Name: two- and three-dimensional live cell imaging of dna damage response proteins
Uploaded: 2012-09-28T12:00:00
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R01NS064593とR21ES016636（KV）によって部分的にサポートされています。顕微鏡はVCUで行われました - 神経生物学、解剖学顕微鏡ファシリティ省、NIH NINDSセンターコアグラント5P30NS047463の資金援助で、部分的には、サポートされています。回転するディスク共焦点顕微鏡は、NIH-NCRR賞（1S10RR027957）で購入されました。

A.細胞の調製<ol><li>正常ヒト初代線維芽細胞（GM02270）はコーリエル医学セルリポジトリ、カムデン、ニュージャージー州から得られた、およびhTERT 6により不死化された。細胞はCellStarで増殖し、増殖させた20％ウシ胎児血清（GIBCO）、non-essential/essentialアミノ酸、ビタミン、ピルビン酸ナトリウム、およびペニシリン/ストレプトマイシン（ハイクローンを補充したMEMから成るメディ?...

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	<li>Botuyan, M. V., Lee, J., Ward, I. M., Kim, J. E., Thompson, J. R., Chen, J., Mer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+the+methylation+state-specific+recognition+of+histone+H4-K20+by+53BP1+and+Crb2+in+DNA+repair.">Structural basis for the methylation state-specific recognition of histone H4-K20 by 53BP1 and Crb2 in DNA repair.</a> Cell. 127, 1361-1373 (2006).</li><li>Dimitrova, N., Chen, Y. C., Spector, D. L., de Lange, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=53BP1+promotes+non-homologous+end+joining+of+telomeres+by+increasing+chromatin+mobility.">53BP1 promotes non-homologous end joining of telomeres by increasing chromatin mobility.</a> Nature. 456, 524-528 (2008).</li><li>Feuerhahn, S., Egly, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+to+study+DNA+repair:+what's+in+the+box.">Tools to study DNA repair: what's in the box.</a> Trends Genet. 24, 467-474 (2008).</li><li>Giunta, S., Belotserkovskaya, R., Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+signaling+in+response+to+double-strand+breaks+during+mitosis.">DNA damage signaling in response to double-strand breaks during mitosis.</a> J. Cell Biol. 190, 197-207 (2010).</li><li>Giunta, S., Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Give+me+a+break,+but+not+in+mitosis:+the+mitotic+DNA+damage+response+marks+DNA+double-strand+breaks+with+early+signaling+events.">Give me a break, but not in mitosis: the mitotic DNA damage response marks DNA double-strand breaks with early signaling events.</a> Cell Cycle. 10, 1215-1221 (2011).</li><li>Golding, S. E., Morgan, R. N., Adams, B. R., Hawkins, A. J., Povirk, L. F., Valerie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pro-survival+AKT+and+ERK+signaling+from+EGFR+and+mutant+EGFRvIII+enhances+DNA+double-strand+break+repair+in+human+glioma+cells.">Pro-survival AKT and ERK signaling from EGFR and mutant EGFRvIII enhances DNA double-strand break repair in human glioma cells.</a> Cancer Biol. Ther. 8, 730-738 (2009).</li><li>Huyen, Y., Zgheib, O., Ditullio, R. A., Gorgoulis, V. G., Zacharatos, P., Petty, T. J., Sheston, E. A., Mellert, H. S., Stavridi, E. S., Halazonetis, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methylated+lysine+79+of+histone+H3+targets+53BP1+to+DNA+double-strand+breaks.">Methylated lysine 79 of histone H3 targets 53BP1 to DNA double-strand breaks.</a> Nature. 432, 406-411 (2004).</li><li>Jackson, S. P., Bartek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DNA-damage+response+in+human+biology+and+disease.">The DNA-damage response in human biology and disease.</a> Nature. 461, 1071-1078 (2009).</li><li>Kanda, T., Sullivan, K. F., Wahl, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone-GFP+fusion+protein+enables+sensitive+analysis+of+chromosome+dynamics+in+living+mammalian+cells.">Histone-GFP fusion protein enables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammalian cells.</a> Curr. Biol. 8, 377-385 (1998).</li><li>Massignani, M., Canton, I., Sun, T., Hearnden, V., Macneil, S., Blanazs, A., Armes, S. P., Lewis, A., Battaglia, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+fluorescence+imaging+of+live+cells+by+effective+cytosolic+delivery+of+probes.">Enhanced fluorescence imaging of live cells by effective cytosolic delivery of probes.</a> PLoS One. 5, e10459 (2010).</li><li>Nakamura, K., Sakai, W., Kawamoto, T., Bree, R. T., Lowndes, N. F., Takeda, S., Taniguchi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+vertebrate+53BP1:+a+major+role+in+non-homologous+end+joining+of+DNA+double+strand+breaks.">Genetic dissection of vertebrate 53BP1: a major role in non-homologous end joining of DNA double strand breaks.</a> DNA Repair (Amst). 5, 741-749 (2006).</li><li>Schultz, L. B., Chehab, N. H., Malikzay, A., Halazonetis, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+binding+protein+1+(53BP1)+is+an+early+participant+in+the+cellular+response+to+DNA+double-strand+breaks.">p53 binding protein 1 (53BP1) is an early participant in the cellular response to DNA double-strand breaks.</a> J. Cell. Biol. 151, 1381-1390 (2000).</li><li>Valerie, K., Povirk, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+mechanisms+of+mammalian+double-strand+break+repair.">Regulation and mechanisms of mammalian double-strand break repair.</a> Oncogene. 22, 5792-5812 (2003).</li><li>Wang, B., Matsuoka, S., Carpenter, P. B., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=53BP1,+a+mediator+of+the+DNA+damage+checkpoint.">53BP1, a mediator of the DNA damage checkpoint.</a> Science. 298, 1435-1438 (2002).</li><li>Ward, I. M., Minn, K., Jorda, K. G., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accumulation+of+checkpoint+protein+53BP1+at+DNA+breaks+involves+its+binding+to+phosphorylated+histone+H2AX.">Accumulation of checkpoint protein 53BP1 at DNA breaks involves its binding to phosphorylated histone H2AX.</a> J. Biol. Chem. 278, 19579-19582 (2003).</li></ol>

