Name: two- and three-dimensional live cell imaging of dna damage response proteins
Uploaded: 2012-09-28T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins at JoVE.com

Mede ondersteund door R01NS064593 en R21ES016636 (KV). Microscopie werd uitgevoerd bij de VCU - Departement Neurobiologie en Anatomie Microscopie Facility, ondersteund, voor een deel, met financiering van NIH-NINDS Center kern subsidie ​​5P30NS047463. De draaiende schijf confocale microscoop werd aangeschaft met een NIH-NCRR award (1S10RR027957).

A. Bereiding Cell <ol><li> Normale humane primaire fibroblasten (GM02270) werden verkregen van Coriell Cell Repository, Camden, New Jersey, en geïmmortaliseerd met hTERT 6. Cellen werden gekweekt en uitgebreid CellStar 6 cm schalen in media (4 ml) bestaande uit MEM aangevuld met 20% foetaal runderserum (GIBCO), non-essential/essential aminozuren, vitaminen, natriumpyruvaat, en penicilline / streptomycine (HyClone ). </li><li> Humane embryonale nier 293 (HEK293) cellen werden verkregen van American Type Cul...

<ol>
	<li>Botuyan, M. V., Lee, J., Ward, I. M., Kim, J. E., Thompson, J. R., Chen, J., Mer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+the+methylation+state-specific+recognition+of+histone+H4-K20+by+53BP1+and+Crb2+in+DNA+repair.">Structural basis for the methylation state-specific recognition of histone H4-K20 by 53BP1 and Crb2 in DNA repair.</a> Cell. 127, 1361-1373 (2006).</li><li>Dimitrova, N., Chen, Y. C., Spector, D. L., de Lange, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=53BP1+promotes+non-homologous+end+joining+of+telomeres+by+increasing+chromatin+mobility.">53BP1 promotes non-homologous end joining of telomeres by increasing chromatin mobility.</a> Nature. 456, 524-528 (2008).</li><li>Feuerhahn, S., Egly, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+to+study+DNA+repair:+what's+in+the+box.">Tools to study DNA repair: what's in the box.</a> Trends Genet. 24, 467-474 (2008).</li><li>Giunta, S., Belotserkovskaya, R., Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+signaling+in+response+to+double-strand+breaks+during+mitosis.">DNA damage signaling in response to double-strand breaks during mitosis.</a> J. Cell Biol. 190, 197-207 (2010).</li><li>Giunta, S., Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Give+me+a+break,+but+not+in+mitosis:+the+mitotic+DNA+damage+response+marks+DNA+double-strand+breaks+with+early+signaling+events.">Give me a break, but not in mitosis: the mitotic DNA damage response marks DNA double-strand breaks with early signaling events.</a> Cell Cycle. 10, 1215-1221 (2011).</li><li>Golding, S. E., Morgan, R. N., Adams, B. R., Hawkins, A. J., Povirk, L. F., Valerie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pro-survival+AKT+and+ERK+signaling+from+EGFR+and+mutant+EGFRvIII+enhances+DNA+double-strand+break+repair+in+human+glioma+cells.">Pro-survival AKT and ERK signaling from EGFR and mutant EGFRvIII enhances DNA double-strand break repair in human glioma cells.</a> Cancer Biol. Ther. 8, 730-738 (2009).</li><li>Huyen, Y., Zgheib, O., Ditullio, R. A., Gorgoulis, V. G., Zacharatos, P., Petty, T. J., Sheston, E. A., Mellert, H. S., Stavridi, E. S., Halazonetis, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methylated+lysine+79+of+histone+H3+targets+53BP1+to+DNA+double-strand+breaks.">Methylated lysine 79 of histone H3 targets 53BP1 to DNA double-strand breaks.</a> Nature. 432, 406-411 (2004).</li><li>Jackson, S. P., Bartek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DNA-damage+response+in+human+biology+and+disease.">The DNA-damage response in human biology and disease.</a> Nature. 461, 1071-1078 (2009).</li><li>Kanda, T., Sullivan, K. F., Wahl, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone-GFP+fusion+protein+enables+sensitive+analysis+of+chromosome+dynamics+in+living+mammalian+cells.">Histone-GFP fusion protein enables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammalian cells.</a> Curr. Biol. 8, 377-385 (1998).</li><li>Massignani, M., Canton, I., Sun, T., Hearnden, V., Macneil, S., Blanazs, A., Armes, S. P., Lewis, A., Battaglia, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+fluorescence+imaging+of+live+cells+by+effective+cytosolic+delivery+of+probes.">Enhanced fluorescence imaging of live cells by effective cytosolic delivery of probes.</a> PLoS One. 5, e10459 (2010).</li><li>Nakamura, K., Sakai, W., Kawamoto, T., Bree, R. T., Lowndes, N. F., Takeda, S., Taniguchi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+vertebrate+53BP1:+a+major+role+in+non-homologous+end+joining+of+DNA+double+strand+breaks.">Genetic dissection of vertebrate 53BP1: a major role in non-homologous end joining of DNA double strand breaks.</a> DNA Repair (Amst). 5, 741-749 (2006).</li><li>Schultz, L. B., Chehab, N. H., Malikzay, A., Halazonetis, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+binding+protein+1+(53BP1)+is+an+early+participant+in+the+cellular+response+to+DNA+double-strand+breaks.">p53 binding protein 1 (53BP1) is an early participant in the cellular response to DNA double-strand breaks.</a> J. Cell. Biol. 151, 1381-1390 (2000).</li><li>Valerie, K., Povirk, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+mechanisms+of+mammalian+double-strand+break+repair.">Regulation and mechanisms of mammalian double-strand break repair.</a> Oncogene. 22, 5792-5812 (2003).</li><li>Wang, B., Matsuoka, S., Carpenter, P. B., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=53BP1,+a+mediator+of+the+DNA+damage+checkpoint.">53BP1, a mediator of the DNA damage checkpoint.</a> Science. 298, 1435-1438 (2002).</li><li>Ward, I. M., Minn, K., Jorda, K. G., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accumulation+of+checkpoint+protein+53BP1+at+DNA+breaks+involves+its+binding+to+phosphorylated+histone+H2AX.">Accumulation of checkpoint protein 53BP1 at DNA breaks involves its binding to phosphorylated histone H2AX.</a> J. Biol. Chem. 278, 19579-19582 (2003).</li></ol>

