Name: wholemount immunohistochemistry for revealing complex brain topography
Uploaded: 2012-04-05T13:00:00
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RVS wird durch neue Ermittler Anschubfinanzierung von Albert Einstein College of Medicine der Yeshiva University unterstützt.

1. Tierische Perfusion und Kleinhirn Dissection <ol><li> Je nach Protein kann Perfusion für erfolgreiches Färbung 1,2. Transcardiac Perfusion ist eine invasive, nicht-Überleben Prozedur, die die ordnungsgemäße Verwendung der Anästhesie erfordert. Korrekte Ausbildung, institutionelle Zulassung und Genehmigung IACUC sind alle notwendig, bevor Sie den Vorgang. Es ist immer eine gute Idee, um der Institution Tierärzte wenden, um Hilfe bei der Identifizierung und den Erwerb von experimentellen Anforderung...

<ol>
	<li>Sillitoe, R. V., Hawkes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-mount+Immunohistochemistry:+A+high-throughput+screen+for+patterning+defects+in+the+mouse+cerebellum.">Whole-mount Immunohistochemistry: A high-throughput screen for patterning defects in the mouse cerebellum.</a> J. Histochem. Cytochem. 50, 235-244 (2002).</li><li>Kim, S. -. H., Che, P., Chung, S. -. H., Doorn, D., Hoy, M., Larouche, M., Marzban, H., Sarna, J., Zahedi, S., Hawkes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-Mount+Immunohistochemistry+of+the+Brain.">Whole-Mount Immunohistochemistry of the Brain.</a> Current Protocols in Neuroscience. , (2006).</li><li>Dent, J. A., Polson, A. G., Klymkowsky, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+whole-mount+immunocytochemical+analysis+of+the+expression+of+the+intermediate+filament+protein+vimentin+in+Xenopus.">A whole-mount immunocytochemical analysis of the expression of the intermediate filament protein vimentin in Xenopus.</a> Development. 105, 61-74 (1989).</li><li>Sillitoe, R. V., Malz, C. R., Rockland, K., Hawkes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigenic+compartmentation+of+the+primate+and+tree+shrew+cerebellum:+a+common+topography+of+zebrin+II+in+Macaca+mulatta+and+Tupaia+belangeri.">Antigenic compartmentation of the primate and tree shrew cerebellum: a common topography of zebrin II in Macaca mulatta and Tupaia belangeri.</a> J. Anat. 204, 257-269 (2004).</li><li>Ozol, K., Hayden, J. M., Oberdick, J., Hawkes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transverse+zones+in+the+vermis+of+the+mouse+cerebellum.">Transverse zones in the vermis of the mouse cerebellum.</a> J. Comp. Neurol. 412, 95-111 (1999).</li><li>Apps, R., Hawkes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellar+cortical+organization:+a+one-map+hypothesis.">Cerebellar cortical organization: a one-map hypothesis.</a> Nat. Rev. Neurosci. 10, 670-681 (2009).</li><li>Reeber, S. L., Sillitoe, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterned+expression+of+a+cocaine-+and+amphetamine-regulated+transcript+peptide+reveals+complex+circuit+topography+in+the+rodent+cerebellar+cortex.">Patterned expression of a cocaine- and amphetamine-regulated transcript peptide reveals complex circuit topography in the rodent cerebellar cortex.</a> J. Comp. Neurol. 519, 1781-1796 (2011).</li><li>Sarna, J. R., Marzban, H., Watanabe, M., Hawkes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementary+stripes+of+phospholipase+Cbeta3+and+Cbeta4+expression+by+Purkinje+cell+subsets+in+the+mouse+cerebellum.">Complementary stripes of phospholipase Cbeta3 and Cbeta4 expression by Purkinje cell subsets in the mouse cerebellum.</a> J. Comp. Neurol. 496, 303-313 (2006).</li><li>Demilly, A., Reeber, S. L., Gebre, S. A., Sillitoe, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurofilament+heavy+chain+expression+reveals+a+unique+parasagittal+stripe+topography+in+the+mouse+cerebellum.">Neurofilament heavy chain expression reveals a unique parasagittal stripe topography in the mouse cerebellum.</a> Cerebellum. 10, 409-421 (2011).</li><li>Larouche, M., Hawkes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+clusters+to+stripes:+the+developmental+origins+of+adult+cerebellar+compartmentation.">From clusters to stripes: the developmental origins of adult cerebellar compartmentation.</a> Cerebellum. 5, 77-88 (2006).</li><li>Marzban, H., Chung, S., Watanabe, M., Hawkes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipase+Cbeta4+expression+reveals+the+continuity+of+cerebellar+topography+through+development.">Phospholipase Cbeta4 expression reveals the continuity of cerebellar topography through development.</a> J. Comp. Neurol. 502, 857-871 (2007).