiyonda aramaddelerinin oranı (; Adım 8,4 Şekil 3) tespit edilebilir. A f Sida tarafından katalizlenen reaksiyon olarak, C4a-hydroperoxyflavin açıkça (380 nm λ max) algılanır ve oluşumu ve çürüme oranı hesaplanabilir. Elde edilen reoxidation (0,006 s -1) ile yavaş oranı C4a-hydroperoxyflavin yokluğunda ornitin çok kararlı olduğunu göstermektedir. <img alt="Şema 1" src="/files/ftp_upload/3803/3803scheme1.jpg" /> A f Sida şeması 1. Mekanizması. FAD kofaktör arasında isoallozaxine halkası gösterilmiştir. Okside flavin (A), NADPH (B) bağlanır ve azaltılmış flavin ve NADP + (C) oluşturmak üzere reaksiyona girer. Moleküler oksijen ve bağlayıcı ile reaksiyondan sonraornitin, C4a-hydroperoxyflavin (D) oluşur. Bu hydroxylating türdür. Ornitin hidroksillenmesi sonra, hydroxyflavin (E) okside enzim oluşturmak üzere susuz olmalıdır. NADP + katalitik döngüsü boyunca bağlı kalır ve (F) çıkacak son üründür. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3803/3803fig1.jpg" /> Şekil 1. Durdu akış alet. A) Applied Photophysics SX20 bileşenlerinin Resim durduruldu-akış spektrofotometre. B numune işleme birimi) Resim. Çift karıştırma modunda akım devresi C) Programı. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3803/3803fig2.jpg" /> Şekil 2. Durdu akış enstrüman NADPH ile Sida anaerobik azaltılması. 30 uM Sida ve 45 mM NADPH eşit hacimlerde karıştırıldıktan sonra kaydedilen A) Spektral değişir. İlk tayfı (SIDA okside) ve son tayfı (tam Sid azaltılmışA) mavi ve kırmızı sırasıyla vurgulanır. Zamanın bir fonksiyonu olarak kaydedildi 452 nm&#39;de B) absorbans iz. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3803/3803fig3.jpg" /> Durdu akış enstrüman Sida Şekil 3. Oksidasyonu. A) tamamen indirgenmiş Sida ve oksijenli tampon karıştırma eşit hacimlerde sonra Spectral değişiklikleri kaydedildi. Nihai konsantrasyon 15 uM Sida, 22.5 mM NADPH, ve 0.95 mM oksijen edildi. Tayfı 0,034, 4,268 kaydedildi ve 727,494 s, sırasıyla, tamamen indirgenmiş enzim, C4a-hydroperoxyflavin ara madde (380 nm λ max), ve oksitlenmiş enzim (450 nm λ max) karşılık gelir. B) 382 ve 452 nm&#39;de absorbans iz zamanın bir fonksiyonu olarak kaydedildi.

