Name: engineering adherent bacteria by creating a single synthetic curli operon
Uploaded: 2012-11-16T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Engineering Adherent Bacteria by Creating a Single Synthetic Curli Operon at JoVE.com

Vi takker andre medlemmer av Lyon INSA-ENS iGEM team (Viviane Chansavang, Mathilde Dumond, Alexandre DUPREY, Mélanie Geffroy, Clémence Gonthier, Margaux Jaulin, Aurélie Haag, Goki Ly, Thomas Poinsot, Béryl Royer-Bertrand, Julie Soula, Michael Vonzy , Pierre Yves Zundel, Soufiane Bouhmadi, Olivier Brette, Gaël Chambonnier, Laura Izard, Aurianne Kroiss, Philippe Lejeune, Agnès Rodrigue, Arnaud Rondelet, Sylvie Reverchon og Valérie Desjardin), våre sponsorer for deres økonomiske støtte (bioMérieux, Assystem, EDF, Fondation INSA, ENS-Lyon og Institutt for biovitenskap INSA-Lyon), F. Wisniewski-dye for kritisk lesning av dette manuskriptet og Dr CC Sze for belastning gave. B. Drogue mottar en doktorgrad fellesskapet fra Région Rhône-Alpes.

1. Biobrick Design og syntese av Curli operon <ol><li> Fastslå den genetiske organisasjonen og lokalisere de endogene transkripsjons-og translasjons-signaler av curli gener. Disse opplysninger er samlet i spesialiserte databaser som RegulonDB a eller EcoGene b og fullført av en grundig lesning av relevante publikasjoner. Data management og i silico preanalysis ble utført med Clone Manager c. </li><li> Velg de aktuelle kodende sekvenser. Et sett av fem helt nødvendige gener...