</li><li>Blank, M. C., Grinberg, I., Aryee, E., Laliberte, C., Chizhikov, V. V., Henkelman, R. M., Millen, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+developmental+programs+are+altered+by+loss+of+Zic1+and+Zic4+to+cause+Dandy-Walker+malformation+cerebellar+pathogenesis.">Multiple developmental programs are altered by loss of Zic1 and Zic4 to cause Dandy-Walker malformation cerebellar pathogenesis.</a> Development. 138, 1207-1216 (2011).</li><li>Sawada, K., Sakata-Haga, H., Fukui, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternating+array+of+tyrosine+hydroxylase+and+heat+shock+protein+25+immunopositive+Purkinje+cell+stripes+in+zebrin+II-defined+transverse+zone+of+the+cerebellum+of+rolling+mouse.">Alternating array of tyrosine hydroxylase and heat shock protein 25 immunopositive Purkinje cell stripes in zebrin II-defined transverse zone of the cerebellum of rolling mouse.</a> Nagoya. Brain Res. 1343, 46-53 (2010).</li><li>Sawada, K., Fukui, Y., Hawkes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+distribution+of+corticotropin-releasing+factor+immunopositive+climbing+fibers+in+the+mouse+cerebellum:+Analysis+by+whole+mount+immunohistochemistry.">Spatial distribution of corticotropin-releasing factor immunopositive climbing fibers in the mouse cerebellum: Analysis by whole mount immunohistochemistry.</a> Brain Res. 1222, 106-117 (2008).</li><li>Marzban, H., Hawkes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+architecture+of+the+posterior+zone+of+the+cerebellum.">On the architecture of the posterior zone of the cerebellum.</a> Cerebellum. 10, 422-434 (2011).</li><li>Pakan, J. M., Graham, D. J., Wylie, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+visual+mossy+fiber+projections+and+zebrin+expression+in+the+pigeon+vestibulocerebellum.">Organization of visual mossy fiber projections and zebrin expression in the pigeon vestibulocerebellum.</a> J. Comp. Neurol. 518, 175-198 (2010).</li><li>Iwaniuk, A. N., Marzban, H., Pakan, J. M., Watanabe, M., Hawkes, R., Wylie, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentation+of+the+cerebellar+cortex+of+hummingbirds+(Aves:+Trochilidae)+revealed+by+the+expression+of+zebrin+II+and+phospholipase+C+beta+4.">Compartmentation of the cerebellar cortex of hummingbirds (Aves: Trochilidae) revealed by the expression of zebrin II and phospholipase C beta 4.</a> J. Chem. Neuroanat. 37, 55-63 (2009).</li><li>Sarna, J. R., Larouche, M., Marzban, H., Sillitoe, R. V., Rancourt, D. E., Hawkes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterned+Purkinje+cell+degeneration+in+mouse+models+of+Niemann-Pick+type+C+disease.">Patterned Purkinje cell degeneration in mouse models of Niemann-Pick type C disease.</a> J. Comp. Neurol. 456, 279-291 (2003).</li><li>Sarna, J. R., Hawkes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterned+Purkinje+cell+loss+in+the+ataxic+sticky+mouse.">Patterned Purkinje cell loss in the ataxic sticky mouse.</a> Eur. J. Neurosci. 34, 79-86 (2011).</li><li>El-Bizri, N., Guignabert, C., Wang, L., Cheng, A., Stankunas, K., Chang, C. P., Mishina, Y., Rabinovitch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SM22alpha-targeted+deletion+of+bone+morphogenetic+protein+receptor+1A+in+mice+impairs+cardiac+and+vascular+development,+and+influences+organogenesis.">SM22alpha-targeted deletion of bone morphogenetic protein receptor 1A in mice impairs cardiac and vascular development, and influences organogenesis.</a> Development. 135, 2981-2991 (2008).</li><li>Mondrinos, M. J., Koutzaki, S., Lelkes, P. I., Finck, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tissue-engineered+model+of+fetal+distal+lung+tissue.">A tissue-engineered model of fetal distal lung tissue.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 293, 639-650 (2007).</li><li>Coppola, E., Rallu, M., Richard, J., Dufour, S., Riethmacher, D., Guillemot, F., Goridis, C., Brunet, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epibranchial+ganglia+orchestrate+the+development+of+the+cranial+neurogenic+crest.">Epibranchial ganglia orchestrate the development of the cranial neurogenic crest.</a> Proc. Nat. Acad. Sci. 107, 2066-2071 (2010).</li><li>Kubilus, J. K., Linsenmayer, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+guidance+of+embryonic+corneal+innervation:+roles+of+Semaphorin3A+and+Slit2.">Developmental guidance of embryonic corneal innervation: roles of Semaphorin3A and Slit2.</a> Dev. Biol. 344, 172-184 (2010).</li><li>Reeber, S. L., Gebre, S. A., Sillitoe, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+mapping+of+afferent+topography+in+three+dimensions.">Fluorescence mapping of afferent topography in three dimensions.</a> Brain Struct. Funct. 216, 159-169 (2011).</li><li>Davis, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-mount+immunohistochemistry.">Whole-mount immunohistochemistry.</a> Methods Enzymol. 225, 502-516 (1993).</li></ol>