ゲノムの完全性の維持は、細胞の生存にとって極めて重要である。早期老化、発癌、または死亡の8ゲノムの結果を保持するために失敗しました。目利きに強い関心がありますどのように基礎および臨床研究の両方に重要な役割を果たすから生じるDDR機能、。多くの技術は、細胞がDNA損傷を検出し、修復方法の研究を支援するために長年にわたって開発されてきた。最近の技術の進歩?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 製品 </td><td> 会社 </td></tr><tr><td> CellStar培養皿</td><td>グライナーバイオ1 </td></tr><tr><td> FluroDishガラスボトムディッシュ</td><td>世界の精密機器株式会社</td></tr><tr><td> MEM培地</td><td> GIBCO </td></tr><tr><td>非必須アミノ酸</td><td> GIBCO </td></tr><tr><td>アミノ酸</td><td> GIBCO </td></tr><tr><td>ビタミン</td><td> GIBCO </td></tr><tr><td>ピルビン酸ナトリウム</td><td>インビトロジェン</td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td> Hyclone社</td></tr><tr><td>ウシ胎仔血清</td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> N-MYC 53BP1 WT PLPC-Puroの; プラスミド19836 </td><td> Addgene </td></tr><tr><td> pCLNR-H2BG;プラスミド17735 </td><td> Addgene </td></tr><tr><td>スーパーフェクト</td><td>キアゲン</td></tr><tr><td>ツァイスセルオブザーバーのSDイメージングシステム</td><td>ツァイス</td></tr><tr><td> AxioVisionの（リリース4.8.2） </td><td>ツァイス</td></tr><tr><td>ツァイスImmersol Wオイル</td><td>ツァイス</td></tr><tr><td> Volocityソフトウェア（バージョン6.0） </td><td>パーキンエルマー</td></tr></tbody></table>

