Name: two- and three-dimensional live cell imaging of dna damage response proteins
Uploaded: 2012-09-28T12:00:00
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Unterstützte teilweise durch R01NS064593 und R21ES016636 (KV). Mikroskopie wurde an der VCU durchgeführt - Department für Neurobiologie und Anatomie Microscopy Facility, unterstützt, zum Teil mit Mitteln aus NIH-NINDS zentralen Kern Gewährung 5P30NS047463. Das Spinning Disc konfokalen Mikroskop wurde mit einem NIH-NCRR award (1S10RR027957) erworben.

A. Cell Preparation <ol><li> Normale menschliche Fibroblasten (GM02270) wurden aus Coriell Zelle Repository, Camden, New Jersey, erhalten und verewigte mit hTERT 6. Die Zellen wurden gezüchtet und in CellStar expandiert 6-cm-Schalen in Medien (4 ml) bestehend aus MEM mit 20% fötalem Rinderserum (GIBCO), non-essential/essential Aminosäuren, Vitamine, Natriumpyruvat, und Penicillin / Streptomycin (HyClone ergänzt ). </li><li> Menschliche embryonale Nieren-293 (HEK293) Zellen wurden von American Type Cultu...

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	<li>Botuyan, M. V., Lee, J., Ward, I. M., Kim, J. E., Thompson, J. R., Chen, J., Mer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+the+methylation+state-specific+recognition+of+histone+H4-K20+by+53BP1+and+Crb2+in+DNA+repair.">Structural basis for the methylation state-specific recognition of histone H4-K20 by 53BP1 and Crb2 in DNA repair.</a> Cell. 127, 1361-1373 (2006).</li><li>Dimitrova, N., Chen, Y. C., Spector, D. L., de Lange, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=53BP1+promotes+non-homologous+end+joining+of+telomeres+by+increasing+chromatin+mobility.">53BP1 promotes non-homologous end joining of telomeres by increasing chromatin mobility.</a> Nature. 456, 524-528 (2008).</li><li>Feuerhahn, S., Egly, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+to+study+DNA+repair:+what's+in+the+box.">Tools to study DNA repair: what's in the box.</a> Trends Genet. 24, 467-474 (2008).</li><li>Giunta, S., Belotserkovskaya, R., Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+signaling+in+response+to+double-strand+breaks+during+mitosis.">DNA damage signaling in response to double-strand breaks during mitosis.</a> J. Cell Biol. 190, 197-207 (2010).</li><li>Giunta, S., Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Give+me+a+break,+but+not+in+mitosis:+the+mitotic+DNA+damage+response+marks+DNA+double-strand+breaks+with+early+signaling+events.">Give me a break, but not in mitosis: the mitotic DNA damage response marks DNA double-strand breaks with early signaling events.</a> Cell Cycle. 10, 1215-1221 (2011).</li><li>Golding, S. E., Morgan, R. N., Adams, B. R., Hawkins, A. J., Povirk, L. F., Valerie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pro-survival+AKT+and+ERK+signaling+from+EGFR+and+mutant+EGFRvIII+enhances+DNA+double-strand+break+repair+in+human+glioma+cells.">Pro-survival AKT and ERK signaling from EGFR and mutant EGFRvIII enhances DNA double-strand break repair in human glioma cells.</a> Cancer Biol. Ther. 8, 730-738 (2009).</li><li>Huyen, Y., Zgheib, O., Ditullio, R. A., Gorgoulis, V. G., Zacharatos, P., Petty, T. J., Sheston, E. A., Mellert, H. S., Stavridi, E. S., Halazonetis, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methylated+lysine+79+of+histone+H3+targets+53BP1+to+DNA+double-strand+breaks.">Methylated lysine 79 of histone H3 targets 53BP1 to DNA double-strand breaks.</a> Nature. 432, 406-411 (2004).</li><li>Jackson, S. P., Bartek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DNA-damage+response+in+human+biology+and+disease.">The DNA-damage response in human biology and disease.</a> Nature. 461, 1071-1078 (2009).</li><li>Kanda, T., Sullivan, K. F., Wahl, G. 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F., Takeda, S., Taniguchi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+vertebrate+53BP1:+a+major+role+in+non-homologous+end+joining+of+DNA+double+strand+breaks.">Genetic dissection of vertebrate 53BP1: a major role in non-homologous end joining of DNA double strand breaks.</a> DNA Repair (Amst). 5, 741-749 (2006).</li><li>Schultz, L. B., Chehab, N. H., Malikzay, A., Halazonetis, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+binding+protein+1+(53BP1)+is+an+early+participant+in+the+cellular+response+to+DNA+double-strand+breaks.">p53 binding protein 1 (53BP1) is an early participant in the cellular response to DNA double-strand breaks.</a> J. Cell. Biol. 151, 1381-1390 (2000).</li><li>Valerie, K., Povirk, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+mechanisms+of+mammalian+double-strand+break+repair.">Regulation and mechanisms of mammalian double-strand break repair.</a> Oncogene. 22, 5792-5812 (2003).</li><li>Wang, B., Matsuoka, S., Carpenter, P. B., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=53BP1,+a+mediator+of+the+DNA+damage+checkpoint.">53BP1, a mediator of the DNA damage checkpoint.</a> Science. 298, 1435-1438 (2002).</li><li>Ward, I. M., Minn, K., Jorda, K. G., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accumulation+of+checkpoint+protein+53BP1+at+DNA+breaks+involves+its+binding+to+phosphorylated+histone+H2AX.">Accumulation of checkpoint protein 53BP1 at DNA breaks involves its binding to phosphorylated histone H2AX.</a> J. Biol. Chem. 278, 19579-19582 (2003).</li></ol>

