Name: two- and three-dimensional live cell imaging of dna damage response proteins
Uploaded: 2012-09-28T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins at JoVE.com

נתמך בחלקו על ידי R01NS064593 וR21ES016636 (KV). מיקרוסקופי בוצע בVCU - מחלקה לנוירוביולוגיה מתקן מיקרוסקופי ואנטומיה, נתמך, בין השאר, במימון ה-NIH NINDS מרכז ליבת מענק 5P30NS047463. Confocal מיקרוסקופ הדיסק מסתובב נקנה בפרס ה-NIH NCRR (1S10RR027957).

הכנת תא א <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> fibroblasts העיקרי אדם נורמלי (GM02270) התקבלו ממאגר Coriell סלולרי, קמדן, ניו ג&#39;רזי, והונצח עם 6 hTERT. תאים גדלו והתרחבו בCellStar מנות 6-סנטימטר בתקשורת (4 מ&quot;ל) בהיקף של MEM בתוספת 20% בסרום עוברי שור (GIBCO), חומצות אמינו non-ess...

<ol>
	<li>Botuyan, M. V., Lee, J., Ward, I. M., Kim, J. E., Thompson, J. R., Chen, J., Mer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+the+methylation+state-specific+recognition+of+histone+H4-K20+by+53BP1+and+Crb2+in+DNA+repair.">Structural basis for the methylation state-specific recognition of histone H4-K20 by 53BP1 and Crb2 in DNA repair.</a> Cell. 127, 1361-1373 (2006).</li><li>Dimitrova, N., Chen, Y. C., Spector, D. L., de Lange, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=53BP1+promotes+non-homologous+end+joining+of+telomeres+by+increasing+chromatin+mobility.">53BP1 promotes non-homologous end joining of telomeres by increasing chromatin mobility.</a> Nature. 456, 524-528 (2008).</li><li>Feuerhahn, S., Egly, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+to+study+DNA+repair:+what's+in+the+box.">Tools to study DNA repair: what's in the box.</a> Trends Genet. 24, 467-474 (2008).</li><li>Giunta, S., Belotserkovskaya, R., Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+signaling+in+response+to+double-strand+breaks+during+mitosis.">DNA damage signaling in response to double-strand breaks during mitosis.</a> J. Cell Biol. 190, 197-207 (2010).</li><li>Giunta, S., Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Give+me+a+break,+but+not+in+mitosis:+the+mitotic+DNA+damage+response+marks+DNA+double-strand+breaks+with+early+signaling+events.">Give me a break, but not in mitosis: the mitotic DNA damage response marks DNA double-strand breaks with early signaling events.</a> Cell Cycle. 10, 1215-1221 (2011).</li><li>Golding, S. E., Morgan, R. N., Adams, B. R., Hawkins, A. J., Povirk, L. F., Valerie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pro-survival+AKT+and+ERK+signaling+from+EGFR+and+mutant+EGFRvIII+enhances+DNA+double-strand+break+repair+in+human+glioma+cells.">Pro-survival AKT and ERK signaling from EGFR and mutant EGFRvIII enhances DNA double-strand break repair in human glioma cells.</a> Cancer Biol. Ther. 8, 730-738 (2009).</li><li>Huyen, Y., Zgheib, O., Ditullio, R. A., Gorgoulis, V. G., Zacharatos, P., Petty, T. J., Sheston, E. A., Mellert, H. S., Stavridi, E. S., Halazonetis, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methylated+lysine+79+of+histone+H3+targets+53BP1+to+DNA+double-strand+breaks.">Methylated lysine 79 of histone H3 targets 53BP1 to DNA double-strand breaks.</a> Nature. 432, 406-411 (2004).</li><li>Jackson, S. P., Bartek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DNA-damage+response+in+human+biology+and+disease.">The DNA-damage response in human biology and disease.</a> Nature. 461, 1071-1078 (2009).</li><li>Kanda, T., Sullivan, K. F., Wahl, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone-GFP+fusion+protein+enables+sensitive+analysis+of+chromosome+dynamics+in+living+mammalian+cells.">Histone-GFP fusion protein enables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammalian cells.</a> Curr. Biol. 8, 377-385 (1998).</li><li>Massignani, M., Canton, I., Sun, T., Hearnden, V., Macneil, S., Blanazs, A., Armes, S. P., Lewis, A., Battaglia, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+fluorescence+imaging+of+live+cells+by+effective+cytosolic+delivery+of+probes.">Enhanced fluorescence imaging of live cells by effective cytosolic delivery of probes.</a> PLoS One. 5, e10459 (2010).</li><li>Nakamura, K., Sakai, W., Kawamoto, T., Bree, R. T., Lowndes, N. F., Takeda, S., Taniguchi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+vertebrate+53BP1:+a+major+role+in+non-homologous+end+joining+of+DNA+double+strand+breaks.">Genetic dissection of vertebrate 53BP1: a major role in non-homologous end joining of DNA double strand breaks.</a> DNA Repair (Amst). 5, 741-749 (2006).</li><li>Schultz, L. B., Chehab, N. H., Malikzay, A., Halazonetis, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+binding+protein+1+(53BP1)+is+an+early+participant+in+the+cellular+response+to+DNA+double-strand+breaks.">p53 binding protein 1 (53BP1) is an early participant in the cellular response to DNA double-strand breaks.</a> J. Cell. Biol. 151, 1381-1390 (2000).</li><li>Valerie, K., Povirk, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+mechanisms+of+mammalian+double-strand+break+repair.">Regulation and mechanisms of mammalian double-strand break repair.</a> Oncogene. 22, 5792-5812 (2003).</li><li>Wang, B., Matsuoka, S., Carpenter, P. B., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=53BP1,+a+mediator+of+the+DNA+damage+checkpoint.">53BP1, a mediator of the DNA damage checkpoint.</a> Science. 298, 1435-1438 (2002).</li><li>Ward, I. M., Minn, K., Jorda, K. G., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accumulation+of+checkpoint+protein+53BP1+at+DNA+breaks+involves+its+binding+to+phosphorylated+histone+H2AX.">Accumulation of checkpoint protein 53BP1 at DNA breaks involves its binding to phosphorylated histone H2AX.</a> J. Biol. Chem. 278, 19579-19582 (2003).</li></ol>

