Name: engineering adherent bacteria by creating a single synthetic curli operon
Uploaded: 2012-11-16T12:00:00
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Damos las gracias a los demás miembros del equipo iGEM INSA Lyon-ENS (Viviane Chansavang, Dumond Mathilde, Duprey Alexandre, Geffroy Mélanie, Gonthier Clémence, Jaulin Margaux, Haag Aurélie, Ly Goki, Poinsot Thomas, Béryl Royer-Bertrand, Soula Julie, Michael Vonzy , Pierre Yves Zundel, Soufiane Bouhmadi, Brette Olivier, Chambonnier Gaël, Izard Laura, Kroiss Aurianne, Philippe Lejeune, Rodrigue Agnès, Rondelet Arnaud, Reverchon Sylvie y Desjardin Valérie), nuestros patrocinadores por su apoyo financiero (bioMérieux, Assystem, EDF, Fundación INSA, ENS-Lyon y el Departamento de Biociencias INSA de Lyon), F. Wisniewski-Dyé para la lectura crítica de este manuscrito y el Dr. Sze CC para el regalo de la tensión. Drogue B. recibe un doctorado comunión de la Región Rhône-Alpes.

1. BioBrick Diseño y Síntesis de la Operon curli <ol><li> Determinar la organización genética y localizar las señales endógenas transcripción y la traducción de los genes curli. Estas informaciones están reunidos en bases de datos especializadas, tales como RegulonDB una o ECOGENE b y terminado por una lectura cuidadosa de las publicaciones pertinentes. Gestión de datos y en preanalítica silico se realizaron con el software Clone c Manager. </li><li> Selecc...

<ol>
	<li>O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtiter+Dish+Biofilm+Formation+Assay.">Microtiter Dish Biofilm Formation Assay.</a> J. Vis. Exp. (47), e2437 (2011).</li><li>Melamed, S., Elad, T., Belkin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+sensor+cell+arrays.">Microbial sensor cell arrays.</a> Curr. Opin. 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Biotechnol. 81, 571-578 (2008).</li><li>Olsen, A., Jonsson, A., Normark, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin+binding+mediated+by+a+novel+class+of+surface+organelles+on+Escherichia+coli.">Fibronectin binding mediated by a novel class of surface organelles on Escherichia coli.</a> Nature. 338, 652-655 (1989).</li><li>Prigent-Combaret, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+pathway+for+biofilm+formation+in+curli-producing+Escherichia+coli+strains:+role+of+flagella,+curli+and+colanic+acid.">Developmental pathway for biofilm formation in curli-producing Escherichia coli strains: role of flagella, curli and colanic acid.</a> Environ. Microbiol. 2, 450-464 (2000).</li><li>Chapman, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Escherichia+coli+curli+operons+in+directing+amyloid+fiber+formation.">Role of Escherichia coli curli operons in directing amyloid fiber formation.</a> Science. 295, 851-855 (2002).</li><li>Vidal, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+an+Escherichia+coli+K-12+mutant+strain+able+to+form+biofilms+on+inert+surfaces:+involvement+of+a+new+ompR+allele+that+increases+curli+expression.">Isolation of an Escherichia coli K-12 mutant strain able to form biofilms on inert surfaces: involvement of a new ompR allele that increases curli expression.</a> J. Bacteriol. 180, 2442-2449 (1998).</li><li>Hidalgo, G., Chen, X., Hay, A. G., Lion, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curli+produced+by+Escherichia+coli+PHL628+provide+protection+from+Hg(II).">Curli produced by Escherichia coli PHL628 provide protection from Hg(II).</a> Appl. Environ. Microbiol. 76, 6939-6941 (2010).</li><li>Garzon-Rodriguez, W., Yatsimirsky, A. K., Glabe, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+Zn(II),+Cu(II),+and+Fe(II)+ions+to+Alzheimer's+A+beta+peptide+studied+by+fluorescence.">Binding of Zn(II), Cu(II), and Fe(II) ions to Alzheimer's A beta peptide studied by fluorescence.</a> Bioorg. Med. Chem. Lett. 9, 2243-2248 (1999).</li><li>Taylor, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+resolution+insights+into+curli+fiber+biogenesis.">Atomic resolution insights into curli fiber biogenesis.</a> Structure. 19, 1307-1316 (2011).</li><li>Brombacher, E., Dorel, C., Zehnder, A. J., Landini, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+curli+biosynthesis+regulator+CsgD+co-ordinates+the+expression+of+both+positive+and+negative+determinants+for+biofilm+formation+in+Escherichia+coli.">The curli biosynthesis regulator CsgD co-ordinates the expression of both positive and negative determinants for biofilm formation in Escherichia coli.</a> Microbiology. 149, 2847-2857 (2003).</li><li>Pesavento, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inverse+regulatory+coordination+of+motility+and+curli-mediated+adhesion+in+Escherichia+coli.">Inverse regulatory coordination of motility and curli-mediated adhesion in Escherichia coli.</a> Genes Dev. 22, 2434-2446 (2008).</li><li>Dueholm, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrillation+of+the+major+curli+subunit+CsgA+under+a+wide+range+of+conditions+implies+a+robust+design+of+aggregation.">Fibrillation of the major curli subunit CsgA under a wide range of conditions implies a robust design of aggregation.</a> Biochemistry. 50, 8281-8290 (2011).</li><li>Jubelin, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CpxR/OmpR+interplay+regulates+curli+gene+expression+in+response+to+osmolarity+in+Escherichia+coli.">CpxR/OmpR interplay regulates curli gene expression in response to osmolarity in Escherichia coli.</a> J. 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Methods. 82, 64-70 (2010).</li><li>Ceri, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Calgary+Biofilm+Device:+new+technology+for+rapid+determination+of+antibiotic+susceptibilities+of+bacterial+biofilms.">The Calgary Biofilm Device: new technology for rapid determination of antibiotic susceptibilities of bacterial biofilms.</a> J. Clin. Microbiol. 37, 1771-1776 (1999).</li><li>Harrison, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+microscopy+and+three-dimensional+visualization+to+evaluate+the+structure+of+microbial+biofilms+cultivated+in+the+Calgary+Biofilm+Device.">The use of microscopy and three-dimensional visualization to evaluate the structure of microbial biofilms cultivated in the Calgary Biofilm Device.</a> Biol. Proced. 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Los pasos críticos El paso más crítico en este enfoque de la biología sintética es el diseño de genes. Diseño gen sintético tiene que ser meticuloso para asegurar una producción eficiente del sistema. Dos genes que codifican los monómeros de fibras y tres genes que codifican proteínas implicadas en su sistema de secreción han sido ensamblados con un promotor fuerte y metal-inducible para crear una nueva unidad funcional para una aplicación novedosa: la bio-descontaminación de eflu...