Aufrechterhaltung der genomischen Integrität ist entscheidend für das Überleben der Zelle. Die Nichtbeachtung der Genom führt zu vorzeitigem Altern, Karzinogenese oder Tod 8 erhalten. Es gibt intensive Interesse an anspruchsvollen, wie die DDR-Funktionen, die sich aus ihrer Bedeutung sowohl Grundlagen-und klinischen Forschung. Viele Techniken wurden im Laufe der Jahre entwickelt, um bei der Untersuchung, wie Zellen erkennen und zu reparieren DNA-Schädigung zu unterstützen. Traditionelle Methoden wie Imm...

<table border="1"><tbody><tr><td> Produkt </td><td> Firma </td></tr><tr><td> CellStar Kulturschalen </td><td> Greiner Bio-One </td></tr><tr><td> FluroDish Glasboden Gerichten </td><td> World Precision Instruments, Inc. </td></tr><tr><td> MEM-Medien </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> Nicht-essentielle Aminosäuren </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> Aminosäuren </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> Vitamine </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> Natriumpyruvat </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td> Penicillin / Streptomycin </td><td> HyClone </td></tr><tr><td> Fötales Rinderserum </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> N-Myc-53BP1 WT pLPC-Puro; Plasmid 19836 </td><td> Addgene </td></tr><tr><td> PCLNR-H2BG; Plasmid 17735 </td><td> Addgene </td></tr><tr><td> SuperFect </td><td> Qiagen </td></tr><tr><td> Zeiss Cell Observer SD Imaging Systems </td><td> Zeiss </td></tr><tr><td> AxioVision (Release 4.8.2) </td><td> Zeiss </td></tr><tr><td> Zeiss Immersol W Oil </td><td> Zeiss </td></tr><tr><td> Volocity Software (Version 6,0) </td><td> PerkinElmer </td></tr></tbody></table>

