Name: engineering adherent bacteria by creating a single synthetic curli operon
Uploaded: 2012-11-16T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Engineering Adherent Bacteria by Creating a Single Synthetic Curli Operon at JoVE.com

Vi takker de øvrige medlemmer af Lyon Insa-ENS iGEM team (Viviane Chansavang, Mathilde Dumond, Alexandre Duprey, Mélanie Geffroy, Clémence Gonthier, Margaux Jaulin, Aurélie Haag, Goki Ly, Thomas Poinsot, Béryl Royer-Bertrand, Julie Soula, Michael Vonzy , Pierre Yves Zundel, Soufiane Bouhmadi, Olivier Brette, Gaël Chambonnier, Laura Izard, Aurianne Kroiss, Philippe Lejeune, Agnès Rodrigue, Arnaud Rondelet, Sylvie Reverchon og Valérie Desjardin), vores sponsorer for deres økonomiske støtte (bioMérieux, Assystem, EDF, Fondation INSA, ENS-Lyon og Department of Biosciences Insa-Lyon), F. Wisniewski-Dye for kritisk læsning af dette manuskript og Dr. CC Sze for stamme gave. B. drogue modtager en Ph.D. stipendium fra Région Rhône-Alpes.

1. Biobrick Design og syntese af Curli Operon <ol><li> Bestemme den genetiske organisation og lokalisere de endogene transkriptionelle og translationelle signaler fra curli gener. Disse informationer er samlet i specialiserede databaser, såsom RegulonDB a eller EcoGene b og afsluttet med en nærlæsning af relevante publikationer. Datastyring og in silico preanalysis blev udført med Clone Manager c.. </li><li> Vælge de relevante kodende sekvenser. Et sæt på fem absolut n?...