Wir haben die technischen Details für eine erfolgreiche wholemount Färbung mit einem vielseitigen Ansatz für immunhistochemische aufschlussreich Protein-Expression im sich entwickelnden und adulten Gehirn benötigt beschrieben. Durch diesen Ansatz lassen sich komplexe molekulare Expressionsmuster analysiert und Gehirn Topographie, ohne dass umständlich und zeitaufwendig Gewebe Schnitte Verfahren geschätzt. Dieses Protokoll wurde verwendet, um die gemusterte Expression verschiedener Prot...

<table border="1"><tbody><tr><td> Materialien </td><td> Funktion im Protokoll </td></tr><tr><td> Perfusionspumpe (Fisher Scientific/13-876-2) </td><td> Erlaubt das gleichmäßige und langsame Perfusion. </td></tr><tr><td> Sharp-Spitze Schere (FST/14081-08) </td><td> Allgemeine Anwendung in Perfusion und Präparation. </td></tr><tr><td> Blunt-Spitze Pinzetten (FST/91100-12) </td><td> Um das Herz zum Einsetzen der Perfusion Nadel zu stabilisieren. </td></tr><tr><td> Pinzetten (FST von Dumont AA/11210-10) </td><td> Zur Verwendung bei der Präparation des Gehirns aus dem Schädel und das Kleinhirn vom Rest des Gehirns zu trennen. Diese sind unabdingbar, weil sie eine leicht abgerundete Spitze, die Minimierung Schädigung des Kleinhirns beim Präparieren hilft zu haben. </td></tr><tr><td> Kolbenpendel (Fisher Scientific) </td><td> Verwendet, um Gewebe in Bewegung zu halten während der Inkubationszeit. </td></tr><tr><td> 1,5 ml Röhrchen (Sarstedt / Schraubverschluss Micro Tube) </td><td> Alle Schritte der seinetochemistry Protokoll erfolgen in diesen Mikroröhrchen. Der abgerundete Boden sorgt dafür, dass das Kleinhirn in Bewegung bleibt. </td></tr><tr><td> Perforierte Löffel (FST/10370-17) </td><td> Wird verwendet, um wholemounts in den Mikroröhrchen zu halten, während sanft Dekantieren aus der verbrauchten Lösung. </td></tr><tr><td> Leica MZ16 FA Mikroskop </td><td> Wird verwendet, um wholemount Färbung zu untersuchen. </td></tr><tr><td> Leica DFC3000 FX-Kamera </td><td> Wird verwendet, um wholemount Bilder zu fassen. </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. <table border="1"><tbody><tr><td colspan="9"> Beispiel Kalender für ein typisches Experiment wholemount </td></tr><tr><td> Tag 1 </td><td colspan="4"> Dents fix, Raumtemperatur, 8 Stunden </td><td colspan="4"> Dents Bleichmittel, 4 ° C, über Nacht </td></tr><tr><td> Tag 2 </td><td colspan="3"> 100% MeOH, Raumtemperatur, 2x, je 30 Min. </td><td colspan="3"> 100% MeOH, Frost / Tau, 4x, 30 min/15 min </td><td colspa<html> n = &quot;2&quot;&gt; 100% MeOH, -80 ° C über Nacht </td></tr><tr><td> Tag 3 </td><td> 50% MeOH/50% PBS, Raumtemperatur, 60-90 min </td><td colspan="2"> 15% MeOH / 85% PBS, Raumtemperatur, 60-90 min </td><td colspan="2"> 100% PBS, Raumtemperatur, 60-90 min </td><td> 10μg/mL Proteinase K in PBS, Raumtemperatur, 2-3 min </td><td> 100% PBS, Raumtemperatur, 3x, jeweils 10 Min. </td><td> PMT, 4 ° C, über Nacht </td></tr><tr><td> Tag 4-5 </td><td colspan="8"> PMT + 1 ° Antikörper + 5% DMSO, 4 ° C, 48 Stunden </td></tr><tr><td> Tag 6 </td><td colspan="3"> PMT, 4 ° C, 2-3x, 2-3 Std. je </td><td colspan="5"> PMT + 2 ° Antikörper + 5% DMSO, 4 ° C, 24 Stunden (oder beginnt Amplifikationsschritte mit ABC-Komplex) </td></tr><tr><td> Tag 7 </td><td colspan="2"> PMT, 4 ° C, 2-3x, 2-3 Std. je </td><td colspan="3"> PBT, Raumtemperatur, 2 Std. </td><td colspan="3"> Inkubieren in frischem DAB in PBS, bis eine optimale Färbung sichtbar gemacht </td></tr></tbody></table>_content &quot;&gt; Tabelle 2. <table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> Rezepte (* = neu zubereiten jedes Mal) </td></tr><tr><td> PBS (Phosphat gepufferte Salzlösung) </td><td> 0,1 M Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung in VE-Wasser. pH 7,2 (Sigma Tabletten; P4417) </td></tr><tr><td> PFA (Paraformaldehyd) </td><td> Gemacht und gespeichert als 20% ige Lösung eingefroren und dann verdünnt, um 4% in PBS für die funktionierende Lösung (Fisher Scientific, T353) </td></tr><tr><td> Dents Fixativ 3 * </td><td> 4 Teile Methanol 1 Teil Dimethylsulfoxid (DMSO; Fisher Scientific; D159-4) </td></tr><tr><td> Dents Bleach 3 * </td><td> 4 Teile Methanol 1 Teil Dimethylsulfoxid (DMSO; Fisher Scientific; D159-4) 1 Teil 30% iges Wasserstoffperoxid </td></tr><tr><td> Enzymatische Verdauung </td><td> 10 pg / ml Proteinase K (Roche Diagnostics, 03115828001) in PBS. </td></tr><tr><td> PBST </td><td> PBS enthält: 0,1% Tween-20 (Fisher Scientific, BP337; Triton kann auch anstelle von Tween-20 in allen Fällen verwendet werden). </td></tr><tr><td> PMT-25 * </td><td> PBS enthält: 2% fettfreier Magermilchpulver (Carnation bevorzugt) 0,1% Tween-20 (Fisher Scientific, BP337) </td></tr><tr><td> PBT 25 * </td><td> PBS enthält: 0,2% Rinderserumalbumin (Sigma; B9001S) 0,1% Tween-20 (Fisher Scientific, BP337) </td></tr><tr><td> DAB * </td><td> Lösen Sie eine 10-mg-Tablette von 3,3-Diaminobenzidin (Sigma-Aldrich; D5905) in 40 ml PBS. In 10 ul 30% iges Wasserstoffperoxid zu initiieren). </td></tr><tr><td> ABC-Komplex-Lösung </td><td> Vectastain-Kits (Vector Laboratories, Inc, PK-4000) </td></tr></tbody></table> Tabelle 3.