La adherencia bacteriana al apoyo abiótico juega un papel importante en las celdas de combustible de biorremediación, biocatálisis o microbiana. Procesos de biorremediación utilizar las capacidades de los microorganismos para degradar las sustancias orgánicas, o para modificar la distribución de metal (inmovilización, volatilización) o especiación. Estas actividades beneficiosos se observan en los ecosistemas acuáticos y terrestres, sino también en los sistemas artificiales desarrollados para tratar el agua contaminada de los residuos industriales y domésticos. La intensidad y la calidad de la de la actividad microbiana dependerá de factores físico-químicas, sino también en el estilo de vida de los microorganismos (libre flotación o incrustados en biofilm). La formación de biopelículas se asocia con un metabolismo de promover la resistencia a los biocidas por diversos mecanismos. Este fenómeno lo tanto, se recomienda en la mayoría de procesos de biorremediación. Además, la ingeniería células de Escherichia coli para controlar la formación de biopelículas se ha aplicado con éxito ainmovilizar células enteras sensores de biochips 2-3. La adaptación de los microorganismos a alta concentración de metales se produce a través de diversos mecanismos tales como la adsorción a los componentes de la matriz extracelular, la activación de la bomba de eflujo o portadores específicos capaces de concentrar el metal en la célula. Impulsar estas actividades bacterianas a través de la ingeniería genética permite el tratamiento eficaz y barato de contaminación por metales a escala de laboratorio, especialmente en el caso de metales altamente tóxicos en cantidad débil tal como se describe por Raghu et al. 2008 4. Remediación bacteriana representa en este caso un método de ahorro competitivo y rentable en comparación con los procesos químicos clásicos utilizando resinas de intercambio iónico. Los autores describen una E. chasis coli genéticamente modificada para la captación y retención de cobalto primero por la anulación de la bomba de eflujo gen que codifica RCNA, y luego por la transformación con un exceso de producción de múltiples copias de plásmido que permite unatransportador con una captación preferencial para el cobalto. Tal cepa aparece como una alternativa eficaz a resinas de intercambio iónico para el tratamiento de efluentes radiactivos, pero un problema no resuelto es la clave de recuperación de bacterias contaminadas al final del proceso 4. El objetivo de nuestro trabajo fue por lo tanto, para diseñar una cepa de diseño personalizado capaz de pegarse a soportes abióticos tales como vidrio o plástico. Entre el conjunto de adhesinas y fimbrias adherentes identificado en bacterias Gram-, se optó por diseñar un sistema que permita la producción curli. Curli son fibras amiloides delgadas (2-5 nm de diámetro) y agregación altamente que sobresalen de la E. coli y Salmonella como 5-7 superficie de una matriz no cristalina e insoluble. Curli también están involucrados en la colonización de superficies abióticas y el desarrollo de biopelículas 8. Curli se demostró recientemente que unirse a los iones de mercurio 9. Los amiloides son de hecho se sabe que poseen altoafinidad por los iones de metales tales como Cu 2 +, Zn 2 + y Fe 3 + 10. Esta propiedad podría mejorar aún más la descontaminación de metales de efluentes contaminados. El clúster csg es responsable de la producción de fibras de curli y está constituido de dos operones divergentemente transcritos (Figura 1). El CSGB, csgA y genes CSGC constituyen