<ol>
	<li>O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtiter+Dish+Biofilm+Formation+Assay.">Microtiter Dish Biofilm Formation Assay.</a> J. Vis. Exp. (47), e2437 (2011).</li><li>Melamed, S., Elad, T., Belkin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+sensor+cell+arrays.">Microbial sensor cell arrays.</a> Curr. Opin. Biotechnol. , (2011).</li><li>Melamed, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+printed+nanolitre-scale+bacterial+sensor+array.">A printed nanolitre-scale bacterial sensor array.</a> Lab Chip. 11, 139-146 (2011).</li><li>Raghu, G., Balaji, V., Venkateswaran, G., Rodrigue, A., Maruthi Mohan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioremediation+of+trace+cobalt+from+simulated+spent+decontamination+solutions+of+nuclear+power+reactors+using+E.+coli+expressing+NiCoT+genes.">Bioremediation of trace cobalt from simulated spent decontamination solutions of nuclear power reactors using E. coli expressing NiCoT genes.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 81, 571-578 (2008).</li><li>Olsen, A., Jonsson, A., Normark, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin+binding+mediated+by+a+novel+class+of+surface+organelles+on+Escherichia+coli.">Fibronectin binding mediated by a novel class of surface organelles on Escherichia coli.</a> Nature. 338, 652-655 (1989).</li><li>Prigent-Combaret, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+pathway+for+biofilm+formation+in+curli-producing+Escherichia+coli+strains:+role+of+flagella,+curli+and+colanic+acid.">Developmental pathway for biofilm formation in curli-producing Escherichia coli strains: role of flagella, curli and colanic acid.</a> Environ. Microbiol. 2, 450-464 (2000).</li><li>Chapman, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Escherichia+coli+curli+operons+in+directing+amyloid+fiber+formation.">Role of Escherichia coli curli operons in directing amyloid fiber formation.</a> Science. 295, 851-855 (2002).</li><li>Vidal, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+an+Escherichia+coli+K-12+mutant+strain+able+to+form+biofilms+on+inert+surfaces:+involvement+of+a+new+ompR+allele+that+increases+curli+expression.">Isolation of an Escherichia coli K-12 mutant strain able to form biofilms on inert surfaces: involvement of a new ompR allele that increases curli expression.</a> J. Bacteriol. 180, 2442-2449 (1998).</li><li>Hidalgo, G., Chen, X., Hay, A. G., Lion, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curli+produced+by+Escherichia+coli+PHL628+provide+protection+from+Hg(II).">Curli produced by Escherichia coli PHL628 provide protection from Hg(II).</a> Appl. Environ. Microbiol. 76, 6939-6941 (2010).</li><li>Garzon-Rodriguez, W., Yatsimirsky, A. K., Glabe, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+Zn(II),+Cu(II),+and+Fe(II)+ions+to+Alzheimer's+A+beta+peptide+studied+by+fluorescence.">Binding of Zn(II), Cu(II), and Fe(II) ions to Alzheimer's A beta peptide studied by fluorescence.</a> Bioorg. Med. Chem. Lett. 9, 2243-2248 (1999).</li><li>Taylor, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+resolution+insights+into+curli+fiber+biogenesis.">Atomic resolution insights into curli fiber biogenesis.</a> Structure. 19, 1307-1316 (2011).</li><li>Brombacher, E., Dorel, C., Zehnder, A. J., Landini, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+curli+biosynthesis+regulator+CsgD+co-ordinates+the+expression+of+both+positive+and+negative+determinants+for+biofilm+formation+in+Escherichia+coli.">The curli biosynthesis regulator CsgD co-ordinates the expression of both positive and negative determinants for biofilm formation in Escherichia coli.</a> Microbiology. 149, 2847-2857 (2003).</li><li>Pesavento, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inverse+regulatory+coordination+of+motility+and+curli-mediated+adhesion+in+Escherichia+coli.">Inverse regulatory coordination of motility and curli-mediated adhesion in Escherichia coli.</a> Genes Dev. 22, 2434-2446 (2008).</li><li>Dueholm, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrillation+of+the+major+curli+subunit+CsgA+under+a+wide+range+of+conditions+implies+a+robust+design+of+aggregation.">Fibrillation of the major curli subunit CsgA under a wide range of conditions implies a robust design of aggregation.</a> Biochemistry. 50, 8281-8290 (2011).</li><li>Jubelin, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CpxR/OmpR+interplay+regulates+curli+gene+expression+in+response+to+osmolarity+in+Escherichia+coli.">CpxR/OmpR interplay regulates curli gene expression in response to osmolarity in Escherichia coli.</a> J. Bacteriol. 187, 2038-2049 (2005).</li><li>Ogasawara, H., Yamamoto, K., Ishihama, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+biofilm+master+regulator+CsgD+in+cross-regulation+between+biofilm+formation+and+flagellar+synthesis.">Role of the biofilm master regulator CsgD in cross-regulation between biofilm formation and flagellar synthesis.