two- and three-dimensional live cell imaging of dna damage response proteins

Doppelstrangbrüche (DSB) sind die meisten schädlichen DNA-Läsionen eine Zelle begegnen kann. Wenn links unrepariert, um DSBs Hafen ein großes Potenzial zu generieren Mutationen und chromosomalen Aberrationen 1. Um dieses Trauma Katalysieren genomische Instabilität zu verhindern, ist es von entscheidender Bedeutung, damit Zellen DSBs detektieren, die DNA-Schäden Reaktion (DDR) zu aktivieren, und die Reparatur der DNA. Wenn angeregt, arbeitet der DDR zur genomischen Integrität durch das Auslösen des Zellzyklus zu ermöglichen für die Reparatur stattfinden oder zwingen die Zelle zur Apoptose bewahren. Die vorherrschenden Mechanismen der DSB-Reparatur entstehen durch homologe end-joining (NHEJ) und homologe Rekombination Reparatur (HRR) (bewertet in 2). Es gibt viele Proteine, deren Tätigkeiten müssen genau orchestriert werden für die DDR, um richtig funktionieren. Hier beschreiben wir ein Verfahren für 2 - und 3-dimensionale (D) Visualisierung von einem dieser Proteine, 53BP1. Das p53-bindendes Protein 1 (53BP1) lokalisiert BereichenDSBs durch Bindung an modifizierten Histonen 3,4 bilden Schwerpunkte innerhalb von 5-15 Minuten 5. Die Histon-Modifikationen und Rekrutierung von 53BP1 und andere DDR Proteine ​​DSB Seiten werden geglaubt, um die strukturelle Neuordnung der Chromatin um Bereiche des Schadens erleichtern und dazu beitragen, DNA-Reparatur 6. Über die direkte Beteiligung der Reparatur wurden zusätzliche Rollen für 53BP1 worden in der DDR beschrieben, wie die Regulierung eines Intra-S Kontrollpunkt, einen G2 / M Kontrollpunkt, und Aktivieren stromabwärts DDR Proteine ​​7-9. Vor kurzem wurde entdeckt, dass 53BP1 bildet keine Foci in Reaktion auf DNA-Schäden während der Mitose induziert, anstatt abzuwarten, bevor Zellen G1 Lokalisierung zu der Nähe DSBs 6 einzugeben. DDR Proteine ​​wie 53BP1 haben sich mit mitotischen Strukturen (wie Kinetochoren) während der Progression durch Mitose 10 zuzuordnen. In diesem Protokoll beschreiben wir die Verwendung von 2 - und 3-D Live Cell Imaging zu visualisierendie Bildung von 53BP1 Foci in Reaktion auf das DNA-schädigende Mittel Camptothecin (CPT) sowie das Verhalten 53BP1 während der Mitose. Camptothecin ist ein Topoisomerase-I-Inhibitor, der in erster Linie verursacht DSBs während der DNA-Replikation. Um dies zu erreichen, haben wir eine bisher beschriebenen 53BP1-mCherry fluoreszierende Fusionsprotein zu konstruieren, bestehend aus einem 53BP1 Proteindomäne können DSBs 11 binden. Darüber hinaus haben wir ein Histon H2B-GFP fluoreszierende Fusionsprotein zu konstruieren können Chromatin Dynamik während des Zellzyklus, insbesondere aber zu überwachen während der Mitose 12. Live Cell Imaging in mehreren Dimensionen ist ein hervorragendes Werkzeug, um unser Verständnis der Funktion der DDR Proteine ​​in eukaryotischen Zellen zu vertiefen.

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Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Visualisierung eines DNA Doppelstrangbruch Signalprotein als Reaktion auf DNA-Schäden sowie seine Lokalisierung während der Mitose aktiviert.

Zwei-und dreidimensionale Live Cell Imaging der DNA-Reparatur-Proteine

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate ...

Research

JoVE Journal

Biology

Microfabrication of Chip-sized Scaffolds for Three-dimensional Cell cultivation

Microfabrication der Chip-Größe Gerüste für die dreidimensionale Kultivierung der Zellen

Using microfabrication technologies is a prerequisite to create scaffolds of reproducible geometry and constant quality for three-dimensional cell ...

Forschung

Biologie

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Zwei-Photonen-Axotomie und Zeitraffer-konfokale Bildgebung in lebenden Zebrafisch-Embryonen

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Live-Bildgebung Drosophila melanogaster Embryonale Hemocyte Migrationen

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

Imaging Mismatch Reparatur und zellulären Reaktionen auf DNA-Schäden in Bacillus subtilis</em

Both prokaryotes and eukaryotes respond to DNA damage through a complex set of physiological changes. Alterations in gene expression, the redistribution ...

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

Fluoreszenzmarkierung von COS-7 mit dem Ausdruck SNAP-tag-Fusionsproteinen für das Live Cell Imaging

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Zwei-Photonen-Based Photoaktivierung in Live Zebrafischembryonen

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

Live-Imaging von GFP-markierten Proteine ​​in<em&gt; Drosophila</em&gt; Oozyten

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Maus Fetal ganze Darm-System für Kultur<em&gt; Ex-vivo-</em&gt; Manipulation von Signalwegen und dreidimensionale Live-Imaging von Zotte Entwicklung

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over ...

FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels

FRET-Imaging im dreidimensionalen Hydrogelen

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly ...

Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

Adipo-Clear: Ein Gewebe Clearing-Methode für die dreidimensionale Darstellung von Fettgewebe

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...