Name: two- and three-dimensional live cell imaging of dna damage response proteins
Uploaded: 2012-09-28T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins at JoVE.com

بدعم جزئي من وR01NS064593 R21ES016636 (KV). تم إجراء الفحص المجهري في جامعة فرجينيا كومنولث - قسم البيولوجيا العصبية ومرفق المجهر تشريح، بدعم، في جزء منه، وذلك بتمويل من المعاهد الوطنية للصحة، مركز NINDS 5P30NS047463 منحة الأساسية. تم شراء القرص الغزل مبائر المجهر مع جائزة NIH-NCRR (1S10RR027957).

A. إعداد خلية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تم الحصول على الخلايا الليفية الأولية العادية الإنسان (GM02270) من مستودع خلية Coriell، كامدن بولاية نيو جيرسي، وخلدت مع hTERT 6. كانت تزرع الخلايا وتوسعت في CellStar 6 سم الأطباق في وسائل الإعلام (4 مل)، ويتألف من ME...

<ol>
	<li>Botuyan, M. V., Lee, J., Ward, I. M., Kim, J. E., Thompson, J. R., Chen, J., Mer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+the+methylation+state-specific+recognition+of+histone+H4-K20+by+53BP1+and+Crb2+in+DNA+repair.">Structural basis for the methylation state-specific recognition of histone H4-K20 by 53BP1 and Crb2 in DNA repair.</a> Cell. 127, 1361-1373 (2006).</li><li>Dimitrova, N., Chen, Y. C., Spector, D. L., de Lange, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=53BP1+promotes+non-homologous+end+joining+of+telomeres+by+increasing+chromatin+mobility.">53BP1 promotes non-homologous end joining of telomeres by increasing chromatin mobility.</a> Nature. 456, 524-528 (2008).</li><li>Feuerhahn, S., Egly, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+to+study+DNA+repair:+what's+in+the+box.">Tools to study DNA repair: what's in the box.</a> Trends Genet. 24, 467-474 (2008).</li><li>Giunta, S., Belotserkovskaya, R., Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+signaling+in+response+to+double-strand+breaks+during+mitosis.">DNA damage signaling in response to double-strand breaks during mitosis.</a> J. Cell Biol. 190, 197-207 (2010).</li><li>Giunta, S., Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Give+me+a+break,+but+not+in+mitosis:+the+mitotic+DNA+damage+response+marks+DNA+double-strand+breaks+with+early+signaling+events.">Give me a break, but not in mitosis: the mitotic DNA damage response marks DNA double-strand breaks with early signaling events.</a> Cell Cycle. 10, 1215-1221 (2011).</li><li>Golding, S. E., Morgan, R. N., Adams, B. R., Hawkins, A. J., Povirk, L. F., Valerie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pro-survival+AKT+and+ERK+signaling+from+EGFR+and+mutant+EGFRvIII+enhances+DNA+double-strand+break+repair+in+human+glioma+cells.">Pro-survival AKT and ERK signaling from EGFR and mutant EGFRvIII enhances DNA double-strand break repair in human glioma cells.</a> Cancer Biol. Ther. 8, 730-738 (2009).</li><li>Huyen, Y., Zgheib, O., Ditullio, R. A., Gorgoulis, V. G., Zacharatos, P., Petty, T. J., Sheston, E. A., Mellert, H. S., Stavridi, E. S., Halazonetis, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methylated+lysine+79+of+histone+H3+targets+53BP1+to+DNA+double-strand+breaks.">Methylated lysine 79 of histone H3 targets 53BP1 to DNA double-strand breaks.</a> Nature. 432, 406-411 (2004).</li><li>Jackson, S. P., Bartek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DNA-damage+response+in+human+biology+and+disease.">The DNA-damage response in human biology and disease.</a> Nature. 461, 1071-1078 (2009).</li><li>Kanda, T., Sullivan, K. F., Wahl, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone-GFP+fusion+protein+enables+sensitive+analysis+of+chromosome+dynamics+in+living+mammalian+cells.">Histone-GFP fusion protein enables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammalian cells.</a> Curr. Biol. 8, 377-385 (1998).</li><li>Massignani, M., Canton, I., Sun, T., Hearnden, V., Macneil, S., Blanazs, A., Armes, S. P., Lewis, A., Battaglia, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+fluorescence+imaging+of+live+cells+by+effective+cytosolic+delivery+of+probes.">Enhanced fluorescence imaging of live cells by effective cytosolic delivery of probes.</a> PLoS One. 5, e10459 (2010).</li><li>Nakamura, K., Sakai, W., Kawamoto, T., Bree, R. T., Lowndes, N. F., Takeda, S., Taniguchi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+vertebrate+53BP1:+a+major+role+in+non-homologous+end+joining+of+DNA+double+strand+breaks.">Genetic dissection of vertebrate 53BP1: a major role in non-homologous end joining of DNA double strand breaks.</a> DNA Repair (Amst). 5, 741-749 (2006).</li><li>Schultz, L. B., Chehab, N. H., Malikzay, A., Halazonetis, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+binding+protein+1+(53BP1)+is+an+early+participant+in+the+cellular+response+to+DNA+double-strand+breaks.">p53 binding protein 1 (53BP1) is an early participant in the cellular response to DNA double-strand breaks.</a> J. Cell. Biol. 151, 1381-1390 (2000).</li><li>Valerie, K., Povirk, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+mechanisms+of+mammalian+double-strand+break+repair.">Regulation and mechanisms of mammalian double-strand break repair.</a> Oncogene. 22, 5792-5812 (2003).</li><li>Wang, B., Matsuoka, S., Carpenter, P. B., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=53BP1,+a+mediator+of+the+DNA+damage+checkpoint.">53BP1, a mediator of the DNA damage checkpoint.</a> Science. 298, 1435-1438 (2002).</li><li>Ward, I. M., Minn, K., Jorda, K. G., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accumulation+of+checkpoint+protein+53BP1+at+DNA+breaks+involves+its+binding+to+phosphorylated+histone+H2AX.">Accumulation of checkpoint protein 53BP1 at DNA breaks involves its binding to phosphorylated histone H2AX.</a> J. Biol. Chem. 278, 19579-19582 (2003).</li></ol>