</a> J. Bacteriol. 193, 2587-2597 (2011).</li><li>Mostaert, A. S., Higgins, M. J., Fukuma, T., Rindi, F., Jarvis, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+mechanical+characterisation+of+amyloid+fibrils+discovered+in+a+natural+adhesive.">Nanoscale mechanical characterisation of amyloid fibrils discovered in a natural adhesive.</a> J. Biol. Phys. 32, 393-401 (2006).</li><li>Hammar, M., Arnqvist, A., Bian, Z., Olsen, A., Normark, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+two+csg+operons+is+required+for+production+of+fibronectin-+and+congo+red-binding+curli+polymers+in+Escherichia+coli+K-12.">Expression of two csg operons is required for production of fibronectin- and congo red-binding curli polymers in Escherichia coli K-12.</a> Mol. Microbiol. 18, 661-670 (1995).</li><li>Blaha, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Escherichia+coli+metallo-regulator+RcnR+represses+rcnA+and+rcnR+transcription+through+binding+on+a+shared+operator+site:+Insights+into+regulatory+specificity+towards+nickel+and+cobalt.">The Escherichia coli metallo-regulator RcnR represses rcnA and rcnR transcription through binding on a shared operator site: Insights into regulatory specificity towards nickel and cobalt.</a> Biochimie. 93, 434-439 (2011).</li><li>Miao, H., Ratnasingam, S., Pu, C. S., Desai, M. M., Sze, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+fluorescence+system+for+flow+cytometric+analysis+of+Escherichia+coli+transcriptional+response+in+multi-species+context.">Dual fluorescence system for flow cytometric analysis of Escherichia coli transcriptional response in multi-species context.</a> J. Microbiol. Methods. 76, 109-119 (2009).</li><li>Chung, C. T., Niemela, S. L., Miller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+preparation+of+competent+Escherichia+coli:+transformation+and+storage+of+bacterial+cells+in+the+same+solution.">One-step preparation of competent Escherichia coli: transformation and storage of bacterial cells in the same solution.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 2172-2175 (1989).</li><li>Perrin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nickel+promotes+biofilm+formation+by+Escherichia+coli+K-12+strains+that+produce+curli.">Nickel promotes biofilm formation by Escherichia coli K-12 strains that produce curli.</a> Appl. Environ. Microbiol. 75, 1723-1733 (2009).</li><li>Bloemberg, G. V., Wijfjes, A. H., Lamers, G. E., Stuurman, N., Lugtenberg, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+imaging+of+Pseudomonas+fluorescens+WCS365+populations+expressing+three+different+autofluorescent+proteins+in+the+rhizosphere:+new+perspectives+for+studying+microbial+communities.">Simultaneous imaging of Pseudomonas fluorescens WCS365 populations expressing three different autofluorescent proteins in the rhizosphere: new perspectives for studying microbial communities.</a> Mol. Plant Microbe Interact. 13, 1170-1176 (2000).</li><li>Landini, P., Jubelin, G., Dorel, C., Callow,, J., Smith, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biological Adhesives. , (2006).</li><li>Bridier, A., Dubois-Brissonnet, F., Boubetra, A., Thomas, V., Briandet, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biofilm+architecture+of+sixty+opportunistic+pathogens+deciphered+using+a+high+throughput+CLSM+method.">The biofilm architecture of sixty opportunistic pathogens deciphered using a high throughput CLSM method.</a> J. Microbiol. Methods. 82, 64-70 (2010).</li><li>Ceri, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Calgary+Biofilm+Device:+new+technology+for+rapid+determination+of+antibiotic+susceptibilities+of+bacterial+biofilms.">The Calgary Biofilm Device: new technology for rapid determination of antibiotic susceptibilities of bacterial biofilms.</a> J. Clin. Microbiol. 37, 1771-1776 (1999).</li><li>Harrison, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+microscopy+and+three-dimensional+visualization+to+evaluate+the+structure+of+microbial+biofilms+cultivated+in+the+Calgary+Biofilm+Device.">The use of microscopy and three-dimensional visualization to evaluate the structure of microbial biofilms cultivated in the Calgary Biofilm Device.</a> Biol. Proced. Online. 8, 194-215 (2006).</li><li>Chavant, P., Gaillard-Martinie, B., Talon, R., Hebraud, M., Bernardi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+device+for+rapid+evaluation+of+biofilm+formation+potential+by+bacteria.">A new device for rapid evaluation of biofilm formation potential by bacteria.</a> J. Microbiol. Methods. 68, 605-612 (2007).</li><li>Miller, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Experiments in molecular genetics. , (1972).</li></ol>