Onderhoud van genomische integriteit is cruciaal voor overleving van de cel. Als de genoom resultaten te bewaren in vroegtijdige veroudering, kanker, of de dood 8. Er is grote belangstelling in het onderscheiden van de manier waarop de DDR functies, als gevolg van het belang ervan voor zowel fundamenteel als klinisch onderzoek. Vele technieken zijn ontwikkeld de afgelopen jaren om te helpen bij het bestuderen van cellen te detecteren en repareren DNA schade. Traditionele methoden zoals immunocytochemie en wes...

<table border="1"><tbody><tr><td> Product </td><td> Vennootschap </td></tr><tr><td> CellStar cultuur gerechten </td><td> Greiner Bio-One </td></tr><tr><td> FluroDish glazen bodem gerechten </td><td> Wereld Precision Instruments, Inc </td></tr><tr><td> MEM media </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> Niet-essentiële aminozuren </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> Aminozuren </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> Vitaminen </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> Natriumpyruvaat </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td> Penicilline / streptomycine </td><td> HyClone </td></tr><tr><td> Fetal Bovine Serum </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> N-Myc-53BP1 WT PLPC-Puro; plasmide 19836 </td><td> Addgene </td></tr><tr><td> pCLNR-H2BG; plasmide 17735 </td><td> Addgene </td></tr><tr><td> SuperFect </td><td> Qiagen </td></tr><tr><td> Zeiss Cell Observer SD imaging systeem </td><td> Zeiss </td></tr><tr><td> AxioVision (release 4.8.2) </td><td> Zeiss </td></tr><tr><td> Zeiss Immersol W Olie </td><td> Zeiss </td></tr><tr><td> Volocity software (versie 6.0) </td><td> PerkinElmer </td></tr></tbody></table>