<ol>
	<li>O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtiter+Dish+Biofilm+Formation+Assay.">Microtiter Dish Biofilm Formation Assay.</a> J. Vis. Exp. (47), e2437 (2011).</li><li>Melamed, S., Elad, T., Belkin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+sensor+cell+arrays.">Microbial sensor cell arrays.</a> Curr. Opin. Biotechnol. , (2011).</li><li>Melamed, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+printed+nanolitre-scale+bacterial+sensor+array.">A printed nanolitre-scale bacterial sensor array.</a> Lab Chip. 11, 139-146 (2011).</li><li>Raghu, G., Balaji, V., Venkateswaran, G., Rodrigue, A., Maruthi Mohan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioremediation+of+trace+cobalt+from+simulated+spent+decontamination+solutions+of+nuclear+power+reactors+using+E.+coli+expressing+NiCoT+genes.">Bioremediation of trace cobalt from simulated spent decontamination solutions of nuclear power reactors using E. coli expressing NiCoT genes.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 81, 571-578 (2008).</li><li>Olsen, A., Jonsson, A., Normark, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin+binding+mediated+by+a+novel+class+of+surface+organelles+on+Escherichia+coli.">Fibronectin binding mediated by a novel class of surface organelles on Escherichia coli.</a> Nature. 338, 652-655 (1989).</li><li>Prigent-Combaret, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+pathway+for+biofilm+formation+in+curli-producing+Escherichia+coli+strains:+role+of+flagella,+curli+and+colanic+acid.">Developmental pathway for biofilm formation in curli-producing Escherichia coli strains: role of flagella, curli and colanic acid.</a> Environ. Microbiol. 2, 450-464 (2000).</li><li>Chapman, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Escherichia+coli+curli+operons+in+directing+amyloid+fiber+formation.">Role of Escherichia coli curli operons in directing amyloid fiber formation.</a> Science. 295, 851-855 (2002).</li><li>Vidal, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+an+Escherichia+coli+K-12+mutant+strain+able+to+form+biofilms+on+inert+surfaces:+involvement+of+a+new+ompR+allele+that+increases+curli+expression.">Isolation of an Escherichia coli K-12 mutant strain able to form biofilms on inert surfaces: involvement of a new ompR allele that increases curli expression.</a> J. Bacteriol. 180, 2442-2449 (1998).</li><li>Hidalgo, G., Chen, X., Hay, A. G., Lion, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curli+produced+by+Escherichia+coli+PHL628+provide+protection+from+Hg(II).">Curli produced by Escherichia coli PHL628 provide protection from Hg(II).</a> Appl. Environ. Microbiol. 76, 6939-6941 (2010).</li><li>Garzon-Rodriguez, W., Yatsimirsky, A. K., Glabe, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+Zn(II),+Cu(II),+and+Fe(II)+ions+to+Alzheimer's+A+beta+peptide+studied+by+fluorescence.">Binding of Zn(II), Cu(II), and Fe(II) ions to Alzheimer's A beta peptide studied by fluorescence.</a> Bioorg. Med. Chem. Lett. 9, 2243-2248 (1999).</li><li>Taylor, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+resolution+insights+into+curli+fiber+biogenesis.">Atomic resolution insights into curli fiber biogenesis.</a> Structure. 19, 1307-1316 (2011).</li><li>Brombacher, E., Dorel, C., Zehnder, A. J., Landini, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+curli+biosynthesis+regulator+CsgD+co-ordinates+the+expression+of+both+positive+and+negative+determinants+for+biofilm+formation+in+Escherichia+coli.">The curli biosynthesis regulator CsgD co-ordinates the expression of both positive and negative determinants for biofilm formation in Escherichia coli.</a> Microbiology. 149, 2847-2857 (2003).</li><li>Pesavento, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inverse+regulatory+coordination+of+motility+and+curli-mediated+adhesion+in+Escherichia+coli.">Inverse regulatory coordination of motility and curli-mediated adhesion in Escherichia coli.</a> Genes Dev. 22, 2434-2446 (2008).</li><li>Dueholm, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrillation+of+the+major+curli+subunit+CsgA+under+a+wide+range+of+conditions+implies+a+robust+design+of+aggregation.">Fibrillation of the major curli subunit CsgA under a wide range of conditions implies a robust design of aggregation.</a> Biochemistry. 50, 8281-8290 (2011).</li><li>Jubelin, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CpxR/OmpR+interplay+regulates+curli+gene+expression+in+response+to+osmolarity+in+Escherichia+coli.">CpxR/OmpR interplay regulates curli gene expression in response to osmolarity in Escherichia coli.</a> J. Bacteriol. 187, 2038-2049 (2005).</li><li>Ogasawara, H., Yamamoto, K., Ishihama, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+biofilm+master+regulator+CsgD+in+cross-regulation+between+biofilm+formation+and+flagellar+synthesis.">Role of the biofilm master regulator CsgD in cross-regulation between biofilm formation and flagellar synthesis.