Kritiske trin Det mest kritiske skridt i denne syntetisk biologi tilgang er gen design. Syntetisk gen design skal være omhyggelig for at sikre et effektivt system produktion. To gener, der koder fiber monomerer og tre gener, der koder proteiner involveret i deres sekretionssystem er samlet med en stærk og metal-inducerbar promotor for at skabe en ny funktionel enhed til en ny applikation: bio-dekontaminering af nuklear spildevand. Som planlagt og forudsagt, denne enhed fører til en forbedret...

Bakteriel tilslutning til abiotisk support spiller en vigtig rolle i bioremediering, biokatalyse eller mikrobiel brændselsceller. Bioremediering processer benytter kapacitet mikroorganismer til at nedbryde organiske stoffer, eller at ændre metalfordeling (immobilisering, flygtiggørelse) eller artsbestemmelse. Disse gavnlige aktiviteter er observeret i akvatiske og terrestriske økosystemer, men også i de kunstige systemer er udviklet til at behandle forurenet vand fra industri og husholdninger affald. Intensiteten og kvaliteten af ​​den mikrobielle aktivitet afhænger af fysisk-kemiske faktorer, men også af livsstil af mikroorganismer (fritflydende eller indlejret i biofilm). The biofilmdannelse er forbundet med en metabolisme fremme resistens over for biocider ved forskellige mekanismer. Dette fænomen vil derfor fremmes i de fleste bioremediering processer. Desuden har engineering Escherichia coli-celler til kontrol af biofilmdannelse er blevet anvendt med succes tilimmobilisere helcelle-sensorer på biochips 2-3. Tilpasning af mikroorganismer til høj koncentration af metaller sker via forskellige mekanismer såsom adsorption til ekstracellulære matrixkomponenter, aktivering af udstrømningspumpe eller specifikke bærere i stand til at koncentrere metallet ind i cellen. Fremme disse bakterielle aktiviteter via genteknologi muliggør effektiv og billig behandling af metal forurening i laboratorieskala, især i tilfælde af meget toksiske metaller i svag mængde som beskrevet af Raghu et al. 2008 4. Bakteriel rensning repræsenterer i dette tilfælde en konkurrencedygtig og omkostningsbesparende fremgangsmåde i forhold til klassiske kemiske processer ved hjælp af ionbytterharpikser. Forfatterne beskrev en E. coli chassis gensplejset for cobalt optagelse og retention ved først at banke det efflukspumpen kodende gen rcnA og derefter ved transformation med en multi kopi plasmid tillader overproduktion af ettransportør med præferentiel optagelse for cobalt. sådan stamme vises som et effektivt alternativ til ionbytterharpikser til behandling af radioaktivt spildevand, men et centralt uløst problem er genvinding af forurenede bakterier ved afslutningen af processen 4. Målet med vores arbejde var derfor at konstruere en specialdesignet stamme i stand til at holde sig til abiotiske bærere såsom glas eller plastik. Blandt hele sættet af adhæsiner og klæbende fimbriae identificeret i Gram-bakterier, valgte vi at designe et system, der giver curli produktion. Curli er tynde (2-5 nm diameter) og stærkt aggregative amyloid fibre, der rager ud fra E. coli and Salmonella overflade som en ikke-krystallinsk og uopløselig matrix 5-7. Curli er også involveret i koloniseringen af abiotiske overflader og udvikling af biofilm 8. Curli blev for nylig vist at binde kviksoelvionerne 9. Amyloider er faktisk kendt for at besidde højaffinitet for metaller ioner, såsom Cu2 +, Zn2 + og Fe3 + 10. Denne egenskab kan yderligere forbedre dekontaminering af metal forurenede spildevand. CSG klynge er ansvarlig for produktionen af curli fibre og er udgøres af to divergerende transkriberede operoner (figur 1). The CSGB, csgA og csgC gener udgør den forstand operon, der koder for de to curli underenheder, CsgA og CSGB. CsgC synes at være involveret i redox aktivitet inden for curli Biogenese systemet og påvirke CsgG pore adfærd 11. Imidlertid fravær af csgC i de fleste curli-producerende bakterier indikerer, at det tilsvarende protein indeholder kun en sekundær grad af kontrol over curli biogenese. At forenkle systemet har vi valgt at arbejde med det mindste antal gener. Den csgDEFG operonencodes proteiner, essentielle i forordningen og transportaf CsgA og CSGB til celleoverfladen. CsgD er en transskriptionel aktivator ifølge den csgBAC operonen og spiller en central rolle i kontrollen af biofilmdannelse ved at styre produktionen af curli fimbriae og andre biofilm komponenter såsom cellulose 12 og ved inhibering af flagel fremstilling 13. CsgE, CsgF og CsgG udgør en curli-specifikt sekretorisk apparat ydermembranen, hvorigennem det store curli underenhedsprotein CsgA udskilles som et opløseligt protein. Polymerisationen af CsgA afhænger in vivo af membranbundne kimdannelsesmiddel protein CSGB (gennemgået i 14). Komplekse regulatoriske veje, der involverer flere to-komponentsystemer er blevet vist at styre curli genekspression 15-16. Disse komplekse regler tillader bakterier til dannelse af tykke biofilm via curli produktion som reaktion på miljømæssige signaler, men er vanskelige at styre til industrielle anvendelser. For at lette inddrivelsen af ​​The Metal-fyldte bakterier i en industriel proces, bakteriel fastgørelse til en fast bærer faktisk skal kontrolleres af veldefinerede parametre (ne). De adhærerende egenskaber curli hænger sammen med amyloid art 17 og kan anvendes til at forbedre bioremediering processer, men en enklere og let styret anordning skal oprettes. Blandt disse syv gener 18, absolut et sæt af 5 kræves gener for curli syntese (CSGB og csgA kodende fibre monomerer) og eksport (csgE csgF og csgG, der koder for curli sekretion komplekset) blev udvalgt til konstruktion af syntetiske operon. At undslippe den &quot;naturlige&quot; regulering af curli, en syntetisk operon omfatter disse 5 CSG ​​gener under kontrol af en stærk og kobolt-overinducible promotor (figur 2) blev designet og syntetiseret. Trin-for-trin analyse af curli-kodende region og design procedure for en funktionel SYNæstetiske operon beskrives. To metoder til at visualisere og kvantificere bakteriel vedhæftning til polystyren og glas er forklaret.