wholemount immunohistochemistry for revealing complex brain topography

Die wiederholte und gut verstanden zelluläre Architektur des Kleinhirns machen es ein ideales Modellsystem für die Erkundung des Gehirns Topographie. Underlying ihrer relativ einheitlichen Zytoarchitektur ist eine komplexe Anordnung von parasagittale Bereichen Gen-und Proteinexpression. Die molekulare Kompartimentierung des Kleinhirns wird durch die anatomische und funktionelle Organisation der afferenten Fasern gespiegelt. Um volles Verständnis für die Komplexität der Kleinhirn-Organisation, die wir zuvor eine wholemount Färbung Ansatz für die Hochdurchsatz-Analyse von Mustern Defekte im Kleinhirn der Maus verfeinert. Dieses Protokoll beschreibt im Detail die Reagenzien, Instrumente und praktische Schritte, die nützlich, um erfolgreich zu enthüllen Proteinexpressionsmuster in der adulten Maus Kleinhirn mit wholemount Immunfärbung sind. Die Schritte hier hervorgehoben zeigen die Nützlichkeit dieser Methode die Expression von zebrinII / aldolaseC als Beispiel, wie die feinen Topographie des Gehirns in seiner offenbarennativen dreidimensionalen Konformation. Ebenfalls beschrieben werden Anpassungen an das Protokoll, das für die Visualisierung der Proteinexpression in afferenten Vorsprünge und große Kleinhirn für vergleichende Untersuchungen der molekularen Topographie zu ermöglichen. Um diese Anwendungen zu veranschaulichen, werden Daten aus afferenten Färbung des Rattenkleinhirn enthalten.

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Wholemount Immunohistochemistry for Revealing Complex Brain Topography

Neuronale Schaltkreise sind topographisch in Funktionsräume mit spezifischen molekularen Profile organisiert. Hier bieten wir Ihnen die praktischen und technischen Schritte zur Aufdeckung globale Gehirn Topographie mit einem vielseitigen wholemount immunhistochemische Färbung Ansatz. Wir demonstrieren den Nutzen der Methode mit dem wohlverstandenen Zytoarchitektur und Schaltung des Kleinhirns.

Wholemount Immunhistochemie für die Aufdeckung von komplexen Gehirn Topographie

The repeated and well-understood cellular architecture of the cerebellum make it an ideal model system for exploring brain topography. Underlying its ...

Research

JoVE Journal

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The Subventricular Zone En-face: Wholemount Staining and Ependymal Flow

Die Subventrikularzone En-face: Wholemount Färbung und Ependymale Durchfluss

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Immunhistochemischen und Calcium Imaging Methoden in der Wholemount Rat Retina

In this paper we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of wholemount retinas for ...

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