</a> J. Bacteriol. 193, 2587-2597 (2011).</li><li>Mostaert, A. S., Higgins, M. J., Fukuma, T., Rindi, F., Jarvis, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+mechanical+characterisation+of+amyloid+fibrils+discovered+in+a+natural+adhesive.">Nanoscale mechanical characterisation of amyloid fibrils discovered in a natural adhesive.</a> J. Biol. Phys. 32, 393-401 (2006).</li><li>Hammar, M., Arnqvist, A., Bian, Z., Olsen, A., Normark, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+two+csg+operons+is+required+for+production+of+fibronectin-+and+congo+red-binding+curli+polymers+in+Escherichia+coli+K-12.">Expression of two csg operons is required for production of fibronectin- and congo red-binding curli polymers in Escherichia coli K-12.</a> Mol. Microbiol. 18, 661-670 (1995).</li><li>Blaha, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Escherichia+coli+metallo-regulator+RcnR+represses+rcnA+and+rcnR+transcription+through+binding+on+a+shared+operator+site:+Insights+into+regulatory+specificity+towards+nickel+and+cobalt.">The Escherichia coli metallo-regulator RcnR represses rcnA and rcnR transcription through binding on a shared operator site: Insights into regulatory specificity towards nickel and cobalt.</a> Biochimie. 93, 434-439 (2011).</li><li>Miao, H., Ratnasingam, S., Pu, C. S., Desai, M. M., Sze, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+fluorescence+system+for+flow+cytometric+analysis+of+Escherichia+coli+transcriptional+response+in+multi-species+context.">Dual fluorescence system for flow cytometric analysis of Escherichia coli transcriptional response in multi-species context.</a> J. Microbiol. Methods. 76, 109-119 (2009).</li><li>Chung, C. T., Niemela, S. L., Miller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+preparation+of+competent+Escherichia+coli:+transformation+and+storage+of+bacterial+cells+in+the+same+solution.">One-step preparation of competent Escherichia coli: transformation and storage of bacterial cells in the same solution.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 2172-2175 (1989).</li><li>Perrin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nickel+promotes+biofilm+formation+by+Escherichia+coli+K-12+strains+that+produce+curli.">Nickel promotes biofilm formation by Escherichia coli K-12 strains that produce curli.</a> Appl. Environ. Microbiol. 75, 1723-1733 (2009).</li><li>Bloemberg, G. V., Wijfjes, A. H., Lamers, G. E., Stuurman, N., Lugtenberg, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+imaging+of+Pseudomonas+fluorescens+WCS365+populations+expressing+three+different+autofluorescent+proteins+in+the+rhizosphere:+new+perspectives+for+studying+microbial+communities.">Simultaneous imaging of Pseudomonas fluorescens WCS365 populations expressing three different autofluorescent proteins in the rhizosphere: new perspectives for studying microbial communities.</a> Mol. Plant Microbe Interact. 13, 1170-1176 (2000).</li><li>Landini, P., Jubelin, G., Dorel, C., Callow,, J., Smith, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biological Adhesives. , (2006).</li><li>Bridier, A., Dubois-Brissonnet, F., Boubetra, A., Thomas, V., Briandet, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biofilm+architecture+of+sixty+opportunistic+pathogens+deciphered+using+a+high+throughput+CLSM+method.">The biofilm architecture of sixty opportunistic pathogens deciphered using a high throughput CLSM method.</a> J. Microbiol. Methods. 82, 64-70 (2010).</li><li>Ceri, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Calgary+Biofilm+Device:+new+technology+for+rapid+determination+of+antibiotic+susceptibilities+of+bacterial+biofilms.">The Calgary Biofilm Device: new technology for rapid determination of antibiotic susceptibilities of bacterial biofilms.</a> J. Clin. Microbiol. 37, 1771-1776 (1999).</li><li>Harrison, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+microscopy+and+three-dimensional+visualization+to+evaluate+the+structure+of+microbial+biofilms+cultivated+in+the+Calgary+Biofilm+Device.">The use of microscopy and three-dimensional visualization to evaluate the structure of microbial biofilms cultivated in the Calgary Biofilm Device.</a> Biol. Proced. Online. 8, 194-215 (2006).</li><li>Chavant, P., Gaillard-Martinie, B., Talon, R., Hebraud, M., Bernardi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+device+for+rapid+evaluation+of+biofilm+formation+potential+by+bacteria.">A new device for rapid evaluation of biofilm formation potential by bacteria.</a> J. Microbiol. Methods. 68, 605-612 (2007).</li><li>Miller, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Experiments in molecular genetics. , (1972).</li></ol>