<table border="1"><tbody><tr><td> Navn på reagenset </td><td> Firma </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer (valgfrit) </td></tr><tr><td> pIG2 </td><td></td><td></td><td> pUC57 (pMB1 ori, 2710 bp) med et 3165 bp EcoRI / PstI-fragment indeholdende den syntetiske P RCN - csgBAEFG operon; Ampr </td></tr><tr><td> pUC18 </td><td></td><td></td><td> Multikopiplasmid (pMB1 ori, 2686 bp), Amp r </td></tr><tr><td> S23 </td><td></td><td></td><td> SSC1 (= GFP-mærkede MG1655, gave CC Sze) / pIG2 </td></tr><tr><td> S24 </td><td></td><td></td><td> SSC1/pUC18 </td></tr><tr><td> CoCl 2 </td><td> Sigma </td><td></td><td> 0,1 M stamopløsning holdes ved stuetemperatur </td></tr><tr><td> M63 </td><td></td><td></td><td> 29 </td&gt; </tr><tr><td> 24-brønds plade </td><td> Nunc </td><td> 55.429 </td><td> Polystyren plader med 24 brønde </td></tr></tbody></table>

engineering adherent bacteria by creating a single synthetic curli operon

Den her beskrevne fremgangsmåde består i at omlægge E. coli-adhærensegenskaber ved at samle det mindste antal curli gener under kontrol af en stærk og metal-overinducible promotor og i visualisere og kvantificere den resulterende forstærkning af bakteriel vedhæftning. Denne metode gælder passende tekniske principper om abstraktion og standardisering af syntetisk biologi, og resultater på BBa_K540000 Biobrick (Bedste nye Biobrick enhed, manipuleret, iGEM 2011). Det første trin består i udformningen af ​​den syntetiske operon helliget curli overproduktion som reaktion på metal, og dermed at øge vedhæftningen evner af vildtypestammen. Den oprindelige curli operon blev ændret i silico for at optimere transkriptionelle og translationelle signaler og undslippe den &quot;naturlige&quot; regulering af curli. Denne fremgangsmåde gjorde det muligt at teste med succes vores nuværende forståelse af curli produktion. Moreover, forenkle curli regulering ved at skifte den endogene kompleks promotor (mere end 10 transkriptionelle regulatorer identificeret) til et enkelt metal-reguleret promotor gør vedhæftning meget lettere at kontrollere. Det andet trin omfatter kvalitativ og kvantitativ vurdering af overholdelse evner ved implementering af simple metoder. Disse fremgangsmåder er anvendelige til en lang række af adhærente bakterier uanset biologiske strukturer involveret i biofilmdannelse. Overholdelse test i 24-brønds polystyrenplader giver en hurtig indledende visualisering af den bakterielle biofilm efter krystalviolet farvning. Dette kvalitative test kan skærpes ved kvantificering af den procentdel af overholdelse. En sådan fremgangsmåde er meget enkel men mere præcis end kun krystalviolet farvning som beskrevet tidligere 1 med både en god reproducerbarhed. Visualisering af GFP-mærkede bakterier på objektglas ved fluorescens eller laser confOcal mikroskopi tillader at styrke de opnåede resultater med den 24-brønds plade test ved direkte observation af fænomenet.