two- and three-dimensional live cell imaging of dna damage response proteins

二本鎖切断（DSB）は、最も有害なDNAが細胞に発生する可能性病変である。未修復のままにしておくと、DSBは港の大きな可能性は、突然変異と染色体異常を生成するには1。 DSBを検出する細胞は、DNA損傷応答（DDR）を活性化し、DNAを修復するためにゲノム不安定性を触媒から外傷を防止するために、それは非常に重要です。刺激された時、DDRは修理が行われるか、細胞がアポトーシスを受けるように強制することを可能にするために、細胞周期の停止を誘発することによりゲノムの完全性を維持するために動作します。 DSB修復の主なメカニズムは、非相同末端結合（NHEJ）と相同組換え修復（HRR）（2件）を介して行われます。その活動が適切に機能するためにDDRのために正確に画策しなければならない多くのタンパク質があります。ここで、我々は2のための方法を記述する - そしてこれらのタンパク質の1の3次元（D）の可視化、53BP1。 p53結合タンパク質1（53BP1）は、の領域に局在する5-15分5内の病巣を形成し、修正されたヒストン3,4に結合することによりDSBは。 DSB部位に53BP1と他のDDRタンパク質のヒストン修飾とリクルートは、損傷の領域の周りクロマチンの構造的再編成を促進し、DNA修復6に寄与すると考えられている。修理の直接参加以外にも、追加の役割は、このようなイントラSチェックポイント、G2 / Mチェックポイント、および活性化下流のDDRタンパク質7-9規制として、DDRで53BP1のために記載されている。最近では、53BP1代わりにDSBが6の近傍に局在する前にG1を入力するセルを待って、有糸分裂時に誘発されるDNA損傷に応答して病巣を形成していないことが発見されました。そのような53BP1などのDDRタンパク質は細胞分裂から10までの進行の間に分裂構造（原体など）に関連付けることが見出されている。 視覚化すると3-Dライブセルイメージング - このプロトコルでは、我々は2の使用を記述するDNA損傷剤カンプトテシン（CPT）と同様に、有糸分裂時の53BP1の行動に応じて53BP1フォーカスの形成。カンプトテシンは主としてDNA複製の間にDSBを引き起こすトポイソメラーゼI阻害剤である。これを達成するために、我々は前述の53BP1-mCherry蛍光融合タンパク質はDSBは11に結合することができる53BP1タンパク質ドメインからなる構築に使用。また、ヒストンH2B-GFP蛍光融合タンパク質が有糸分裂中に12細胞周期全体が、特にクロマチンダイナミクスを監視することができる構築するために使用。複数のディメンションでライブセルイメージングは​​、真核細胞におけるDDRタンパク質の機能の理解を深めるための優れたツールです。

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Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins

このプロトコルは、DNA損傷だけでなく、有糸分裂時にその局在化に応答して活性化されたDNA二重鎖切断シグナル伝達タンパク質を可視化するための方法を説明します。

DNA損傷応答タンパク質の2次元および3次元生細胞イメージング

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate ...

Research

JoVE Journal

Biology

Microfabrication of Chip-sized Scaffolds for Three-dimensional Cell cultivation

三次元細胞培養用チップサイズの足場の微細加工

Using microfabrication technologies is a prerequisite to create scaffolds of reproducible geometry and constant quality for three-dimensional cell ...

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

ライブゼブラフィッシュの胚における二光子軸索切断とタイムラプス共焦点イメージング

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

のライブイメージングキイロショウジョウバエ胚性血球移行

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

イメージングのミスマッチ修復とのDNA損傷に対する細胞応答枯草菌</em

Both prokaryotes and eukaryotes respond to DNA damage through a complex set of physiological changes. Alterations in gene expression, the redistribution ...

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

COS - 7の蛍光標識は、生細胞イメージングのためにSNAP - Tag融合タンパク質を発現する

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

ライブゼブラフィッシュ胚における二光子ベースの光活性化

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

でGFP標識タンパク質のイメージングを生きる<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;卵母細胞

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

マウス胎児腸全体培養システム<em&gt;生体外</em&gt;シグナル伝達経路の操作と絨毛開発の3次元ライブイメージング

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over ...

FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels

三次元ハイドロゲルでイメージングをFRET

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly ...

Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

裏打ちクリア: 組織の脂肪組織の三次元イメージング法をクリア

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...