Kritiske trinn Den mest kritiske trinn i denne syntetiske biologi tilnærming er genet motivet. Syntetisk gen design har å være grundig for å sikre et effektivt system produksjon. To gener som koder for fiber monomerer og tre gener som koder for proteiner involvert i deres sekresjon system er satt sammen med en sterk og metall-induserbar promoter å opprette en ny funksjonell enhet for en ny anvendelse: bio-rensing av kjernefysisk avløp. Som planlagt og spådd, fører denne enheten til en f...

Bakteriell tilslutning til abiotiske støtte spiller en stor rolle i bioremediering, Biokatalyse eller mikrobiell brenselceller. Bioremediering prosesser bruker kapasiteten til mikroorganismer å degradere organiske stoffer, eller å endre metall fordeling (immobilisering, fordampning) eller artsdannelse. Disse gunstige virksomhet blir fulgt i akvatiske og terrestriske økosystemer, men også i de kunstige systemer utviklet for å behandle forurenset vann av industrielle og innenlandske avfall. Intensiteten og kvaliteten på mikrobiell aktivitet avhenge fysikalsk-kjemiske faktorer, men også på livsstil av mikroorganismer (frittflytende eller innebygd i biofilm). Biofilmdannelse er assosiert med en metabolisme fremme resistens mot biocider ved ulike mekanismer. Dette fenomenet vil derfor bli oppmuntret i de fleste bioremediering prosesser. Videre har tekniske Escherichia coli-celler for å kontrollere dannelse av biofilm blitt brukt tilimmobilize hel-celle sensorer på biochips 2-3. Tilpasning av mikroorganismer for høy konsentrasjon av metaller skjer via diverse mekanismer slik som adsorpsjon til ekstracellulære matriks-komponenter, aktivering av efflukspumpe eller spesifikke bærere kunne konsentrere metallet inn i cellen. Styrking disse bakterielle aktivitetene via genteknologi tillater effektiv og billig behandling av metall forurensningen på laboratorieskala, spesielt i tilfelle av svært giftige metaller i svak mengde som beskrevet av Raghu m.fl.. 2008 4. Bakteriell utbedring representerer i dette tilfellet en konkurransedyktig og kostnadsbesparende metode i forhold til klassiske kjemiske prosesser ved hjelp av ionebytterharpikser. Forfatterne beskrev en E. coli chassis genmodifisert for kobolt opptak og retensjon første ved å slå ut den efflukspumpe koding genet rcnA, og deretter ved transformasjon med en multi kopi plasmid slik overproduksjon av entransportør med fortrinnsrett opptak for kobolt. slikt stamme vises som et effektivt alternativ til ioneutvekslende å behandle radioaktive effluent, men en nøkkel uløst problem er utvinningen av forurensede bakterier ved slutten av prosessen 4. Målet med vårt arbeid har derfor vært å konstruere en spesialdesignede belastning i stand til å holde seg til abiotiske støtter som glass eller plast. Blant hele settet av adhesiner og tilhenger fimbriae identifisert i Gram-bakterier, valgte vi å utforme et system som tillater curli produksjon. Curli er tynne (2-5 nm diameter) og svært aggregative amyloid fibre som stikker fra E. coli og Salmonella overflaten som et ikke-krystallinsk og uoppløselig matrise 5-7. Curli er også involvert i koloniseringen av abiotiske overflater og utvikling av biofilm 8. Curli ble nylig vist å binde kvikksølv ioner 9. Amyloids er faktisk kjent for å ha høyaffinitet for metallioner som Cu 2 +, Zn 2 + og Fe 3 + 10. Denne egenskapen kan ytterligere forbedre rensing av metall forurensede utslipp. CSG klyngen er ansvarlig for produksjonen av curli fibre og er konstituert av to divergently transkriberte operons (figur 1). Den csgB, csgA og csgC gener utgjør den forstand operon, koding de to curli subenheter, CsgA og CsgB. CsgC synes å være involvert i redoks aktivitet innen curli biogenesis systemet og påvirke CsgG pore oppførsel 11. Imidlertid indikerer fravær av csgC i de fleste curli-produserende bakterier som tilsvarende protein gir bare en sekundær nivå av kontroll over curli biogenesis. For å forenkle systemet, har vi blitt valgt til å jobbe med minimum antall gener. Den csgDEFG operonencodes proteiner essensielle i reguleringen og transportav CsgA og CsgB til celleoverflaten. CsgD er en transkripsjonen aktivator av csgBAC operonen og spiller en sentral rolle i kontrollen av biofilmdannelse ved å kontrollere produksjonen av curli fimbriae og andre biofilmprosesser komponenter som cellulose 12 og ved å hemme flagellum produksjonen 13. CsgE, CsgF og CsgG utgjør en curli-spesifikk sekretoriske apparat i den ytre-membran hvorigjennom store curli subenhetsprotein CsgA utskilles som et oppløselig protein. Polymerisasjon av CsgA er avhengig i vivo på membranen-bundet nucleator proteinet CsgB (gjennomgått i 14). Komplekse regulatoriske trasé involverer flere to-komponent systemer har vist seg å kontrollere curli genekspresjon 15-16. Disse komplekse regelverk tillate bakterier å danne tykke biofilmer via curli produksjon i respons til miljømessige signaler, men er vanskelig å kontrollere for industrielle applikasjoner. For å lette utvinning av metal-fylt bakterier under en industriell prosess, må bakteriell festing til en fast bærer faktisk å bli kontrollert av veldefinert parameter (e). De adherente egenskapene curli er knyttet til deres amyloid natur 17 og kan brukes til å forbedre bioremediering prosesser, men en enklere og lett kontrollert enhet må skapes. Blant disse 7 gener 18, et sett av 5 absolutt nødvendig gener for curli syntese (csgB og csgA koding fiber monomerer) og eksport (csgE csgF og csgG, koding av curli sekresjon komplekset) ble valgt til å konstruere den syntetiske operon. Å unnslippe &quot;naturlige&quot; regulering av curli, et syntetisk operon omfattende disse 5 CSG ​​gener under kontroll av en sterk og kobolt-overinducible promotoren (figur 2) ble designet og syntetisert. Trinn-for-trinn analyse av curli-koding regionen og design prosedyre for en funksjonell synsyntetiske operon er beskrevet. To metoder for å visualisere og kvantifisere bakteriell tilslutning til isopor og glass blir forklart.