<ol>
	<li>Hissen, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Aspergillus+fumigatus+siderophore+biosynthetic+gene+sidA,+encoding+L&#45;ornithine+N5&#45;oxygenase,+is+required+for+virulence.">The Aspergillus fumigatus siderophore biosynthetic gene sidA, encoding L&#45;ornithine N5&#45;oxygenase, is required for virulence.</a> Infect. Immun. 73 (9), 5493-5503 (2005).</li><li>Chocklett, S. W., Sobrado, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspergillus+fumigatus+SidA+is+a+highly+specific+ornithine+hydroxylase+with+bound+flavin+cofactor.">Aspergillus fumigatus SidA is a highly specific ornithine hydroxylase with bound flavin cofactor.</a> Biochemistry. 49 (31), 6777-6783 (2010).</li><li>Mayfield, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+spectroscopic,+steady+state,+and+transient+kinetic+studies+of+a+representative+siderophore&#45;associated+flavin+monooxygenase.">Comprehensive spectroscopic, steady state, and transient kinetic studies of a representative siderophore&#45;associated flavin monooxygenase.</a> J. Biol. Chem. 285 (40), 30375-30388 (2010).</li><li>Fierke, C. A., Hammes, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+kinetic+approaches+to+enzyme+mechanisms.">Transient kinetic approaches to enzyme mechanisms.</a> Contemporary enzyme kinetics and mechanism. , (2009).</li><li>Palfey, B. A., McDonald, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+catalysis+in+flavin-dependent+monooxygenases.">Control of catalysis in flavin-dependent monooxygenases.</a> Arch. Biochem. Biophys. 493 (1), 26-26 (2010).</li><li>van Berkel, W. J. H., Kamerbeek, N. M., Fraaije, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flavoprotein+monooxygenases,+a+diverse+class+of+oxidative+biocatalysts.">Flavoprotein monooxygenases, a diverse class of oxidative biocatalysts.</a> J. Biotechnol. 124 (4), 670-689 (2006).</li><li>Chapman, S. K., Reid, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Flavoprotein Protocols. , (1999).</li><li>Sobrado, P., Fitzpatrick, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solvent+and+primary+deuterium+isotope+effects+show+that+lactate+CH+and+OH+bond+cleavage+are+concerted+in+Y254F+flavocytochrome+b2,+consistent+with+a+hydride+transfer+mechanism.">Solvent and primary deuterium isotope effects show that lactate CH and OH bond cleavage are concerted in Y254F flavocytochrome b2, consistent with a hydride transfer mechanism.</a> Biochemistry. 42, 15208-15214 (2003).</li><li>Kumar, S., Gawandi, V. B., Capito, N., Phillips, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substituent+effects+on+the+reaction+of+Î²-benzoylalanines+with+Pseudomonas+fluorescens+kynureninase.">Substituent effects on the reaction of Î²-benzoylalanines with Pseudomonas fluorescens kynureninase.</a> Biochemistry. 49 (36), 7909-7913 (2010).</li><li>Yun, D., Garc&#237;a-Serres, R., Chicalese, B. M., An, Y. H., Huynh, B. H., Bollinger, J. M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=(&#956;-1,2-Peroxo)diiron(III/III)+complex+as+a+precursor+to+the+diiron(III/IV)+intermediate+X+in+the+assembly+of+the+iron&#45;radical+cofactor+of+ribonucleotide+reductase+from+mouse.">(&#956;-1,2-Peroxo)diiron(III/III) complex as a precursor to the diiron(III/IV) intermediate X in the assembly of the iron&#45;radical cofactor of ribonucleotide reductase from mouse.</a> Biochemistry. 46 (7), 1925-1932 (2007).</li><li>Pennati, A., Zanetti, G., Aliverti, A., Gadda, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+salt+and+pH+on+the+reductive+half-reaction+of+Mycobacterium+tuberculosis+FprA+with+NADPH+Biochemistry.">Effect of salt and pH on the reductive half-reaction of Mycobacterium tuberculosis FprA with NADPH Biochemistry.</a> Biochemistry. 47 (11), 3418-3425 (2008).</li><li>Patil, P. V., Allou, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+protocatechuate+dioxygenase+for+maintaining+anaerobic+conditions+in+biochemical+experiments.">The use of protocatechuate dioxygenase for maintaining anaerobic conditions in biochemical experiments.</a> Analytical Biochemistry. 286 (2), 187-192 (2000).</li></ol>

Biz ifşa hiçbir şey yok.