الحفاظ على سلامة الجينوم هو أمر حاسم لبقاء الخلية. الفشل في الحفاظ على نتائج الجينوم في الشيخوخة المبكرة، التسرطن أو الموت، 8. هناك اهتمام كبير في كيفية عمل المميزين DDR، النابعة من أهميته للبحوث الأساسية والسريرية على حد سواء. وقد تم تطوير العديد من التقنيات على...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> نتاج </td><td> شركة </td></tr><tr><td> أطباق CellStar الثقافة </td><td> غرينر بيو واحد </td></tr><tr><td> FluroDish الأطباق الزجاجية القاع </td><td> العالم آلات دقيقة، وشركة </td></tr><tr><td> MEM وسائل الإعلام </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> غير الأحماض الأمينية الأساسية </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> الأحماض الأمينية </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> الفيتامينات </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> البيروفات الصوديوم </td><td> إينفيتروجن </td></tr><tr><td> البنسلين / الستربتوميسين </td><td> HyClone </td></tr><tr><td> المصل البقري الجنين </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> N-Myc على WT-53BP1 pLPC-بورو؛ بلازميد 19836 </td><td> Addgene </td></tr><tr><td> pCLNR-H2BG؛ البلازميد 17735 </td><td> Addgene </td></tr><tr><td> SuperFect </td><td> QIAGEN </td></tr><tr><td> زايس خلية المراقب SD نظام التصوير </td><td> زايس </td></tr><tr><td> AxioVision (الإصدار 4.8.2) </td><td> زايس </td></tr><tr><td> زايس Immersol W النفط </td><td> زايس </td></tr><tr><td> برنامج Volocity (الإصدار 6.0) </td><td> PerkinElmer </td></tr></tbody></table>