<table border="1"><tbody><tr><td> Navnet på reagensen </td><td> Selskapet </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer (valgfritt) </td></tr><tr><td> pIG2 </td><td></td><td></td><td> pUC57 (pMB1 ori, 2710 bp) med en 3165 bp EcoRI / PstI fragment som inneholder syntetiske P RCN - csgBAEFG operon; Amp r </td></tr><tr><td> pUC18 </td><td></td><td></td><td> Multicopy plasmid (pMB1 ori, 2686 bp), Amp r </td></tr><tr><td> S23 </td><td></td><td></td><td> SSC1 (= GFP-merket MG1655, gave CC Sze) / pIG2 </td></tr><tr><td> S24 </td><td></td><td></td><td> SSC1/pUC18 </td></tr><tr><td> COCl 2 </td><td> Sigma </td><td></td><td> 0,1 M stamoppløsning oppbevart i romtemperatur </td></tr><tr><td> M63 </td><td></td><td></td><td> 29 </td&gt; </tr><tr><td> 24-brønns plate </td><td> Nunc </td><td> 55429 </td><td> Polystyren 24-brønners plater </td></tr></tbody></table>

engineering adherent bacteria by creating a single synthetic curli operon

Metoden beskrevet her består i å omstrukturere E. coli tilslutning egenskaper ved montering av minimum antall curli gener under kontroll av en sterk og metall-overinducible promoter, og i å visualisere og kvantifisere den resulterende gevinst på bakteriell tilslutning. Denne metoden gjelder hensiktsmessige tekniske prinsipper av abstraksjon og standardisering av syntetisk biologi, og resultater i BBa_K540000 Biobrick (Beste nye Biobrick enhet, konstruert iGEM 2011). Det første trinnet består i utformingen av den syntetiske operon viet curli overproduksjon i respons til metall, og derfor i å øke vedheftningen evner av villtype stamme. Den opprinnelige curli operon ble endret i silico for å optimalisere transkripsjonelle og translasjonell signaler og unnslippe den &quot;naturlige&quot; regulering av curli. Denne tilnærmingen lov til å teste med suksess vår nåværende forståelse av curli produksjon. Moreover, forenkle curli regulering ved å bytte den endogene komplekse promoter (mer enn 10 transcriptional regulatorer identifisert) til en enkel metall-regulert promoter gjør tilslutning mye enklere å kontrollere. Det andre trinnet omfatter kvalitativ og kvantitativ vurdering av etterlevelse evner ved gjennomføring av enkle metoder. Disse metodene anvendes for en lang rekke adherente bakterier uavhengig av biologiske strukturer som er involvert i dannelse av biofilm. Overholdelse test i 24-brønners polystyren plater gir en rask foreløpig visualisering av bakteriell biofilm etter krystallfiolett farging. Denne kvalitative testen kan slipes ved kvantifisering av hvor stor prosentandel av etterlevelse. En slik metode er meget enkel, men mer nøyaktig enn bare krystallfiolett farging som beskrevet tidligere 1 med både en god repeterbarhet og reproduserbarhet. Visualisering av GFP-merket bakterier på glassplater av fluorescens eller laser confØcal mikroskopi tillater å styrke resultatene oppnådd med den 24-brønns plate test ved direkte observasjon av fenomenet.