Redoks tepkimeleri katalizleyen enzimlere genellikle katalitik döngüsü sırasında önemli absorbans değişikliklere hem, normal şartlarda ve flavinler gibi kofaktörler içerir. Flavin ve okside formu ~ 360 ve 450 nm &#39;maxima sunar, ve onun azaltma genellikle 450 nm 7 absorbans azalması sonucu izlenir. Genel olarak, bazı geçici ara mevcut fakat düzenli spektrofotometrelerde ölçülecek formu ve çürüme çok hızlıdır. Applied Photophysics SX20 durduruldu-akış spektrofotometre (ya da benzer araç) kullanılarak, bu milisaniyelik zaman ölçeği içinde absorbans (ölü zaman, 2 ms) ölçmek için mümkündür. Burada bir model olarak hizmet veren, flavin bağımlı monooksijenaz A f Sida indirgeyici ve oksidatif yarı-tepkimeleri okudu. Hidrit transfer hızı anaerobik koşullar altında NADPH ile enzim karıştırıldıktan sonra 452 nm&#39;de absorbans ile değişikliğinin ölçülmesi ile tespit edildi. Daha sonra, advantag alarakTam azalmanın elde edilene kadar durduruldu-akış aletinin çift karıştırma modunun e, enzim ilk ve sonra indirgenmiş enzim NADP + kompleksinin oksijen ile karıştırıldı, NADPH ile tepkimeye sokulmuştur. Bu prosedürü takiben, geçici oksijenli flavin ara algılamak ve oluşumu ve çürüme oranları ölçmek mümkündür. Bu ara maddelerin tanımlanması kataliz reaksiyona türlerinin doğası hakkında deneysel verileri sağlamaktadır. A f Sida, hydroxylating türdür C4a-hydroperoxyflavin (tipik olarak 370-380 nm&#39;de izlenir), oluşumu durumunda. Buna ek olarak, her bir adımı sürekli oranında ölçen bir reaksiyon oranı-belirleyici adım hakkında bilgi elde etmek ve enzim kinetik ve kimyasal mekanizmaları aydınlatmak için yardımcı sağlar. Genel olarak, benzer yöntemler proteinler gibi, diğer flavoenzymes veya meydana değiştirdiği absorbans için proteinleri için kullanılabileceğini devamain heme, piridoksal fosfat, veya non-heme demir 8-10. Bu yöntemin bir sınırlandırma enzimi saflaştırılmış büyük miktarlarda gerekli olduğunu, ancak bu yüksek verimle bir ifade sistemi kullanılarak aşılabilir. Bir yeterince güçlü bir sinyal tespit edilebilmesi için yeterli protein kullanılarak kayıt spektrası için uygun protein konsantrasyonu tespit, ancak çok böylece enzim boşa değildir. Tipik olarak, durduruldu-akış Deneylerde kullanılan flavin içeren enzimleri için en düşük Enzim konsantrasyonu 6-10 uM (karıştırma sonrası) ve enzimin karşılık gelen molar sönüm katsayısı kullanarak saptanır. A f Sida söz konusu olduğunda, enzim bağlı FAD yüzdesi% 50-65 2&#39;dir. Ciltli bir FAD kofaktör kataliz için gerekli olduğundan Apo-protein Bu deneylerde inaktif olarak kabul edilir. Bu yöntemin bir başka olası sınırlama bir enzim süreçlerini ortaya çıkarsa 2 daha hızlı ms (durdu-akış ölü zaman) bunlar görülemez, ancak there oranları bu sorunu aşmak için azaltılabilir stratejiler bildirilmiştir. Bunun bir örneği, bir ferrodoksin-NADP + redüktaz 11 reaksiyon yüksek bir NaCl konsantrasyonu kullanılarak içerir. Durduruldu-akış akış devresinden oksijen ovma genellikle bu deneyde zor bir adım ve özel bir dikkat gereklidir. Etkin ve ucuz bir yöntemdir burada açıklandığı gibi glukoz oksidaz-glikoz sistemi en laboratuvarlarda başarıyla kullanılmaktadır. Bununla birlikte, H2O 2 üretimini içeren ve bazı uygulamalar için protocatechuate dioksigenaz-protocatechuate sistemi gibi diğer alternatifi 12 göz önüne alınmalıdır bazı sakıncaları vardır. Oksijensiz bir torpido gözü, kullanımı daha kolay anaerobik koşulları sağlamak için yapar, ancak şart değildir. Bu enzim oksijen yokluğunda azaltılabilir isteyen veya konsantrasyonda oksijen ile reaksiyona olarak oksijen durduruldu-akış akım devresi uzaklaştırılmalıdırbiz belirttiğiniz s. Durdu-akış torpido gözünde olmasına rağmen biz önceki deneylerde aerobik tamponlar kullanıldığı takdirde, oksijen akışı devrede var. Absorbans ölçümleri ek olarak, floresans ve sirküler dikroizm deneyleri karşılık gelen aksesuarlarla Applied Photophysics SX20 durduruldu-akış spektrofotometre içinde gerçekleştirilebilir.