el operón de sentido, que codifican las dos subunidades curli, csgA y CSGB. CSGC parece estar involucrado en la actividad redox en el sistema de biogénesis curli y afectar al comportamiento CsgG poro 11. Sin embargo, la ausencia de CSGC en la mayoría de las bacterias productoras de curli indica que la proteína correspondiente proporciona sólo un nivel secundario de control sobre la biogénesis curli. Para simplificar el sistema, que han sido elegidos para trabajar con el mínimo número de genes. El csgDEFG operonencodes proteínas esenciales en la regulación y transportede csgA y CSGB a la superficie celular. CsgD es un activador transcripcional del operón csgBAC y desempeña un papel clave en el control de la formación de biopelículas mediante el control de la producción de fimbrias curli y otros componentes de la biopelícula como la celulosa y 12 por inhibición de la producción flagelo 13. CSGE, CSGF y CsgG constituyen un aparato secretor curli-específico en la membrana externa a través de la cual la mayor curli subunidad de la proteína csgA se secreta como una proteína soluble. La polimerización de csgA es dependiente in vivo en la membrana CSGB nucleador proteína (revisado en 14). Complejas vías reguladoras que involucran varios sistemas de dos componentes se han demostrado para controlar la expresión de genes curli 15-16. Estas complejas regulaciones permiten que las bacterias forman biofilms gruesas a través de la producción curli en respuesta a señales ambientales, pero son difíciles de controlar para aplicaciones industriales. Para facilitar la recuperación de la metal-rellenas bacterias durante un proceso industrial, la fijación de bacterias a un soporte sólido de hecho tiene que ser controlada por el parámetro bien definido (s). Las propiedades de adherencia de curli están vinculados a su naturaleza amiloide 17 y se podría utilizar para mejorar los procesos de biorremediación, pero un dispositivo más simple y controlado fácilmente tiene que ser creado. Entre estos 7 genes 18, un conjunto de 5 absolutamente necesario genes para la síntesis de curli (CSGB y csgA monómeros de fibra de codificación) y exportación (CSGE CSGF y csgG, que codifica el complejo de la secreción de curli) fueron seleccionados para construir el operón sintético. Para escapar de la &quot;natural&quot; regulación de curli, un operón sintético que comprende estos genes CSG 5 bajo el control de un promotor fuerte y cobalto overinducible-(Figura 2) fue diseñado y sintetizado. El análisis paso a paso de la región de codificación de curli y el procedimiento de diseño de un funcional SYNtético operón se describen. Dos métodos para visualizar y cuantificar la adherencia bacteriana al poliestireno cristal y se explican.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios (opcional) </td></tr><tr><td> pIG2 </td><td></td><td></td><td> pUC57 (ori pMB1, 2710 pb) con un 3165 pb EcoRI / PstI que contiene el fragmento sintético RCN P - csgBAEFG operón; Amp r </td></tr><tr><td> pUC18 </td><td></td><td></td><td> Plásmido multicopia (pMB1 ori, 2686 bp), Ampr </td></tr><tr><td> S23 </td><td></td><td></td><td> SSC1 (= GFP-etiquetados MG1655, regalo de CC Sze) / pIG2 </td></tr><tr><td> S24 </td><td></td><td></td><td> SSC1/pUC18 </td></tr><tr><td> CoCl 2 </td><td> Sigma </td><td></td><td> 0,1 M solución de mantenerse a temperatura ambiente </td></tr><tr><td> M63 </td><td></td><td></td><td> 29 </td&gt; </tr><tr><td> 24-así placa </td><td> Nunc </td><td> 55429 </td><td> Poliestireno de 24 pocillos </td></tr></tbody></table>