In silico annotation af vildtype CSG-sekvensen af E. coli K12 forbundet med optimering af transkriptionelle og translationelle signaler har gjort det muligt at udforme enkelt syntetisk curli operon P RCN-CSG vist i figur 3 (fuld sekvens i supplerende data). Protokol nr. 2 og protokol 3, blev anvendt til at visualisere og kvantificere overholdelse er forbundet med curli produktion. Med krystalviolet farvning på 24-brønds polystyrenplader (protocole 2) biofilmdannelse...

Watch this Scientific Journal Video about Engineering Adherent Bacteria by Creating a Single Synthetic Curli Operon at JoVE.com

Engineering Adherent Bacteria by Creating a Single Synthetic Curli Operon

Udformningen af ​​en syntetisk operon kodende både den sekretoriske apparat og de strukturelle monomerer i curli fibre er beskrevet. Overproduktion af disse amyloider og adhærente polymerer giver en målbar gevinst for vedhæftning af den<em&gt; E. coli</em&gt; Chassis<sup&gt; 1</sup&gt;. Nemme måder at visualisere og kvantificere vedhæftning forklares.

Engineering adhærerende bakterier ved at skabe en enkelt syntetisk Curli Operon

The  method described here consists in redesigning E. coli adherence properties by assembling the minimum number of  curli genes under the control of a ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Procedure for Lung Engineering

Lung tissue, including lung cancer and chronic lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease, cumulatively account for some 280,000 deaths ...

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Synthetic, Multi-Layer, Self-Oscillating Vocal Fold Model Fabrication

Syntetisk, Multi-Layer, Self-Oscillerende Vocal Fold Model Fabrication

Sound for the human voice is produced via flow-induced vocal fold vibration. The vocal folds consist of several layers of tissue, each with differing ...

Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

Nanoparticulate  systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their  ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to ...

Synthetic Spider Silk Production on a Laboratory Scale

Syntetisk edderkoppespind Produktionen på laboratorieskala

As society progresses and resources become scarcer, it is becoming increasingly important to cultivate new technologies that engineer next generation ...

High efficiency, Site-specific Transfection of Adherent Cells with siRNA Using Microelectrode Arrays (MEA)

High efficiency, Site-specific Transfection of Adherent Cells with siRNA Using Microelectrode Arrays MEA

Høj effektivitet, Site-specifik Transfektion af adhærente celler med siRNA Brug mikroelektrode Arrays (MEA)

The discovery of RNAi pathway in eukaryotes and the subsequent development of RNAi agents, such as siRNA and shRNA, have achieved a potent method for ...

Density Gradient Multilayered Polymerization (DGMP): A Novel Technique for Creating Multi-compartment, Customizable Scaffolds for Tissue Engineering

Density Gradient Multilayered Polymerization DGMP: A Novel Technique for Creating Multi-compartment, Customizable Scaffolds for Tissue Engineering

Densitetsgradient flerlags Polymerisation (DGMP): En ny teknik til at skabe Multi-rum, Customizable stilladser til Tissue Engineering

Complex tissue culture matrices, in which types and concentrations of biological stimuli (e.g. growth factors, inhibitors, or small molecules) or matrix ...

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

Optisk påvisning af<em&gt; E. coli</em&gt; bakterier ved Mesoporøse Silicon biosensorer

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a ...

Nanomanipulation of Single RNA Molecules by Optical Tweezers

Nanomanipulation af Single RNA-molekyler af Optisk Pincet

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be ...

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

Tissue Engineering af Intrinsic Vaskularisering i en<em&gt; In vivo</em&gt; Tissue Engineering Chamber

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and ...