<table border="1"><tbody><tr><td> Genel Laboratuvar Cihazları </td><td> Şirket </td><td> Katalog Numarası </td></tr><tr><td> Vakum pompası </td><td> Şartları yerine getirmemek </td><td> - </td></tr><tr><td> Büchner şişeler </td><td> Balıkçı </td><td> 70340-500 </td></tr><tr><td> Barlar Stir </td><td> Balıkçı </td><td> 14-512-129 </td></tr><tr><td> Plakalar Stir </td><td> Balıkçı </td><td> 11-100-49S </td></tr><tr><td> Schlenk hatları </td><td> Kontes Cam </td><td> - </td></tr><tr><td> Argon tankı </td><td> Airgas </td><td> AR UPC300 </td></tr><tr><td> Azot tankı </td><td> Airgas </td><td> NI200 </td></tr><tr><td> Nitrojen tankı, ultra yüksek saflıkta notu </td><td> Airgas </td><td> NI UHP200 </td></tr><tr><td> Oksijen deposu </td><td> Airgas </td><td> OX 40 </td></tr><tr><td> 5% Hidrojen dengesini azot tankı </td><td> Airgas </td><td> X02NI95B200H998 </td></tr><tr><td> SX20 Stop-akış spektrofotometre </td><td> AppliedPhotophysics </td><td> - </td></tr><tr><td> Torpido gözü </td><td> Nazlı </td><td> - </td></tr><tr><td> Su banyosu </td><td> Brinkmann Lauda </td><td> - </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Malzemeleri </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 50 mL BD Falcon tüpler </td><td> Balıkçı </td><td> 14-432-23 </td></tr><tr><td> 15 mL BD Falcon konik tüpler </td><td> Balıkçı </td><td> 05-527-90 </td></tr><tr><td> 1.5 mL Eppendorf mikrosantrifüj tüpler </td><td> Balıkçı </td><td> 05-402-18 </td></tr><tr><td> 50 ve 25 mL cam şişe </td><td> Balıkçı </td><td> 06-402 </td></tr><tr><td> Kauçuk tıpalar </td><td> Balıkçı </td><td> 06-447H </td></tr><tr><td> Alüminyum mühürler </td><td> Balıkçı </td><td> 06-406-15 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Reagents </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Potasyum fosfat, monobazik </td><td> Balıkçı </td><td> AC2714080025 </td></tr><tr><td> Potasyum fosfat, çift bazlı </td><td> Balıkçı </td><td> P288-500 </td></tr><tr><td> Sodyum asetat </td><td> Sigma </td><td> S-2889 </td></tr><tr><td> A. glukoz oksidaz Nijer </td><td> Sigma </td><td> G7141-250KU </td></tr><tr><td> D-Glikoz </td><td> Balıkçı </td><td> D16-500 </td></tr><tr><td> β-NADPH </td><td> Balıkçı </td><td> ICN10116783 </td></tr><tr><td> L (+)-Ornithine hidroklorür </td><td> Balıkçı </td><td> ICN10116783 </td></tr></tbody></table>

monitoring the reductive and oxidative half-reactions of a flavin-dependent monooxygenase using stopped-flow spectrophotometry

Aspergillus fumigatus siderofor A (SIDA) (örn. ferricrocin veya N &#39;, N &quot;, N&#39;&#39;&#39;-triacetylfusarinine C) 1 ölümcüllük için gerekli olan hydroxamate siderofor biyosentezini in ornithine hidroksillenmesi katalize bir FAD içeren monooksijenaz olup. Sida tarafından katalizlenen reaksiyon indirgeyici ve oksidatif yarı-reaksiyonlar (Şema 1) ayrılabilir. yarı-tepkimesi indirgeyici, A f Sida bağlı okside ADÖ, NADPH 2,3 oranında azaltılır. yarı-reaksiyonu oksidatif olarak , azaltılmış kofaktör ornitine bir oksijen atomu aktaran C4a-hydroperoxyflavin orta oluşturmak için moleküler oksijen ile reaksiyona girer. Burada oranları ölçmek ve yüklü bir durdu akış aracı kullanarak Sida farklı spektral formları algılamak için bir prosedür tarif anaerobik torpido. durdu akış aracı olarak, reaktanlarının küçük hacimleri hızla karışık, ve sonrası akım th tarafından durduruldue durdur şırınganın (Şekil 1), gözlem hücre yerleştirilen çözelti spektral değişiklikler zamanla kaydedilmektedir. Deneyin ilk bölümünde, biz NADPH tarafından bir f Sida içinde flavin anaerobik azalma doğrudan ölçülür tek modunda durdu akış aleti nasıl kullanabileceğinizi göstermek. Daha sonra bir f Sida ilk anaerobik yaşlanan bir döngü içinde zaman belirli bir süre için NADPH azalır çift karıştırma ayarları kullanın ve sonra gözlem hücresi (Şekil 1) moleküler oksijen ile reaksiyona. Sadece indirgeyici yarı reaksiyon takip olduğunda, çözümlerin herhangi bir oksijen indirgenmiş flavin kofaktör ile reaksiyona ve sonuçta okside flavin geri azalacağı a-C4a hydroperoxyflavin ara oluşturacak, çünkü bu deney gerçekleştirmek amacıyla, anaerobik tamponlar gereklidir . Enz tam cirosu olacağını çünkü bu kullanıcının doğru azalma oranları ölçmek için izin vermediYme. Yarı-reaksiyonu oksidatif çalışılan edildiğinde enzim azaltılması ve oksidasyon arasında, sadece adımları gözlenir böylece oksijen yokluğunda azaltılması gerekir. Bu deneyde kullanılan tampon, bir oksijen, oksijen ve daha yüksek konsantrasyonlarda yarı-reaksiyonu oksidatif çalışma böylece doymuş olduğunu. Bunlar genellikle flavin içeren monooksijenazları ile indirgeyici veya oksidatif yarı-reaksiyonlar ya çalışılırken yapılan işlemlerdir. Durdu akışı ile yapılan ön kararlı durum deneylerin zaman ölçeği intrinsik hız sabitlerinin belirlenmesi ve reaksiyon 4 ara algılama ve tanımlama izin saniye milisaniye vardır. Burada açıklanan prosedürler diğer flavin-bağımlı monooksijenazları uygulanabilir. 5,6