שמירה על שלמות גנטית היא חיונית להישרדות תא. כישלון כדי לשמר את התוצאות הגנום במוקדם, היווצרות הסרטן, הזדקנות או מות 8. יש עניין רב בהבחנה כמה פונקציות DDR, נובעות מחשיבותו למחקר בסיסי וקליני. טכניקות רבות פותחו במשך השנים כדי לסייע במחקר של כמה תאים לזהות ולתקן ני...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מוצר </td><td> חברה </td></tr><tr><td> מנות תרבות CellStar </td><td> גריינר ביו אחד </td></tr><tr><td> מנות תחתית זכוכית FluroDish </td><td> עולם מכשירי דיוק, Inc </td></tr><tr><td> MEM תקשורת </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> חומצות אמינו לא חיוניות </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> חומצות אמינו </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> ויטמינים </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> פירובט נתרן </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td> פניצילין / סטרפטומיצין </td><td> HyClone </td></tr><tr><td> סרום שור עוברי </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> N-Myc-WT 53BP1 pLPC-Puro; 19836 פלסמיד </td><td> Addgene </td></tr><tr><td> pCLNR-H2BG; 17735 פלסמיד </td><td> Addgene </td></tr><tr><td> SuperFect </td><td> Qiagen </td></tr><tr><td> Zeiss סלולרי אובזרוור SD הדמית המערכת </td><td> Zeiss </td></tr><tr><td> AxioVision (מהדורה 4.8.2) </td><td> Zeiss </td></tr><tr><td> Zeiss Immersol W שמן </td><td> Zeiss </td></tr><tr><td> תוכנת Volocity (גרסה 6.0) </td><td> PerkinElmer </td></tr></tbody></table>