two- and three-dimensional live cell imaging of dna damage response proteins

انقر نقرا مزدوجا حبلا فواصل (DSBs) هي الأكثر ضررا آفات الحمض النووي خلية يمكن أن تواجهها. إذا تركت دون اصلاح، DSBs الميناء إمكانيات كبيرة لتوليد الطفرات والتشوهات الكروموسومية 1. لمنع هذه الصدمة من عدم الاستقرار الجيني تحفيز، لا بد للخلايا للكشف عن DSBs، تنشيط استجابة الحمض النووي من التلف (DDR)، وإصلاح الحمض النووي. عندما حفز، وDDR تعمل على الحفاظ على سلامة الجينوم عن طريق إحداث خلية للسماح اعتقال دورة للإصلاح أن يتم إجبار الخلية أو الخضوع لموت الخلايا المبرمج. الآليات السائدة لإصلاح جهاز تسوية المنازعات من خلال الانضمام تحدث في نهاية امتماثلان (NHEJ) وإعادة التركيب مثلي إصلاح (HRR) (مشاركة في 2). هناك العديد من البروتينات التي يجب أن أنشطة مدبرة بدقة لDDR بشكل صحيح. هنا، نحن تصف طريقة ل2 - و 3 الأبعاد (D) من التصور واحدة من هذه البروتينات، 53BP1. البروتين P53 ملزم 1 (53BP1) يموضع إلى مناطقDSBs عن طريق الربط بين تعديل الهستونات 3،4، وتشكيل بؤر داخل 5-15 دقائق 5. ويعتقد أن التعديلات هيستون والتوظيف من البروتينات وغيرها من DDR 53BP1 إلى مواقع DSB لتسهيل إعادة ترتيب الهيكلية للونين حول مناطق الضرر والمساهمة في إصلاح الحمض النووي 6. إلى ما بعد المشاركة المباشرة في الإصلاح، وقد وصفت أدوار إضافية ل53BP1 في DDR، مثل تنظيم داخل نقطة تفتيش تابعة لل-S، G2 نقطة تفتيش / M، وتفعيل المصب البروتينات DDR 7-9. مؤخرا، تم اكتشاف أن 53BP1 لا تشكل بؤر ردا على الحمض النووي من التلف الناجم أثناء الانقسام، والانتظار بدلا من ذلك لدخول الخلايا G1 قبل إضفاء الطابع المحلي على مقربة من DSBs 6. تم العثور على البروتينات مثل DDR 53BP1 لربط مع الهياكل الإنقسامية (مثل kinetochores) خلال التقدم من خلال الانقسام 10. ونحن في هذا البروتوكول وصف استخدام 2 - 3-D والتصوير الخلية الحية لتصورتشكيل بؤر 53BP1 ردا على وكيل camptothecin DNA الضارة (CPT)، وكذلك السلوك 53BP1 خلال الانقسام. Camptothecin هو topoisomerase I المانع الذي يسبب في المقام الأول DSBs خلال تكرار الحمض النووي. لإنجاز هذا، استخدمنا الموصوفة سابقا 53BP1-mCherry انصهار بروتين فلوري بناء يتألف من مجال البروتين 53BP1 قادرة على ربط DSBs 11. وبالإضافة إلى ذلك، استخدمنا هيستون H2B-GFP البروتين الانصهار الفلورسنت بناء قادرة على رصد ديناميات ونين في جميع أنحاء دورة الخلية ولكن بشكل خاص خلال الانقسام 12. الحية التصوير خلية في أبعاد متعددة هو أداة ممتازة لتعميق فهمنا لوظيفة البروتينات في الخلايا حقيقية النواة DDR.

Watch this Scientific Journal Video about Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins at JoVE.com

Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins

يصف هذا البروتوكول طريقة لتصور على الحمض النووي المزدوج حبلا البروتين كسر إشارة تنشيط ردا على الحمض النووي من التلف وكذلك التوطين خلال الانقسام.

عامين والتصوير الثلاثي الابعاد لايف خلية من البروتينات DNA الاستجابة الأضرار

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate ...

Research

JoVE Journal

Biology

Microfabrication of Chip-sized Scaffolds for Three-dimensional Cell cultivation

التصنيع الدقيق للرقاقة الحجم السقالات لزراعة الخلايا ثلاثي الأبعاد

Using microfabrication technologies is a prerequisite to create scaffolds of reproducible geometry and constant quality for three-dimensional cell ...

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

ثنائي الفوتون axotomy والوقت الفاصل بين التصوير مبائر يعيش في الأجنة الزرد

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

يعيش تصوير ذبابة الفاكهة السوداء البطن هجرات كرية دموية الجنينية

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

التصوير إصلاح عدم تطابق والردود الخليوي الى الحمض النووي من التلف في<emالعصوية الرقيقة></em

Both prokaryotes and eukaryotes respond to DNA damage through a complex set of physiological changes. Alterations in gene expression, the redistribution ...

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

الفلورسنت وصفها من COS - 7 تعرب عن البروتينات الانصهار SNAP - شعارا لتصوير الخلايا الحية

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

ثنائي الفوتون المستندة إلى تنشيط ضوئي في الأجنة الحية اسماك الزرد

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

يعيش التصوير من البروتينات التي تحمل علامات GFP في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; البويضات

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

نظام الثقافة الماوس الجنين الأمعاء الجامعة ل<em&gt; فيفو السابقين</em&gt; التلاعب في مسارات إشارات وتصوير لايف ثلاثي الأبعاد التنمية الزغبة

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over ...

FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels

الحنق التصوير في الهلاميات المائية ثلاثية الأبعاد

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly ...

Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

أديبو--واضحة: منديل مسح طريقة لتصوير ثلاثي الأبعاد للأنسجة الدهنية

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...