I silico annotering av villtype CSG sekvens av E. coli K12 knyttet optimalisering av transkripsjons-og translasjons-signaler har tillatt å utforme den enkle syntetiske curli operonen P RCN-CSG vist i figur 3 (full sekvens i utfyllende data). Protokoll 2 og protokoll 3 ble brukt til å visualisere og kvantifisere tilslutning forbundet med curli produksjon. Bruke krystallfiolett flekker på 24-brønners polystyren plater (protocole 2) biofilmdannelse nederst fra hver b...

Watch this Scientific Journal Video about Engineering Adherent Bacteria by Creating a Single Synthetic Curli Operon at JoVE.com

Engineering Adherent Bacteria by Creating a Single Synthetic Curli Operon

Utformingen av en syntetisk operon koding både sekretoriske apparat og de strukturelle monomerer med curli fibre er beskrevet. Overproduksjon av disse amyloids og vedheftende polymerer tillater en målbar gevinst adhesjon av<em&gt; E. coli</em&gt; Chassis<sup&gt; 1</sup&gt;. Enkle måter å visualisere og kvantifisere tilslutning forklares.

Engineering tilhenger bakterier ved å opprette en enkelt Syntetisk Curli operon

The  method described here consists in redesigning E. coli adherence properties by assembling the minimum number of  curli genes under the control of a ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Procedure for Lung Engineering

Lung tissue, including lung cancer and chronic lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease, cumulatively account for some 280,000 deaths ...

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Synthetic, Multi-Layer, Self-Oscillating Vocal Fold Model Fabrication

Syntetisk, Multi-Layer, Self-Oscillerende Vocal Fold Model Fabrication

Sound for the human voice is produced via flow-induced vocal fold vibration. The vocal folds consist of several layers of tissue, each with differing ...

Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

Nanoparticulate  systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their  ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to ...

Synthetic Spider Silk Production on a Laboratory Scale

Syntetisk Spider Silk Produksjonen på en laboratorieskala

As society progresses and resources become scarcer, it is becoming increasingly important to cultivate new technologies that engineer next generation ...

High efficiency, Site-specific Transfection of Adherent Cells with siRNA Using Microelectrode Arrays (MEA)

High efficiency, Site-specific Transfection of Adherent Cells with siRNA Using Microelectrode Arrays MEA

Høy effektivitet, stedsspesifikk Transfeksjon av tilhenger Celler med siRNA Bruke microelectrode Arrays (MEA)

The discovery of RNAi pathway in eukaryotes and the subsequent development of RNAi agents, such as siRNA and shRNA, have achieved a potent method for ...

Density Gradient Multilayered Polymerization (DGMP): A Novel Technique for Creating Multi-compartment, Customizable Scaffolds for Tissue Engineering

Density Gradient Multilayered Polymerization DGMP: A Novel Technique for Creating Multi-compartment, Customizable Scaffolds for Tissue Engineering

Densitetsgradient Flerlags Polymerisasjon (DGMP): En ny metode for å lage flere kammer, som kan tilpasses Stillaser for Tissue Engineering

Complex tissue culture matrices, in which types and concentrations of biological stimuli (e.g. growth factors, inhibitors, or small molecules) or matrix ...

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

Optisk deteksjon av<em&gt; E. coli</em&gt; bakterier ved Mesoporous Silicon biosensorer

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a ...

Nanomanipulation of Single RNA Molecules by Optical Tweezers

Nanomanipulation av Enkelt RNA-molekyler ved optisk pinsett

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be ...

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

Tissue Engineering ved Intrinsic vaskularisering i en<em&gt; I Vivo</em&gt; Tissue Engineering Chamber

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and ...