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring the Reductive and Oxidative Half-Reactions of a Flavin-Dependent Monooxygenase using Stopped-Flow Spectrophotometry at JoVE.com

Monitoring the Reductive and Oxidative Half-Reactions of a Flavin-Dependent Monooxygenase using Stopped-Flow Spectrophotometry

Bu indirgeyici ve oksidatif yarı-reaksiyonların her ikisi de araştırmak için bir durduruldu akış aletinin kullanımı açıklanmaktadır<em&gt; Aspergillus</em&gt; Siderofor A (SIDA), bir flavin bağımlı monooksijenaz. Daha sonra Sida ile reaksiyona türler tekabül spektrumları gösterir ve bunların kurulması için oran sabitleri hesaplamak.

Durduruldu-Akış Spektrofotometri kullanarak Flavin-Bağımlı monooksijenaz ve indirgeyici ve Oksidatif Yarı-Tepkime İzlenmesi

Aspergillus fumigatus siderophore A (SidA) is an FAD-containing monooxygenase that catalyzes the hydroxylation of ornithine in the biosynthesis of ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

Bir mikroakışkan Platform kullanarak Yüksek throughput Protein Ekspresyonu Jeneratör

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Monitoring the Wall Mechanics During Stent Deployment in a Vessel

Bir Gemi Stent Dağıtım sırasında Duvar Mekaniği izlenmesi

Clinical trials have reported different restenosis rates for various stent designs1. It is speculated that stent-induced strain concentrations on the ...

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

Raman Spektroskopisi kullanarak Hücreler ve Ekstrasellüler Matriks Temassız, Etiket ücretsiz izleme

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

Mass Cytometry: Protocol for Daily Tuning and Running Cell Samples on a CyTOF Mass Cytometer

Kütle Sitometri: Bir CyTOF Kütle Sitometre Daily Tuning ve Koşu Hücre Örnekleri için protokol

In recent years, the rapid analysis of single cells has commonly been performed using flow cytometry and fluorescently-labeled antibodies. However, the ...

Surgical Technique for the Implantation of Tissue Engineered Vascular Grafts and Subsequent In Vivo Monitoring

Surgical Technique for the Implantation of Tissue Engineered Vascular Grafts and Subsequent In Vivo Monitoring

Doku Engineered Vasküler Greftlerinin ve sonraki İmplantasyonunda Cerrahi Tekniği<em&gt; İn Vivo</em&gt; İzleme

The development of Tissue Engineered Vessels (TEVs) is advanced by the ability to routinely and effectively implant TEVs (4-5 mm in diameter) into a large ...

Real Time Monitoring of Intracellular Bile Acid Dynamics Using a Genetically Encoded FRET-based Bile Acid Sensor

Genetik olarak kodlanmış FRET tabanlı Safra Asit Sensor Kullanımı Hücre içi Safra Asit Dynamics Gerçek Zamanlı İzleme

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. ...

Intra-cardiac Side-Firing Light Catheter for Monitoring Cellular Metabolism using Transmural Absorbance Spectroscopy of Perfused Mammalian Hearts

Perfkullanılmış Mammalin kalpleri transmural absorbance spektroskopisi kullanarak hücresel metabolizmayı Izleme için kalp içi yan ateş ışık kateter

Absorbance spectroscopy of cardiac muscle provides non-destructive assessment of cytosolic and mitochondrial oxygenation via myoglobin and cytochrome ...

Preclinical Cardiac Electrophysiology Assessment by Dual Voltage and Calcium Optical Mapping of Human Organotypic Cardiac Slices

İnsan Organotipik Kardiyak Dilimlerinin Çift Voltaj ve Kalsiyum Optik Haritalaması ile Preklinik Kardiyak Elektrofizyoloji Değerlendirmesi

Human cardiac slice preparations have recently been developed as a platform for human physiology studies and therapy testing to bridge the gap between ...

Imaging and Quantification of the Area of Fast-Moving Microbubbles Using a High-Speed Camera and Image Analysis

Yüksek Hızlı Kamera ve Görüntü Analizi Kullanarak Hızlı Hareket Eden Mikrokabarcıkların Görüntülenmesi ve Ölçülmesi

An experimental and image analysis technique is presented for imaging cavitation bubbles and calculating their area. The high-speed imaging experimental ...