two- and three-dimensional live cell imaging of dna damage response proteins

הפסקות כפולות גדיל (DSBs) הן DNA המזיק ביותר נגעי תא יכול להיתקל. אם יצא שלא תוקן, פוטנציאל גדול DSBs נמל לייצר מוטציות וליקויים כרומוזומליים 1. כדי למנוע הטראומה הזאת מcatalyzing חוסר יציבות גנומית, זה קריטי לתאים כדי לזהות DSBs, להפעיל את תגובת הניזק לדנ&quot;א (DDR), ולתקן את ה-DNA. כאשר מגורה, DDR עובד כדי לשמור על שלמות גנטית על ידי מפעילת עצירת מחזור תא כדי לאפשר תיקון להתקיים או לאלץ את התא כדי לעבור אפופטוזיס. המנגנונים הבולטים של תיקון DSB מתרחשים דרך nonhomologous הסוף מצטרף-(NHEJ) וההומולוגי רקומבינציה תיקון (הרר) (שנסקר ב2). יש חלבונים רבים שפעילות חייבת להיות דווקא מתוזמרת לDDR כדי לתפקד כראוי. בזאת, אנו מתארים שיטה ל2 - ויזואליזציה 3-ממדית (ד &#39;) של אחד מהחלבונים האלה, 53BP1. חלבון p53 מחייב 1 (53BP1) localizes לתחומיםDSBs על ידי הקשירה לההיסטונים שונים 3,4, ויצר מוקדים בתוך 5-15 דקות 5. השינויים והגיוס של חלבוני היסטון 53BP1 ואחרים DDR לאתרי DSB הם האמינו כדי להקל על ההתארגנות המבנית של הכרומטין סביב אזורים של ניזק ולתרום לתיקון דנ&quot;א 6. מעבר להשתתפות ישירה בתיקון, תפקידים נוספים כבר תאר ל53BP1 בDDR, כגון הסדרת מחסום S תוך, מחסום G2 / M, והפעלת DDR חלבונים במורד זרם 7-9. לאחרונה, התגלה כי 53BP1 אינו מהווה מוקדים בתגובה לניזקי DNA הנגרמים במהלך מיטוזה, במקום לחכות לתאים להיכנס G1 לפני localizing לסביבה של 6 DSBs. חלבוני DDR כגון 53BP1 נמצאו לקשר עם מבני mitotic (כגון kinetochores) במהלך ההתקדמות במיטוזה 10. בפרוטוקול זה אנו מתארים את השימוש של 2 ו - 3-D הדמיה חייה תא לדמייןהיווצרות 53BP1 המוקדים בתגובה לדנ&quot;א סוכן camptothecin המזיק (CPT), כמו גם התנהגותו של 53BP1 במהלך מיטוזה. Camptothecin הוא topoisomerase אני מעכב שבעיקר גורם DSBs במהלך שכפול הדנ&quot;א. כדי להשיג זאת, השתמש חלבון היתוך ניאון תואר קודם 53BP1-mCherry לבנות מורכב מחלבון תחום 53BP1 מסוגלת להיקשר 11 DSBs. בנוסף, השתמש חלבון היתוך ניאון היסטון H2B-GFP לבנות מסוגל לפקח דינמיקת הכרומטין לאורך מחזור התא אך בפרט במהלך 12 מיטוזה. הדמית תא חייה בממדים רבים היא כלי מצוין להבנה מעמיקה יותר של התפקוד של חלבונים בתאי DDR האיקריוטים.

Watch this Scientific Journal Video about Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins at JoVE.com

Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins

פרוטוקול זה מתאר שיטה להמחשת DNA חלבון איתות הפסקה כפולת גדיל הופעל בתגובה לניזק לדנ&quot;א, כמו גם הלוקליזציה שלה במהלך מיטוזה.

שתי והדמית תא חייה תלת ממדית של חלבוני תגובת ניזק לדנ&quot;א

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate ...

Research

JoVE Journal

Biology

Microfabrication of Chip-sized Scaffolds for Three-dimensional Cell cultivation

Microfabrication של שבב בגודל פיגומים לעיבוד תלת ממדי נייד

Using microfabrication technologies is a prerequisite to create scaffolds of reproducible geometry and constant quality for three-dimensional cell ...

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

שני הפוטונים axotomy ואת זמן לשגות הדמיה confocal עוברי דג הזברה לחיות

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

הדמיה חיה של תסיסנית melanogaster Hemocyte נדידות עובריים

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

הדמיה תיקון Mismatch ותגובות נייד נזק לדנ&quot;א Bacillus subtilis</em

Both prokaryotes and eukaryotes respond to DNA damage through a complex set of physiological changes. Alterations in gene expression, the redistribution ...

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

תיוג פלורסנט של COS-7-SNAP הבעת תג חלבונים Fusion עבור דימות תא חי

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

שני הפוטונים מבוסס Photoactivation עוברי דג הזברה לחיות

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

חי הדמיה של חלבוני ה-GFP שהכותרת ב-<em&gt; דרוזופילה</em&gt; ביציות

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

מערכת תרבות עכבר העוברי שלם מעי ל<em&gt; Ex Vivo</em&gt; מניפולציה של מסלולי איתות והדמית חיה תלת ממדית של פיתוח שליה

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over ...

FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels

סריג הדמיה ב הידרוג תלת ממדי

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly ...

Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

Adipo-ברור: רקמה ניקוי שיטה עבור הדמיה תלת-ממדית של רקמת שומן

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...