engineering adherent bacteria by creating a single synthetic curli operon

El método descrito aquí consiste en el rediseño de E. propiedades de adherencia coli mediante el ensamblaje de un número mínimo de genes curli bajo el control de un promotor fuerte y metal overinducible-, y en la visualización y cuantificación de la ganancia resultante de la adherencia bacteriana. Este método aplica los principios adecuados de ingeniería de la abstracción y la normalización de la biología sintética, y los resultados de la BioBrick BBa_K540000 (Mejor dispositivo BioBrick nuevo, creado, iGEM 2011). El primer paso consiste en el diseño del operón sintético dedicado a la sobreproducción curli en respuesta a metal, y por lo tanto, en el aumento de las capacidades de adherencia de la cepa de tipo salvaje. El original operón curli fue modificada in silico con el fin de optimizar las señales de transcripción y traducción y escapar de la &quot;natural&quot; la regulación de curli. Este enfoque permitió poner a prueba con éxito nuestra comprensión actual de la producción curli. Moreover, simplificar la regulación curli cambiando el promotor endógeno complejo (más de 10 reguladores transcripcionales identificados) a un simple metal-regulado promotor hace que la adherencia mucho más fácil de controlar. El segundo paso incluye la evaluación cualitativa y cuantitativa de las capacidades de adherencia por aplicación de métodos simples. Estos métodos son aplicables a una amplia gama de bacterias adherentes independientemente de las estructuras biológicas que participan en la formación de biopelículas. La adhesión de ensayo en placas de poliestireno de 24 pocillos proporciona una rápida visualización preliminar del biofilm bacteriano después de la tinción de cristal violeta. Esta prueba cualitativa puede ser intensificada por la cuantificación del porcentaje de adherencia. Tal método es muy simple, pero más precisa que la tinción con violeta de cristal como se describió anteriormente 1 tanto con una buena repetibilidad y reproducibilidad. Visualización de las bacterias buenas prácticas agrarias de etiquetado sobre portaobjetos de vidrio por fluorescencia o conf lásermicroscopía vecinal permite reforzar los resultados obtenidos con la prueba de la placa 24-bien por observación directa del fenómeno.

En silico anotación de la secuencia de tipo salvaje de E. csg coli K12 asociada con la optimización de las señales de transcripción y de la traducción ha permitido diseñar el único operón sintético curli P RCN-csg muestra en la Figura 3 (secuencia completa en los datos suplementarios). Protocolo 2 y 3 protocolo se utiliza para visualizar y cuantificar la adherencia asociada con la producción de curli. Uso de la tinción de cristal violeta en placas de poliestireno de...

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Engineering Adherent Bacteria by Creating a Single Synthetic Curli Operon

El diseño de un operón que codifica sintético tanto el aparato secretor y los monómeros estructurales de fibras curli se describe. La sobreproducción de estos amiloides y polímeros adherentes permite una ganancia apreciable de adhesión de la<em&gt; E. coli</em&gt; Chasis<sup&gt; 1</sup&gt;. Una manera fácil de visualizar y cuantificar la adherencia se explican.

Ingeniería bacterias adherentes mediante la creación de un único operón sintético curli

The  method described here consists in redesigning E. coli adherence properties by assembling the minimum number of  curli genes under the control of a ...

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