two- and three-dimensional live cell imaging of dna damage response proteins

Dubbel-breuken (DSB&#39;s) zijn de meest schadelijke DNA laesies een cel tegenkomt kan. Als gerepareerd wordt aan DSB haven een groot potentieel genereren mutaties en chromosomale afwijkingen 1. Om dit trauma te voorkomen katalyseren genomische instabiliteit, is het cruciaal voor de cellen om DSB&#39;s te detecteren, activeert u de DNA schade respons (DDR), en herstellen het DNA. Wanneer gestimuleerd, de DDR werkt om genomische integriteit te bewaren door het triggeren van de celcyclus te laten voor reparatie te laten plaatsvinden of dwingen de cel om apoptose te ondergaan. De overheersende mechanismen van DSB reparatie plaatsvinden via niet-homologe end-joining (NHEJ) en homologe recombinatie reparatie (HRR) (beoordeeld in 2). Er zijn veel eiwitten waarvan de activiteiten moet nauwkeurig worden georkestreerd voor de DDR om goed te functioneren. Hierin beschrijven we een werkwijze voor 2 - en 3-dimensionale (D) visualisatie van een van deze eiwitten, 53BP1. De p53-binding protein 1 (53BP1) gelokaliseerd op gebieden vanDSB&#39;s door te binden aan gemodificeerde histonen 3,4, die foci binnen 5-15 minuten 5. De histon modificaties en werving van 53BP1 en andere DDR eiwitten aan DSB sites worden verondersteld om de structurele herschikking van chromatine te vergemakkelijken rond gebieden van schade en om DNA herstel 6 bijdragen. Naast directe participatie in reparatie zijn aanvullende rollen zijn beschreven voor 53BP1 in de DDR, zoals de regeling van een intra-S checkpoint, een G2 / M checkpoint, en het activeren van stroomafwaarts DDR eiwitten 7-9. Onlangs werd ontdekt dat 53BP1 geen foci in reactie op DNA schade geïnduceerd tijdens mitose, maar wachten cellen G1 voeren voordat lokaliseren naar de omgeving van DSB 6. DDR eiwitten zoals 53BP1 zijn gevonden met mitotische structuren (zoals kinetochoren) betrekken bij het ​​doorlopen van mitose 10. In dit protocol beschrijven we het gebruik van 2 - en 3-D beeldvorming van levende cellen te visualiserende vorming van 53BP1 foci in reactie op de DNA beschadigende middel camptothecine (CPT), alsmede 53BP1 gedrag tijdens mitose. Camptothecine is een topoisomerase-I-remmer die voornamelijk DSB veroorzaakt tijdens DNA replicatie. Hiervoor hebben we een eerder beschreven 53BP1-mCherry fluorescent eiwit constructie bestaande uit een 53BP1 eiwitdomein kunnen DSB 11 binden. Daarnaast gebruikten we een histon H2B-GFP fusie-eiwit construct fluorescent kunnen chromatine dynamiek tijdens de gehele celcyclus maar vooral tijdens mitose 12. Live cell imaging in meerdere dimensies is een uitstekend hulpmiddel om ons begrip van de functie van DDR eiwitten in eukaryotische cellen te verdiepen.

Watch this Scientific Journal Video about Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins at JoVE.com

Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins

Dit protocol beschrijft een werkwijze voor het visualiseren van een DNA dubbelstrengs breuken signaleringeiwit geactiveerd in reactie op DNA schade en de lokalisatie tijdens mitose.

Twee-en drie-dimensionale live cell imaging van DNA schade respons Eiwitten

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate ...

Research

JoVE Journal

Biology

Microfabrication of Chip-sized Scaffolds for Three-dimensional Cell cultivation

Microfabricage van Chip-en kleinbedrijf Stellingen voor drie-dimensionale celkweek

Using microfabrication technologies is a prerequisite to create scaffolds of reproducible geometry and constant quality for three-dimensional cell ...

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Twee-foton axotomy en time-lapse confocale imaging in levende zebravis embryo&#39;s

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Live-beeldvorming van Drosophila melanogaster Embryonale Hemocyte Migraties

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

Imaging mismatch repair en cellulaire reacties op DNA-schade in Bacillus subtilis</em

Both prokaryotes and eukaryotes respond to DNA damage through a complex set of physiological changes. Alterations in gene expression, the redistribution ...

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

Fluorescerende Labeling van COS-7 tot expressie SNAP-tag fusieproteïnen voor live cell imaging

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Twee-foton-Based Fotoactivatie in de Live zebravis embryo&#39;s

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

Imaging leven van GFP-gemerkte eiwitten in<em&gt; Drosophila</em&gt; Eicellen

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Muis Foetale Hele Darm Cultuur System voor<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Manipulatie van signaalwegen en Driedimensionale Live-Imaging van Villus Development

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over ...

FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels

FRET Imaging in Driedimensionale Hydrogels

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly ...

Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

Adipo-Clear: Een weefsel Clearing methode voor driedimensionale beeldvorming van vetweefsel

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...